先天性心脏病突变体小鼠模型的建立

2021 年 3 月第 44 卷 第 2 期湖南师范大学自然科学学报
Journal of Natural Science of Hunan Normal University Vol.44 No.2Mar., 2021
DOI ： 10T612/j4ssnT096T281.2021.02.007
先天性心脏病突变体小鼠模型的建立
尹梓豪a ,孙一兵a ,向寿莲a ，张健a ，丁小凤a ,李立民b *
*收稿日期：2020-09-10
基金项目:国家自然科学基金项目(81872256);湖南省教育厅重点项目(19A310)
* 通信作者，E-mail : cityulilimin@ hotmail. com
(湖南师范大学a 生命科学学院；b.工程设计学院，中国长沙410081)
摘 要 为研究AP-2%在发育过程中的特定调控作用，利用AP-2a-LacZ 转基因小鼠FX18研究AP-2%与先天 性心脏病的相关性。

在FX18小鼠繁殖过程中，发现该小鼠稳定遗传的突变体,鉴定其基因型，测量体质量与心脏 质量,HE 染色和心电图观察其表型和检测心脏功能。

研究结果表明：突变体小鼠在出生后4周左右即死亡，且在 胚胎期就表现出明显的发育迟缓，出生后的体质量和心脏质量均仅为正常FX18小鼠的40%~60%，同时,HE 染色 和心电图检测结果显示，小鼠表现出较明显的左心室肥大和室性早搏，符合先天性心脏病中动脉导管未闭的特征。

因此，成功发现和建立的该突变体小鼠可作为一个较好的研究先天性心脏病小鼠模型。

关键词 转基因小鼠FX18；AP-2a ；突变体小鼠;先天性心脏病
中图分类号 R541.1；R-332 文献标识码 A 文章编号 2096-5281( 2021) 02-0048-06Generetion ot Congenital Heart Disease Mutant Mouse Model
YIN Zi-Uao"，SUN Yi-bing"，XIANG Shou-Uan"，ZHANG Ji.an a ，DING Xiao-feng"，LI Li-min *(a.CoXege of Life Sciences ； b. College of Engineering and Design ，Hunan Normal University ，Changsha 410081，China )Abstract To study t he speciPc regulatore role of AP-2% duing development ，AP-2%-CacZ transoenic mica FX18 were obtained to investigate the cafelation between AP-2% and congenital heai disease. Duing the reproduc ­tion of FX18 mica , stable genetic mutants were found. FX18 mica were genotyped. Mouse body weight and heart weight were measured - Their phenotypes were observed by HE staining , and electrocardioaram was performed to ex ­amine the heai function. Our results revealed that mutant mica died about 4 weeks after birth and showed signifi ­cant developmental retardation at the embryonic stage. Both postnatal body weight and heai weight of mutant mica were only 40%—60% of normal FX18 mice. At the same 1—, the results of HE staining and electrocardioaram indicated that the mica had obvious left vvntPcular hypeirophy and vvntPcular premature beat , which were char- acteistics of patent ductus aieiosus in congenital heart disease. Therefore , in this work , we successfully inenp- fied and established this mutant mouse , which could serve as a better model for studying congenital heart disease on moce.
Key wordt FX18 transeenic mica ； AP-2%； mutant mica ； congenpal heart disease
先天性心脏病(congenital heart disease , CHD)是小儿最常见的心脏病，多出现因胚胎发育早期心脏及 大血管的形成障碍引起的局部结构异常，或出生后心脏应自动关闭的通道未能闭合。

先天性心脏病通常根 据左右两侧及大血管之间的分流情况分为左向右分流型(潜伏青紫型，主要类型有室间隔缺损VSD 、房间隔 缺损ASD 和动脉导管未闭PDA )、右向左分流型(青紫型，主要类型为法洛四联症TOF 和完全性大动脉转位
第2期尹梓豪等:先天性心脏病突变体小鼠模型的建立49
TGA）、无分流型（无青紫型，主要类型为肺动脉狭窄PS）三大类［1］，是具有严重危害的先天畸形，且可有两种以上畸形并存。

先天性心脏病的相关影响因素比较复杂，目前尚未完全明确其确切的病因，但大多数研究认为先天性心脏病是由遗传［2］与环境因素⑶共同作用而引起的,其中遗传因素包括基因异常和染色体异常等［4,5］o在母亲妊娠的早期尤为关键，其中孕期营养不足、妊娠早期服用药物或者妊娠早期病毒感染等⑷因素都可能会造成小儿先天性心脏病。

