地黄苷A_通过调节AKT

地黄苷A通过调节AKT/Nrf2/GPX4信号通路
介导的铁死亡改善大鼠心肌缺血再灌注损伤
刘盼,王晓英,韩丹
摘要目的:探讨地黄苷A(ReA)通过调节蛋白激酶B(AKT)/核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)信号通路介导的铁死亡对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)的影响㊂方法:将90只大鼠随机分为假手术组(Sham组)㊁模型组(Model 组)㊁ReA低剂量组(ReA-L组)㊁ReA高剂量组(ReA-H组)㊁铁死亡抑制剂ferrostatin-1(Fer-1)组(Fer-1组)及ReA高剂量+AKT抑制剂perifosine组(ReA-H+perifosine组),每组15只㊂ReA-L组㊁ReA-H组大鼠分别腹腔注射40㊁80mg/kg ReA,Fer-1组大鼠腹腔注射2mg/kg ferrostatin-1,ReA+perifosine组大鼠腹腔注射80mg/kg ReA及20mg/kg perifosine,Sham组和Model组大鼠腹腔注射等量生理盐水,每日1次,连续给药2周㊂除Sham组外,各组大鼠在末次给药1h后采用左冠状动脉前降支结扎法建立MI/RI大鼠模型㊂试剂盒检测血清心肌酶水平;氯代三苯基四氮唑(TTC)染色测定心肌梗死面积;苏木素-伊红(HE)染色观察心肌组织病理形态学变化;原位末端标记测定法(TUNEL)染色检测心肌细胞凋亡率;试剂盒测定心肌组织抗氧化能力;Fe2+含量检测试剂盒检测心肌组织Fe2+含量;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测AKT/Nrf2/GPX4信号通路相关蛋白表达㊂结果:与Sham组比较,Model组大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)㊁肌酸激酶同工酶(CK-MB)㊁心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平及心肌组织中丙二醛(MDA)和Fe2+含量上升,组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)㊁超氧化物歧化酶(SOD)活性及p-AKT/AKT㊁Nrf2和GPX4蛋白水平下降,转铁蛋白受体1 (TfR1)蛋白水平升高,心肌细胞凋亡率及心肌梗死面积增加,心肌组织损伤严重(P<0.05);与Model组相比,ReA-L组㊁ReA-H组㊁Fer-1组大鼠血清LDH㊁CK-MB和cTnI水平及心肌组织中MDA和Fe2+含量下降,组织中GSH-Px㊁SOD活性及p-AKT/AKT㊁Nrf2和GPX4蛋白水平升高,TfR1蛋白水平降低,心肌细胞凋亡率及心肌梗死面积减少,心肌组织损伤减轻(P<0.05);perifosine减弱了高剂量ReA对MI/RI大鼠铁死亡的抑制作用㊂结论:ReA可能通过激活AKT/Nrf2/GPX4信号通路,抑制铁死亡,改善MI/RI大鼠心肌组织损伤㊂
关键词地黄苷A;蛋白激酶B/核因子红细胞系2相关因子2/谷胱甘肽过氧化酶4;铁死亡;心肌缺血/再灌注损伤;实验研究
d o i:10.12102/j.i s s n.1672-1349.2023.22.009
Rehmannioside A Improves Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury in Rats by Regulating Ferroptosis Mediated by AKT/Nrf2/GPX4 Signaling Pathway
LIU Pan,WANG Xiaoying,HAN Dan
The First People's Hospital of Guangyuan,Guangyuan628000,Sichuan,China,E-mail:
Abstract Objective:To investigate the influence of rehmannioside A(ReA)on myocardial ischemia-reperfusion injury(MI/RI)in rats by regulating ferroptosis mediated by protein kinase B(AKT)/nuclear factor erythroid2-related factor2(Nrf2)/glutathione peroxidase4 (GPX4)signaling pathway.Methods:Ninety rats were randomly divided into sham operation group(sham group),model group,ReA low-dose group(ReA-L group),ReA high-dose group(ReA-H group),ferroptosis inhibition ferrostatin-1(Fer-1)group(Fer-1group),and ReA high-dose+AKT inhibitor perifosine group(ReA-H+perifosine group),with15rats in each group.The rats in ReA-L group and ReA-H group were injected intraperitoneally with40mg/kg and80mg/kg ReA,respectively.The rats in Fer-1group were intraperitoneally injected with2 mg/kg ferrostatin-1.The rats in ReA+perifosine group were intraperitoneally injected with80mg/kg