各种PCR介绍
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巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应 (PCR)，使用两对（而非一对）PCR引 物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩 增片段和普通PCR相似。第二对引物称 为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩 增片段的内部）结合在第一次PCR产物 内部，使得第二次PCR扩增片断短于第 一次扩增。巢式PCR的好处在于，如果 第一次扩增产生了错误片断，则第二次 能在错误片段上进行引物配对并扩增的 概率极低。因此，巢式PCR的扩增非常 特异 。
巢式PCR，可以在106基因组背景下检 测到一个拷贝的病毒基因，所以特异性 很好，但也是最容易污染的PCR。
谢谢
• 降落PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个 循环黏合温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环 的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结 合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。 这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对 非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增 对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏 合温度的工作。
• 利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接 已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA 进行分子克隆，建立全长的DNA探针。
1. 用一种在靶序列上没有 切点的限制性内切酶 消化 大分子量的DNA 2. 产生的大小不同的线性 DNA片段群体，其中具靶DNA 区段的DNA分子长度不超过 2-3Kb,经连接后环化成环状 分子
3. 按靶序列设计的一对向 外引物同靶序列5，--端互补 序列退火结合，其延伸方向 如图中箭头所指
4. 经PCR扩增产生的主要是 线性双链DNA分子，它是由 左侧的序列和右侧序列首位 连接而成，其接点就是限制 酶的识别位点
不对称PCR（ asymmetric PCR ）：用于
制备单链DNA
PCR扩增所用的两条引物中，浓度受限制的只 及高浓度的1%（或2%）。 经过PCR循环直到限 制引物耗尽之前，扩增的引物是双链的DNA序 列。而后，反应混合物中的另一种高浓度的引 物，则利用限制引物合成的DNA链做模板，继 续引导DNA合成。
PCR 产物的检测- 琼脂糖凝胶电泳
PCR 产物
PCR 产物
PCR 技术的应用
1. 基础研究
(1) 基因或 cDNA 克隆：从基因数据库中获得某一基因或 cDNA 的核 苷酸序列，用 PCR 方法扩增并克隆该基因或 cDNA。
(2) 基因表达：用 RT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。
2. 医学
下游引物 • 特异性引物 • Oligo(dT)
一步法 RT-PCR RT 反应与 PCR 反应在
同一个试管中进行。
两步法 RT-PCR RT 反应与 PCR 反应在
不同的试管中进行。
降落PCR（ Touchdown PCR ）
用来避免非特异性序列的扩增
• PCR中引物的黏合温度(annealing temperature)决定了 黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能 实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性 产物。因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度。
实时荧光定量PCR技术
实现了PCR从定性到定量的飞跃
实时荧光定量PCR原理
• 指在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定 量分析的方法。
• 特异性更强、 有效解决PCR污染、 自动化程度高、 实时监测反应过程
Ct 值的定义
• 在荧光定量PCR技术中重要概念 —— Ct值 • C代表Cycle，t代表threshold，Ct值：每个反应
多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检 测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因 的分型鉴定。
梯度PCR（Gradient PCR）
• 是指我们在摸PCR条件的时候采取的一 种手段，因为不能确认引物的最佳退火 温度，会采用梯度PCR，同时在不改变 其他PCR条件的情况下，对目的基因使 用不同的退火温度，最终找到一个适合 目的基因的退火温度。在这里，每个 PCR反应管只有一个退火温度。
反应分三步：
1 变性 denaturation：
加热90-95℃，模板DNA双链解离形成单链
DNA； 2 退火 annealling：
温度突然降低,引物与模板DNA结合, 40-60℃,Tm值{4（G+C）+2（A+T）}-5℃.
