川芎嗪对大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响

川芎嗪对大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡
的影响
【摘要】目的探讨川芎嗪对大鼠心肌缺血再灌注损伤时细胞凋亡的影响及可能的机制。

方法雄性SD大鼠36只随机分三组：假手术组、模型组、川芎嗪治疗组，每组12只。

用结扎大鼠左冠状动脉前降支法制备心肌缺血再灌注模型，测定再灌注前静脉注入川芎嗪对损伤大鼠心肌组织中MDA,SOD生成的影响；免疫组化法检测大鼠心肌细胞Bcl-2、Bax基因表达。

结果①川芎嗪组能减少心肌组织中MDA 生成，并明显提高缺血再灌注组织中SOD的活力；②川芎嗪组中bcl-2表达明显增多，平均灰度值明显下降，与模型组比较有显著差异（P>0.01），bax表达下降，但无统计学意义（P>0.05）。

结论川芎嗪可能通过拮抗氧自由基、上调凋亡抑制基因bcl-2等作用，对心肌缺血再灌注损伤时细胞凋亡有一定的防治作用。

【关键词】川芎嗪；缺血再灌注损伤；自由基；心肌细胞凋亡
近年来，研究发现细胞凋亡(apoptosis)是急性心肌缺血再灌注过程中心肌细胞死亡的重要机制之一，因此深入研究急性心肌缺血再灌注时心肌细胞的凋亡及其防治有着十分重要的意义［1］。

细胞凋亡的发生、发展可能与自由基损伤、中性粒细胞聚集、钙稳态失衡及内皮功能紊乱等有关，并且受多种基因调控，川芎嗪具有多种心血管保护作用，近年被广泛应用于心脑血管疾病，但其在心肌缺血再灌注损伤时心肌细胞凋亡中的作用则少见报道，现对此做一初步研究。

1 材料和方法
1．1 实验动物健康雄性SD大鼠36只,体重222~242 g左右。

购自中国医科大学实验动物中心。

随机分为三组：假手术组、模型组及川芎嗪治疗组，每组12只。

1．2 主要仪器及试剂病理图象分析仪（同济影响公司HJP-1000）；川芎嗪注射液由安徽省立药业有限公司新特药分公司生产（每支2 ml，相当于原生药40 mg）；免疫组化染色试剂盒（购自武汉博士得生物工程有限公司）。

1．3 心肌缺血再灌注损伤模型的建立各组动物术前禁食24 h，20%乌拉坦（1 g/kg）腹腔麻醉，气管插管，连呼吸机，机械通气；描记肢导心电图；胸骨左缘2 mm处开胸，剪开心包，暴露冠脉，在左前降支起点后0.5 cm穿一丝线，垫一硅胶管，血压稳定时结扎，关闭胸腔。

45 min后经尾静脉注入治疗药物及溶液，川芎嗪治疗组按50 mg/kg（按人和动物体重比例计算，为临床剂量的5倍）的剂量给药，用生理盐水稀释到2.0 ml，再灌注前静脉注入，其余两组以等量生理盐水注入。

之后打开胸腔，剪去结扎线，假手术组置线后不予结扎，冠脉断流及再通与否依心电图ST段抬高及恢复为准。

再灌注1 h后，取部分左室心肌立即放入中性福尔马林溶液中固定12~20 h后送病理室，制成蜡块标本，连续切片，其中5张严格按免疫组化方法进行染色，DAB显色，光镜下观察bcl-2、bax的表达情况；再取部分左室标本放入储存管中，移入-70℃冰箱中留做SOD、MDA的检测。

1．4检测指标
1．4．1 心肌组织中SOD、MDA含量的测定
制作心肌组织匀浆，将10%的匀浆用低温低速离心机3000 r/min左右离心10 min，留上清，然后按试剂盒要求测定SOD、MDA 含量。

1．4．2 bcl-2、bax的表达用免疫组化方法分析，切片厚4 μm，常规脱蜡水化，一抗为兔抗大鼠Bax或Bcl-2单克隆抗体(1：50稀释)，二抗为生物素化羊抗兔IgG(1：100稀释)，以PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色，光镜观察阳性信号。

胞质染成棕黄色的为阳性细胞。

病理图文彩色分析仪进行半定量分析，高倍镜下（×400）下每组选取10个视野，对视野内免疫组化阳性信号进行图象分析计算平均灰度值，以相应的均值分别代表每张标本染色的深浅，最后以每组均值进行比较。

平均灰度值与bcl-2、bax的阳性表达程度成反变关系。

1．5 实验数据计算及统计学分析采用SPSS 12.0统计软件，所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析与q 检验,以P<0.05为差异有显著性。

2 结果
2.1 心肌组织中SOD、MDA含量的测定
如表1所示，模型组MDA含量明显高于假手术组，SOD的活力显著降低，与假手术组比较有显著差异(P>0.01)。

与模型组比较，川芎嗪治疗组能减少心肌中MDA的生成，有统计学意义（P>0.05）；能明显提高再灌注组织中SOD的活力，差异非常显著(P>0.01)。

2.2 各组大鼠心肌组织bax和bcl-2基因蛋白表达及图像分析。