ferrostatin-1and20mg/kg perifosine.The rats in sham group and model group were intraperitoneally injected with the same volume of normal saline,once a day, for2weeks.Except for the sham group,MI/RI rat models were established by ligation of the left anterior descending coronary artery1h after the last administration.The kit was applied to detect serum myocardial enzyme level.Triphenyltetrazolium chloride(TTC)staining was used to determine myocardial infarct size.Hematoxylin(HE)staining was applied to observe the pathological changes of myocardial tissue.Terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling(TUNEL)staining was applied to detect the apoptosis rate of cardiomyocytes.The kit was used to measure the antioxidant capacity of myocardial tissue.Fe2+content detection kit was applied to detect Fe2+content in myocardial tissue.Western Blot was applied to detect the expression of AKT/Nrf2/GPX4 signaling pathway related protein.Results:Compared with sham group,the serum levels of lactate dehydrogenase(LDH),creatine kinase isoenzyme MB(CK-MB)and cardiac troponin I(cTnI),the contents of malondialdehyde(MDA)and Fe2+in myocardial tissue were increased in model group,the activities of glutathione peroxidase(GSH-Px)and superoxide dismutase(SOD),and the levels of p-AKT/ AKT,Nrf2,and GPX4proteins in the tissue decreased,the level of transferrin receptor1(TfR1)protein increased,the apoptosis rate of myocardial cells and myocardial infarction area were increased,and myocardial tissue damage was serious(P<0.05).Compared with model group,the serum levels of LDH,CK-MB,and cTnI and the contents of MDA and Fe2+in myocardial tissue decreased in ReA-L group,ReA-H group,and Fer-1group,the activities of GSH-Px and SOD,and the levels of p-AKT/AKT,Nrf2,and GPX4proteins in the tissue increased,the level of TfR1protein decreased,the apoptosis rate of myocardial cells and myocardial infarction area were decreased,and myocardial tissue damage greatly alleviated(P<0.05).Perifosine attenuated the inhibitory effect of high-dose ReA on ferroptosis in MI/RI rats.Conclusion:ReA may inhibit ferroptosis and improve myocardial tissue damage in MI/RI rats by activating AKT/Nrf2/GPX4signaling pathway.
Keywords rehmannioside A;protein kinase B/nuclear factor erythroid2-related factor2/glutathione peroxidase4;ferroptosis; myocardial ischemia-reperfusion injury;experimental study
基金项目2019年四川省第一批科技计划项目(No.2019YJ0702)
作者单位广元市第一人民医院(四川广元628000),E-mail:
引用信息刘盼,王晓英,韩丹.地黄苷A通过调节AKT/Nrf2/GPX4信号通路介导的铁死亡改善大鼠心肌缺血再灌注损伤[J].中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(22):4112-4119.