3 延伸 extension：
TaqDNA聚合酶以4dNTP为底物，在Mg2+ 存在 的条件下，催化DNA合成。
PCR特异性取决于引物和模板DNA结合特异性。
体外(试管中)扩增特异DNA片段 短时间内即可将所需目的DNA片段扩增 至100万倍以上
PCR技术 特点 • 敏感度高、特异性强、产率高、
重复性好、操作简便、快速
PCR体系基本组成
• 模板DNA： （102-5）拷贝 • dNTP底物：20—200umol/L • 特异性引物： 0.1—0.5 umol/L • DNA聚合酶：Klenow T4 、 T7聚合酶
片段 • 降落PCR：用于PCR条件的优化，避免非特异性序列
的扩增 • 实时定量 PCR (Real Time Quantitative PCR, qRT-
PCR) • 巢式PCR：使用两对（而非一对）PCR引物扩增完
整的片段
反转录 PCR (RT-PCR)
RT-PCR 将以 RNA 为模板的 cDNA 合成同 PCR 结合在一起，提 供了一种分析基因表达的快速灵敏的 方法。
(1) 感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核分枝杆菌、乙肝病毒等。 (2) 遗传病相关基因的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。 (3) 恶性肿瘤的诊断
3. 基因动、植物的检测
(1) 转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。 (2) 转基因植物的检测：玉米、大豆等。
PCR新技术
• RT-PCR：用于RNA分析 • 梯度PCR：可用于找出最适合的退火温度 • 反向PCR：可对未知序列扩增后进行分析 • 不对称PCR：用于制备单链DNA • 多重PCR：加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸
反向PCR (Inverse PCR, IPCR)
• 扩增引物相反方向DNA 序列的技术。用反向的互补引 物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩 增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已 知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶 切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接， 再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引 物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.
聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction)
根据细胞分裂中 DNA 半保留复制 机理，在体外快速扩增某一特定 DNA 片段的方法。
PCR工作原理
• 以要扩增的DNA分子为模板， • 以一对与模板5`末端和3`末端互补的寡核甘
酸片段为引物 • 4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下 • 依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。
mRNA 5’
1st cDNA 3’
5' 3'
5’ 3’
特异 PCR 产物
5’ 3’
AA 3’
3’
5’
逆转录酶、下游引物、dNTPs
5’
Taq DNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs
3’ 5’
经 30 个循环，产生 230 个分子拷贝
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
管内的荧光信号到达设定域值时所经历循环数
Ct值与起始模板的关系
• 每个模板Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数标准 品作标准曲线，横坐标起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct 值。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算 出该样品起始拷贝数。
巢式PCR（Nested PCR ）
这样模板链继续再循环，由高浓度的引 物合成的DNA要比限制引物多得多，而且 仍保持单链状态。
多重PCR
一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生 一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴 定.多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物 PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里 加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段 的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过 程与一般PCR相同。