AP-2家族包括AP-2%,AP-20,AP-2）,AP-2d和AP-2v,是一类分子量为52000的转录因子，有其独特的蛋白质结构，其N端是富含脯氨酸和谷氨酸的转录激活域，中间是DNA结合结构域,C端的helo span helio结构可以形成二聚体［7,8］O AP-2基因家族在脊椎动物的胚胎发育过程中起重要的调控作用［9］，有研究表明Tfap2a在发育的小鼠胚胎中显著表达［10］，缺乏转录因子Tfap2a的小鼠胚胎可以存活下来，但Tfap2a基因缺失的小鼠可能存在神经管、肢体间充质细胞、颅面部发育障碍,严重时使小鼠在围产期由于无脑畸形、心脏形态异常且发育迟缓、脏器缺陷、体壁缺乏等严重畸形而死亡［11,12］,体现了AP-2%在胚胎发育中的重要作用。

笔者在利用基因打靶构建的AP-2%QacZ转基因小鼠FX18［13］的基础上，继续繁殖该小鼠，偶然发现了该转基因小鼠的一种突变体，此小鼠突变体心脏发育异常，为研究提供了一种先天性心脏病小鼠模型。

1材料与方法
1.1材料
FX18小鼠由实验室构建，琼脂糖购于Invitrogen公司。

DNA上样缓冲液，DNA Marker购于Thermo公司；二甲苯，多聚甲醛,20xPBS，漠化乙锭,Tween-20,EDTA,SDS,NaCl,NaOH及蛋白酶K等均购于上海生工公司;其它常规试剂均为国产分析纯。

心电图仪单导程全自动ECG-11A型购自广东东江电子仪器厂，频响范围为0~90H z,纸速为50mm-s-1，自制针状电极。

恒温烘箱购自上海精宏实验设备有限公司。

病理切片机RM2016购自上海！卡仪器有限公司。

1.2方法
1.2.1小鼠的饲养与繁殖将已构建的FX18小鼠置于SPF级动物房饲养，鼠房内温度控制在18-26U,光照控制为12/12,饲养笼盒、饮水瓶、垫料、各种实验用具和衣服采用高压蒸汽灭菌器消毒，小鼠饲料采取紫外消毒，进入动物房内的实验物品通过紫外消毒经传递窗单向传入。

将雄性小鼠和雌性小鼠以1：2的比例进行交配繁殖。

所有实验经过湖南师范大学动物伦理委员会许可。

1.2.2转基因小鼠的鉴定将通过基因打靶和显微注射已经建立的FX18转基因小鼠,生长至3周,剪取约0.5cm小鼠尾巴，提取基因组DNA,提取后的基因组DNA使用正向引物LacZ-F1（5'-TACAACGTCGTGACT-GGGAA-3'）和反向引物LacZ-R1（5'-CCAGATAACTGCCGTCACTC-3'）进行PCR扩增，PCR条件为预变性94u,1min20S,再经94u45s,60°C45s,72U2mi,32个循环;然后72°C延伸10min。

最后得到PCR 产物片段大小为562bp。

123小鼠胚胎与心脏的包埋、切片和HE染色包埋切片:分别取一窝E13.5小鼠整个胚胎和4周龄小鼠的整个心脏，置于预先配好的固定液（4%多聚甲醛）中于4U下固定24h。

将组织块放入烧杯中，流水冲洗24h,不要让组织块沉积在烧杯底部。

按50%乙醇1h,70%乙醇2h,80%乙醇2h,95%乙醇2h,95%乙醇2 h,无水乙醇2h,无水乙醇2h对组织块进行梯度脱水。

将组织块转入无水乙醇与二甲苯等体积混合的溶液中处理30min,再将组织块浸泡在二甲苯中30min,使组织块透明。

融化石蜡，置于60U烘箱。

配置二甲苯与石蜡等体积混合液，处理组织块30min,将处理后的组织块放入融化后的石蜡进行包埋。

使用切片机对包埋后的组织块进行切片。

HE染色:依次将切片放入二甲苯15min两次，无水乙醇5min两次,85%酒精5min,75%酒精5min,蒸馏水洗，放入苏木精水溶液中染色5min后,依次入1%盐酸乙醇30s,流水冲洗30s,蒸馏水冲洗5s。

置于0.5%酒精伊红染色液染色1~3min,蒸馏水洗30s,75%酒精5min,85%酒精5min,无水乙醇5min两次，再经二甲苯15min两次使切片透明。

将已透明的切片滴上加拿大树胶（国药集团化学试剂有限公司），盖上盖玻片封片固定。

50湖南师范大学自然科学学报第44卷
1.2.4小鼠心电图的检测使用4%的水合氯醛按04mL/10g体质量的剂量麻醉3~4周龄小鼠，电极连线分为红色（R）右上肢、黄色（L）左上肢、黑色（RF）右下肢、绿色（LF）左下肢，将针电极分别刺入其四肢皮下,记录标准导联和单极加压肢体导联的心电图。