冠心病具有高发病率和高死亡率等特点,心肌缺
血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion
injury,MI/RI)是冠心病的主要病理表现,主动脉血管壁斑块破裂可促进血栓形成并阻塞血管腔,造成心肌
缺血性损伤,在一定时间内恢复血液供应,导致心肌二
次受损,这一过程被称为MI/RI[1-2]㊂MI/RI发病机制复杂,其中氧化应激㊁细胞凋亡㊁炎症等因素均参与MI/RI
发生发展[3]㊂近年来研究发现,铁死亡是导致MI/RI 发展的重要因素[4]㊂铁死亡是一种新的细胞死亡方式,具有铁离子依赖性,铁离子在细胞内代谢失衡可增加细胞内铁离子的蓄积,进而催化细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,诱导细胞铁死亡[5]㊂研究发现,蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/核因子红细胞系2相关因子2(nuclear factor erythroid2-related factor2,Nrf2)/谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase4,GPX4)信号通路的激活可抑制铁死亡[6-7]㊂地黄苷A(Rehmannioside A,ReA)是玄参科植物地黄中的重要活性成分,具有抗氧化㊁抗炎㊁抗凋亡等疗效[8]㊂研究发现,ReA可通过激活AKT/Nrf2/ GPX4信号通路,抑制神经元铁死亡,从而发挥神经保护作用[9]㊂而ReA能否通过调控AKT/Nrf2/GPX4信号通路介导的铁死亡改善MI/RI尚鲜见报道㊂为此,本研究以铁死亡为切入点,旨在探究ReA对MI/RI大鼠的影响及其作用机制㊂
1材料与方法
1.1实验动物
90只体质量为220~250g的无特定病原体(SPF)级SD大鼠,购自湖北贝恩特生物科技有限公司,生产许可证号为SCXK(鄂)2021-0027㊂所有大鼠均饲喂于温度24ħ和湿度50%的动物房中,并提供12h光/暗循环㊂
1.2主要试剂
ReA(货号:YT61748)购自北京伊塔生物科技有限公司;Ferrostatin-1(Fer-1)(货号:F27030)购自上海吉至生化科技有限公司;perifosine(货号:S43190)购自上海源叶生物科技有限公司;乳酸脱氢酶(LDH)(货号:E-EL-R0576)㊁肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)(货号:E-EL-R1327)和心肌肌钙蛋白I(cTnI)(货号:E-EL-R1253)检测试剂盒均购自上海恒斐生物科技有限公司;氯代三苯基四氮唑(TTC)(货号:S0022)购自上海远慕生物科技有限公司;苏木素-伊红(HE)染色试剂盒(货号:C0105)和原位末端标记测定法(TUNEL)染色试剂盒(货号:C1086)均购自上海碧云天生物技术有限公司;谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)(货号:BC1190)㊁超氧化物歧化酶(SOD)(货号:BC0170)和丙二醛(MDA)(货号:BC0020)检测试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司;Fe2+含量检测试剂盒(货号: E1050)购自北京普利莱基因技术有限公司;兔源p-AKT(货号:ab192623)㊁AKT(货号:ab179463)㊁Nrf2 (货号:b92946)㊁GPX4(货号:ab125066)㊁转铁蛋白受
体1(TfR1)(货号:ab269513)㊁GAPDH(货号: ab199554)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(货号:ab205718)均购自Abcam公司㊂