TaqDNA聚合酶:耐热稳定性、5`-3`聚合酶活性及3`-5` 外切酶活性，可校正PCR反应中某些单核甘酸的错配。
• 含Mg2+的缓冲液：
Mg2+ 能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为 1.5—2.0mmol/L，过量将增加非特异性条带的产生。
循环次数取决于模板DNA的浓度30次—扩增100万倍
70-75℃时间---要扩增片段长度决定
PCR 反应条件的设定
待扩增片段：1000 bp 引物 Tm ＝ 55℃
DNA 模板变性: 94℃, 5分钟;
PCR 循环 (30 次): 94℃, 30秒; 50℃, 45秒; 72℃, 1分钟;
最终延伸:
72℃, 10分钟
PCR产物的检测
• 琼脂糖凝胶电泳； • 分子杂交； • 限制性内切酶酶切分析； • 微孔板夹心杂交法； • 直接测序
巢式PCR，可以在106基因组背景下检 测到一个拷贝的病毒基因，所以特异性 很好，但也是最容易污染的PCR。
谢谢
• 降落PCR开始先设定一个比较高的黏合温度，每个 循环黏合温度下降1℃，到一个较低温度以后每个循环 的黏合温度保持不变直到结束。在刚下降到特异性结 合可以进行的最高温度时，可以达到最高的特异性。 这样在起初的几个循环中，特异性扩增序列可以相对 非特异性序列多扩增若干倍，从而减轻非特异性扩增 对结果的干扰。这种方法可用于省去多次试验最佳黏 合温度的工作。
• 利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接 已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA 进行分子克隆，建立全长的DNA探针。
1. 用一种在靶序列上没有 切点的限制性内切酶 消化 大分子量的DNA 2. 产生的大小不同的线性 DNA片段群体，其中具靶DNA 区段的DNA分子长度不超过 2-3Kb,经连接后环化成环状 分子
3. 按靶序列设计的一对向 外引物同靶序列5，--端互补 序列退火结合，其延伸方向 如图中箭头所指
4. 经PCR扩增产生的主要是 线性双链DNA分子，它是由 左侧的序列和右侧序列首位 连接而成，其接点就是限制 酶的识别位点
不对称PCR（ asymmetric PCR ）：用于
制备单链DNA
PCR扩增所用的两条引物中，浓度受限制的只 及高浓度的1%（或2%）。 经过PCR循环直到限 制引物耗尽之前，扩增的引物是双链的DNA序 列。而后，反应混合物中的另一种高浓度的引 物，则利用限制引物合成的DNA链做模板，继 续引导DNA合成。
PCR 产物的检测- 琼脂糖凝胶电泳
PCR 产物
PCR 产物
PCR 技术的应用
1. 基础研究
(1) 基因或 cDNA 克隆：从基因数据库中获得某一基因或 cDNA 的核 苷酸序列，用 PCR 方法扩增并克隆该基因或 cDNA。
(2) 基因表达：用 RT-PCR检测某一特定基因在转录水平的表达。
2. 医学
下游引物 • 特异性引物 • Oligo(dT)
一步法 RT-PCR RT 反应与 PCR 反应在
同一个试管中进行。
两步法 RT-PCR RT 反应与 PCR 反应在
不同的试管中进行。
降落PCR（ Touchdown PCR ）
用来避免非特异性序列的扩增
• PCR中引物的黏合温度(annealing temperature)决定了 黏合的特异性，温度越高特异性越强，但过高则不能 实现引物和模板的结合，而过低会产生大量非特异性 产物。因此进行PCR时需要寻找合适的黏合温度。
实时荧光定量PCR技术
实现了PCR从定性到定量的飞跃
实时荧光定量PCR原理
• 指在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号积累实时监测整个PCR进程， 最后通过标准曲线对未知模板进行定 量分析的方法。
• 特异性更强、 有效解决PCR污染、 自动化程度高、 实时监测反应过程
Ct 值的定义
• 在荧光定量PCR技术中重要概念 —— Ct值 • C代表Cycle，t代表threshold，Ct值：每个反应
多重PCR的主要用于多种病原微生物的同时检 测或鉴定和病原微生物，某些遗传病及癌基因 的分型鉴定。
梯度PCR（Gradient PCR）
• 是指我们在摸PCR条件的时候采取的一 种手段，因为不能确认引物的最佳退火 温度，会采用梯度PCR，同时在不改变 其他PCR条件的情况下，对目的基因使 用不同的退火温度，最终找到一个适合 目的基因的退火温度。在这里，每个 PCR反应管只有一个退火温度。
反应分三步：
1 变性 denaturation：
加热90-95℃，模板DNA双链解离形成单链
DNA； 2 退火 annealling：
温度突然降低,引物与模板DNA结合, 40-60℃,Tm值{4（G+C）+2（A+T）}-5℃.