1-2.5数据统计与分析采用Graph Pad Pvsm7软件，计量资料用"土s表示。

两组间比较采用t检验。

%< 0.05为有差异统计学意义。

2结果
2.1FX18突变体小鼠体质量和心脏质量明显减少，且在4周龄左右死亡
为了研究AP-2%在发育过程中特定的调控作用，笔者通过基因打靶和显微注射获得了FX18转基因小鼠,并提取3周龄小鼠尾巴基因组，使用PCR鉴定,获得了562bp的LacZ条带,证明该转基因小鼠构建成功（图1a）[13]o在FX18小鼠繁殖过程中发现了
FX18小鼠的突变体，与正常小鼠相比，FX18
突变体小鼠明显发育迟缓，非常瘦小,体型较同胎的正常或杂合子小鼠偏小40%~60%,并在4周龄左右时死亡,而正常小鼠和FX18杂合子小鼠外形和大小无差别（图1b）。

突变体小鼠的体质量和心脏质量均为同胎出生的正常或杂合子FX18小鼠40%~60%（图1c,d）,这说明突变体小鼠的发育受到了严重的影响，而心脏质量的异常提示FX18突变体小鼠可能与心脏结构异常及功能障碍有关。

2.2FX18突变体小鼠E1
3.5胚胎发育异常
为了研究FX18突变体小鼠和杂合子小鼠的发育缺陷，将雌性FX18杂合子小鼠与雄性FX18杂合子小鼠按2：1的比例合笼，下午5点交配，第二天上午9点左右检查精栓，若发现阴栓则定为E0.5天,然后于E13.5天颈椎脱臼法处死孕鼠,剖腹暴露子宫，在体视显微镜下解剖，获取E13.5天的全部胚胎。

观察胚胎形态，发现2号胚胎较其它胚胎体型小，胚胎整体偏白色，结构模糊不清，发育滞后（图2a），该胚胎的尾椎不完全,并没有出现明显的手指分化，发育比正常胚胎延迟2天左右，心脏形态发育不明显。

3号和4号胚胎则表现为颅骨裂的严重神经管缺陷，头部异常形态,躯干大小缩小，心脏形态异常。

提取胚胎组织基因组DNA,证明2号胚胎的基因型为-/-,3号和4号胚胎的基因型为+/-,其余正常胚胎均为+/+。

这些结果提示FX18突变体小鼠在胚胎时期出现了发育落后、尾椎发育不全、手指分化不明显且体积偏小、心脏形态异常的现象。

AP-2a
genomic
9(FX18)20kb LacZ24kb
■561bp
3.5kb4kb
black boxes:exons
Gray boxes:5'and3'untranslated regions
20kb of g enomic sequences5'to the start site of human
AP-2alpha
24kb of g enomic DNA extending downstream from exon
five of h uman AP-2alplia
+/+or+/-
图1FX18转基因小鼠的构建和突变体小鼠的发现！a)FX18小鼠的构建策略)(b)亲本小鼠(空心箭头)与突变体小鼠(实心
箭头)体型图)(i正常小鼠与突变体小鼠的体质量比较)
(d)正常小鼠与突变体小鼠心脏质量的比较
Fig.1ConstmcZon cf FX18transoenic mice and disccverg V mutanf mice(a) ConstmcZon strategy cf FX18mice；(b)Figums cf Wild-type and mutanf
mice,parenf mice(hollow arrow)and muWnf mice(solid arrcv)；(c)
Weigh-comparison cf Wiiy-type and muWnf mice；(d)Cardiac weigh­
comparison cf Wild-Wpe and mutanf
mice
第2期尹梓豪等:先天性心脏病突变体小鼠模型的建立51
8 0005 0003 0002 000Ht:Heart Li: L iver In: I ntestine So:Somite
Mb:Midbrain
Hb:Hindbrain
Lu:L ung
图2 FX18突变型小鼠胚胎的观察和鉴定（a ）正常小鼠、杂合子小鼠与2号突变体小鼠胚胎的对比；（b ）正
常小鼠与FX18突变体小鼠的基因型鉴定
Fig. 2 Observation and identification of FX18 mutant mice embryos （ a ） Comparison of Wild-type and No. 2 mutant mouse embryC
os ； （ b ） Genotypic identification of Wild-type mice and FX18 mutant mice
2.3突变体小鼠室性早搏且伴有左心室肥厚
对3~4周龄的正常小鼠和突变体小鼠分别进行心电图检测，如图3所示,正常小鼠的心电图为窦性心 律,P 波波形aVR 导联为倒置,其余为直立。