1.3动物分组及MI/RI大鼠模型建立
90只大鼠适应性喂养1周后,随机分为假手术组(Sham组)㊁模型组(Model组)㊁ReA低剂量组(ReA-L 组)㊁ReA高剂量组(ReA-H组)㊁铁死亡抑制剂Fer-1组(Fer-1组)及ReA高剂量+AKT抑制剂perifosine 组(ReA-H+perifosine组),每组15只㊂ReA-L组㊁ReA高剂量组大鼠分别腹腔注射40㊁80mg/kg ReA[10],Fer-1组大鼠腹腔注射2mg/kg ferrostatin-1[11], ReA-H+perifosine组大鼠腹腔注射80mg/kg ReA及20mg/kg perifosine[12],Sham组和Model组大鼠腹腔注射等量生理盐水,每日1次,连续给药2周㊂除Sham组外,各组大鼠在末次给药1h后建立MI/RI大鼠模型,参照文献[13]方法,应用左冠状动脉前降支结扎法:将大鼠用1%戊巴比妥钠(30mg/kg)腹腔注射麻醉后,以仰卧位姿势固定在手术台上;胸部皮肤经备皮消毒后,在大鼠左侧第3肋与第4肋骨间行开胸手术,暴露心脏;在冠状动脉左前降支进行30min结扎,此时可观察到心肌由红色变为白色;30min后打开结扎线再灌注2h,心肌由白色变为红色,提示建模成功㊂Sham组大鼠除不进行冠状动脉结扎外,其余操作同建模大鼠一致㊂
1.4血清心肌酶水平检测
造模结束后,采集各组大鼠腹主动脉血液5mL离心获得血清;按LDH㊁CK-MB和cTnI酶联免疫试剂盒要求检测大鼠血清LDH㊁CK-MB和cTnI的水平㊂
1.5心肌梗死面积检测
每组取5只大鼠经颈椎脱臼处死,采集左心室组织;使用切片刀将左心室切割为5片,每片2mm厚;将切割完成的心肌组织置于1%TTC溶液中进行染色;随后转移到10%甲醛溶液中固定;正常心肌组织呈红色,梗死区心肌组织呈白色㊂采用Image J计算梗死面积,梗死面积为每片切片梗死心肌面积总和占左心室面积的百分比㊂
1.6心肌组织病理形态学观察
每组再取5只大鼠经颈椎脱臼处死后,采集左心
室缺血区心肌组织固定于4%多聚甲醛中;固定24h 后,心肌组织依次经脱水㊁透明㊁包埋后,采用连续切片机进行5μm连续切片;依次将切片置入苏木素染色液和伊红染色液中进行染色;光学显微镜下观察心肌组织染色结果㊂
1.7心肌细胞凋亡率检测
取心肌组织切片经脱蜡至水后,再切片添加蛋白酶K工作液孵育;滴加破膜工作液破膜;将TUNEL试剂盒内的TDT酶㊁dUTP和buffer按1ʒ5ʒ50比例混合配制反应液;滴加反应液到切片孵育;DAPI染液复染细胞核;荧光显微镜下观察染色结果㊂
1.8心肌组织抗氧化能力评估
每组另取5只大鼠经颈椎脱臼处死后,采集左心室缺血区心肌组织置于匀浆管中进行匀浆;按SOD㊁GSH-Px和MDA酶联免疫试剂盒要求评估心肌组织抗氧化能力㊂
1.9心肌组织Fe2+含量检测
取心肌组织匀浆,加入Fe2+检测试剂,具体操作依照Fe2+含量检测试剂盒说明书进行,然后在550nm波长处测定吸光度值,并按照标准曲线计算Fe2+含量㊂
1.10心肌组织蛋白表达检测
取心肌组织匀浆,在匀浆液中加入RAPI裂解液离心后获得总蛋白;使用二喹啉甲酸法(BCA)蛋白检测试剂盒检测其浓度;然后行SDS-PAGE㊁转膜及封膜处理;将p-AKT(1ʒ1000)㊁AKT(1ʒ1000)㊁Nrf2 (1ʒ500)㊁GPX4(1ʒ1000)㊁TfR1(1ʒ1000)和GAPDH(1ʒ1000)一抗加入膜中并在室温下孵育过夜;将HRP标记的二抗加入膜孵育;采用Image Lab TM 软件分析蛋白的灰度值㊂
1.11统计学处理
使用SPSS25.0软件对实验数据进行统计学分析,定量资料符合正态分布以均数ʃ标准差(xʃs)表示,组间比较采取独立样本t检验,多组间比较行单因素方差分析,SNK-q检验用于多重比较,以P<0.05为差异有统计学意义㊂