3 延伸 extension：
TaqDNA聚合酶以4dNTP为底物，在Mg2+ 存在 的条件下，催化DNA合成。
PCR特异性取决于引物和模板DNA结合特异性。
体外(试管中)扩增特异DNA片段 短时间内即可将所需目的DNA片段扩增 至100万倍以上
PCR技术 特点 • 敏感度高、特异性强、产率高、
重复性好、操作简便、快速
PCR体系基本组成
• 模板DNA： （102-5）拷贝 • dNTP底物：20—200umol/L • 特异性引物： 0.1—0.5 umol/L • DNA聚合酶：Klenow T4 、 T7聚合酶
片段 • 降落PCR：用于PCR条件的优化，避免非特异性序列
的扩增 • 实时定量 PCR (Real Time Quantitative PCR, qRT-
PCR) • 巢式PCR：使用两对（而非一对）PCR引物扩增完
整的片段
反转录 PCR (RT-PCR)
RT-PCR 将以 RNA 为模板的 cDNA 合成同 PCR 结合在一起，提 供了一种分析基因表达的快速灵敏的 方法。
(1) 感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核分枝杆菌、乙肝病毒等。 (2) 遗传病相关基因的检测：镰刀型细胞贫血、血友病。 (3) 恶性肿瘤的诊断
3. 基因动、植物的检测
(1) 转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。 (2) 转基因植物的检测：玉米、大豆等。
PCR新技术
• RT-PCR：用于RNA分析 • 梯度PCR：可用于找出最适合的退火温度 • 反向PCR：可对未知序列扩增后进行分析 • 不对称PCR：用于制备单链DNA • 多重PCR：加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸
反向PCR (Inverse PCR, IPCR)
• 扩增引物相反方向DNA 序列的技术。用反向的互补引 物来扩增两引物以外的未知序列的片段，而常规PCR扩 增的是已知序列的两引物之间DNA片段.实验时选择已 知序列内部没有切点的限制性内切酶对该段DNA进行酶 切，然后用连接酶使带有粘性末端的靶序列环化连接， 再用一对反向的引物进行PCR，其扩增产物将含有两引 物外未知序列，从而对未知序进行分析研究.
聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction)
根据细胞分裂中 DNA 半保留复制 机理，在体外快速扩增某一特定 DNA 片段的方法。
PCR工作原理
• 以要扩增的DNA分子为模板， • 以一对与模板5`末端和3`末端互补的寡核甘
酸片段为引物 • 4种脱氧核糖核甘酸存在的条件下 • 依赖DNA聚合酶的酶促合成反应。
mRNA 5’
1st cDNA 3’
5' 3'
5’ 3’
特异 PCR 产物
5’ 3’
AA 3’
3’
5’
逆转录酶、下游引物、dNTPs
5’
Taq DNA聚合酶、上游及下游引物、dNTPs
3’ 5’
经 30 个循环，产生 230 个分子拷贝
3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’
管内的荧光信号到达设定域值时所经历循环数
Ct值与起始模板的关系
• 每个模板Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数标准 品作标准曲线，横坐标起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct 值。只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算 出该样品起始拷贝数。
巢式PCR（Nested PCR ）
这样模板链继续再循环，由高浓度的引 物合成的DNA要比限制引物多得多，而且 仍保持单链状态。
多重PCR
一般PCR仅应用一对引物，通过PCR扩增产生 一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴 定.多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物 PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里 加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段 的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过 程与一般PCR相同。
TaqDNA聚合酶:耐热稳定性、5`-3`聚合酶活性及3`-5` 外切酶活性，可校正PCR反应中某些单核甘酸的错配。
• 含Mg2+的缓冲液：
Mg2+ 能影响反应特异性和扩增片段的产率，一般为 1.5—2.0mmol/L，过量将增加非特异性条带的产生。
循环次数取决于模板DNA的浓度30次—扩增100万倍
70-75℃时间---要扩增片段长度决定
PCR 反应条件的设定
待扩增片段：1000 bp 引物 Tm ＝ 55℃
DNA 模板变性: 94℃, 5分钟;
PCR 循环 (30 次): 94℃, 30秒; 50℃, 45秒; 72℃, 1分钟;
最终延伸:
72℃, 10分钟
PCR产物的检测
• 琼脂糖凝胶电泳； • 分子杂交； • 限制性内切酶酶切分析； • 微孔板夹心杂交法； • 直接测序