QRS 波除aVR 主波向下，其余导联呈Qrs ,qR ,qRs ,Rs 和rS 等, 无明显ST 段。

P 波、QRS 波的时间、振幅等均与文献［14］中报道的类似。

与之对比，突变体小鼠（FX18--） 的心电图中,aVR 导联的P 波与QRS 主波出现了正置，且QRS 波群提前发生，宽大畸形，为完全性代偿间 歇，属于较典型的室性早搏，同时QRS 波群电压较正常小鼠有显著增高。

观察小鼠的心脏纵切片发现，突变 体小鼠的左心室肥厚，为正常小鼠厚度的3~4倍;横切片显示突变体小鼠的左心室室腔变小，约为正常小鼠 容积的1/4,提示突变体小鼠发生了先天性心脏疾病。

+/+(b)I _
Ml
Fig. 3 ( a) Electrocardiogram of Wild-type mice # ( b) Electroca^dioT a m of mutant mice, indicative abnormal waves ( box) , ( c) Heart sections
of WildCype mice , ( d) Heart sections cf mutant mice , ventPculci hypertrophy ( arrow) and ventPculci cavity ntrowing ( asterisk )
图3正常小鼠（a ,c ）和突变体小鼠（b ,d ）
的心电图及心脏切片
52湖南师范大学自然科学学报第44卷3讨论
先天性心脏病的最常见临床类型包括房室间隔缺损(AVSD)、大动脉易位(dTGA)、圆锥动脉干畸形(CTD)、法洛四联症!TOF)、动脉导管未闭(PDA)等，而这些常见的临床类型大多有相应的易感基因+15朋。

AP-2基因家族是人类发现的第一个与动脉导管未闭相关的遗传基因。

之前的研究表明，神经嵴细胞对心脑血管疾病的发生起了重要的作用,动脉导管未闭(PDA)可能是神经嵴细胞发育异常的结果,而该基因家族在神经外胚层衍生细胞的分化中也扮演着重要的角色,尤其是AP-20在胚胎发育的过程中与神经嵴细胞表达的位置一致，且该基因的突变以显性负调控机制的方式改变神经嵴细胞的迁移和分化+25]，进而可能在导管中产生异常，来诱发动脉导管未闭[26]'AP-20基因缺失也可能会导致内皮素-及Hif2a在动脉导管平滑肌水平表达缺失，影响平滑肌层组织的特异性发育，从而导致动脉导管未闭合。

同时,AP-20可以刺激某些影响神经嵴细胞发育的基因信号通路中断，从而在胚胎期导致最终会发育为动脉导管的第6主动脉弓发育异常+27]O因此,AP-20的突变或表达量降低可能影响了动脉导管未闭。

本研究构建的FX18转基因小鼠，是通过基因打靶构建的AP-2%报告基因小鼠，在繁殖过程中出现了突变体，可能由于基因打靶的非特异性引起某功能基因突变从而出现了异常小鼠表型。

笔者研究发现突变体小鼠的心脏有明显的左心室肥厚。

左心室肥厚是动脉导管未闭的症状之一，也是引发左心室流出道阻塞的危险因素之一+2讥有研究表明,AP-2%在胚胎发育和心脏发育中起重要作用,AP-2%可能通过参与咽下区神经嵴与周围组织的相互作用，促进正常心脏流出道形态发生。

AP-2%缺陷的小鼠胚胎中出现明显的心脏流出道发育畸形[29]，故突变体小鼠可能是AP-2%基因出现了错义突变。

由于AP-20在胚胎发育的过程中与神经嵴细胞表达的位置一致，对神经嵴细胞的迁移分化产生了影响+25]，并且突变小鼠的表型符合动脉导管未闭的特征，暗示该突变也可能影响了AP-2%与AP-20之间的异源二聚体相互作用。

该突变体小鼠的详细作用机理、可能的突变基因或者其它先天性心脏病易感基因之间的相互影响等尚有待进一步研究。

总之，笔者发现了一类突变体小鼠,该小鼠从胚胎阶段即出现了明显的发育滞后和心脏异常，其与先天性心脏病之间可能存在重要关联，其详细的调控机制还有待后续进行深入研究。

本研究也说明FX18转基因小鼠的突变体具有先天性心脏病研究小鼠模型的潜力。

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