2结果
2.1各组大鼠血清心肌酶水平比较
与Sham组比较,Model组大鼠血清LDH㊁CK-MB 和cTnI水平升高(P<0.05);与Model组比较,ReA-L 组㊁ReA-H组㊁Fer-1组大鼠血清LDH㊁CK-MB和cTnI 水平降低,且随ReA剂量增加,大鼠血清LDH㊁CK-MB 和cTnI水平进一步降低(P<0.05);与ReA-H组比较,ReA-H+perifosine组大鼠血清LDH㊁CK-MB和cTnI水平升高(P<0.05)㊂详见表1㊂
表1各组大鼠血清LDH㊁CK-MB和cTnI水平比较(xʃs)
组别只数LDH(U/L)CK-MB(U/L)cTnI(ng/mL) Sham组15114.28ʃ8.3224.15ʃ1.63 2.06ʃ0.13 Model组15436.57ʃ31.41①142.37ʃ9.16①15.71ʃ1.36①ReA-L组15341.24ʃ28.73②97.62ʃ6.47②10.24ʃ0.82②ReA-H组15227.17ʃ18.35②③42.31ʃ3.24③ 4.36ʃ0.32②③Fer-1组15213.94ʃ15.47②③39.72ʃ3.05②③ 3.82ʃ0.27②③ReA-H+perifosine组15329.18ʃ26.43④91.43ʃ8.21④8.73ʃ0.85④注:Model组与Sham组比较,①P<0.05;ReA-L组㊁ReA-H组㊁Fer-1组与Model组比较,②P<0.05;ReA-H组㊁Fer-1组与ReA-L组比较,③P<0.05;ReA-H+perifosine组与ReA-H组比较,④P<0.05㊂
2.2各组大鼠心肌梗死面积比较
Model组大鼠的心肌梗死面积高于Sham组(P<0.05);与Model组相比,ReA-L组㊁ReA-H组㊁Fer-1组大鼠心肌梗死面积降低,且随着ReA剂量增加,大鼠心肌梗死面积进一步减少(P<0.05);与ReA-H组比较,ReA-H+perifosine组大鼠心肌梗死面积升高(P<0.05)㊂详见表2㊁图1㊂
表2各组大鼠心肌梗死面积比较(xʃs)组别只数心肌梗死面积(%) Sham组50 Model组538.73ʃ3.15①ReA-L组530.16ʃ2.43②③ReA-H组521.34ʃ1.72②③Fer-1组519.46ʃ1.54②ReA-H+perifosine组529.07ʃ2.13④注:Model组与Sham组比较,①P<0.05;ReA-L组㊁ReA-H
组㊁Fer-1组与Model组比较,②P<0.05;ReA-H组㊁
Fer-1组与ReA-L组比较,③P<0.05;ReA-H+
perifosine组与ReA-H组比较,④P<0.05㊂
图1TTC观察大鼠心肌梗死面积
2.3各组大鼠心肌组织病理学损伤比较
Model组与Sham组比较,大鼠心肌组织明显受损,心肌细胞肿胀且杂乱排列,心肌纤维紊乱,有大量炎性细胞浸润;ReA-L组㊁ReA-H组㊁Fer-1组大鼠心肌组织损伤明显减轻,且随ReA剂量增加,效果越明显;与ReA-H组相比,ReA-H+perifosine组大鼠心肌组织损伤明显加重㊂详见图2㊂
图2大鼠心肌组织病理形态学变化(HE染色,ˑ400)
2.4各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较
Model组与Sham组比较,心肌细胞凋亡率升高(P<0.05);与Model组比较,ReA-L组㊁ReA-H组㊁Fer-1组心肌细胞凋亡率降低(P<0.05);ReA-H+ perifosine组与ReA-H组相比,心肌细胞凋亡率升高(P<0.05)㊂详见图3㊁表3㊂
图3TUNEL染色检测大鼠心肌细胞凋亡率变化(ˑ200)
表3各组大鼠心肌细胞凋亡率比较(xʃs)组别只数凋亡率(%) Sham组5 3.56ʃ0.27 Model组532.18ʃ2.97①ReA-L组523.32ʃ2.18②ReA-H组512.51ʃ1.12②③Fer-1组511.96ʃ0.93②③ReA-H+perifosine组520.14ʃ1.72④注:Model组与Sham组比较,①P<0.05;ReA-L组㊁ReA-H
组㊁Fer-1组与Model组比较,②P<0.05;ReA-H组㊁
Fer-1组与ReA-L组比较,③P<0.05;ReA-H+
perifosine组与ReA-H组比较,④P<0.05㊂2.5各组大鼠心肌组织抗氧化指标水平比较Model组与Sham组相比,心肌组织GSH-Px和SOD水平降低,MDA水平升高(P<0.05);ReA-L组㊁ReA-H组㊁Fer-1组与Model组比较,心肌组织GSH-Px和SOD水平升高,MDA水平下降,ReA各剂量组间GSH-Px㊁SOD㊁MDA水平差异有统计学意义(P< 0.05);与ReA-H组比较,ReA-H+perifosine组GSH-Px 和SOD水平下降,MDA水平增高(P<0.05)㊂详见表4㊂
表4各组大鼠心肌组织GSH-Px㊁SOD和MDA水平比较(xʃs)
组别只数GSH-Px(U/mg)SOD(U/mg)MDA(nmol/mg) Sham组5143.47ʃ11.62165.24ʃ15.33 2.25ʃ0.34 Model组540.25ʃ4.76①65.81ʃ5.17①14.57ʃ1.31①ReA-L组562.34ʃ6.15②83.78ʃ7.23②9.86ʃ0.85②ReA-H组595.72ʃ8.53②③125.45ʃ9.74②③ 5.47ʃ0.42②③Fer-1组598.68ʃ7.46②③128.76ʃ10.58②③ 4.96ʃ0.29②③ReA-H+perifosine组567.14ʃ5.42④85.41ʃ6.24④8.51ʃ0.63④注:Model组与Sham组比较,①P<0.05;ReA-L组㊁ReA-H组㊁Fer-1组与Model组比较,②P<0.05;ReA-H组㊁Fer-1组与ReA-L组比较,③P<0.05;ReA-H+perifosine组与ReA-H组与ReA-H组比较,④P<0.05㊂
2.6各组大鼠心肌组织Fe2+含量比较
Model组与Sham组比较,Fe2+含量增加(P<0.05); ReA-L组㊁ReA-H组㊁Fer-1组与Model组比较,Fe2+含量降低,且ReA各剂量组间Fe2+含量差异有统计学意义(P<0.05);与ReA-H组比较,ReA-H+ perifosine组大鼠心肌组织Fe2+含量升高(P<0.05)㊂详见表5㊂
2.7各组大鼠心肌组织蛋白p-AKT/AKT㊁Nrf2㊁GPX4和TfR1表达比较
Model组与Sham组比较,p-AKT/AKT㊁Nrf2和GPX4蛋白水平下调,TfR1蛋白水平升高(P<0.05);与Model组比较,ReA-L组㊁ReA-H组㊁Fer-1组心肌组织p-AKT/AKT㊁Nrf2和GPX4蛋白水平升高,TfR1蛋白水平下调,随ReA剂量增加,大鼠心肌组织p-AKT/AKT㊁Nrf2和GPX4蛋白水平进一步升高,TfR1蛋白水平进一步降低(P<0.05);与ReA-H组比较, ReA-H+perifosine组大鼠心肌组织p-AKT/AKT㊁Nrf2和GPX4蛋白表达降低,TfR1蛋白表达增高(P< 0.05)㊂详见图4㊁表6㊂
表5各组大鼠心肌组织Fe2+含量比较(xʃs)
组别只数Fe2+含量(μmol/gprot) Sham组58.95ʃ0.72 Model组537.24ʃ3.05①ReA-L组525.17ʃ1.96②ReA-H组516.43ʃ1.35②③Fer-1组515.72ʃ1.46②③ReA-H+perifosine组523.83ʃ1.86④注:Model组与Sham组比较,①P<0.05;ReA-L组㊁ReA-H
组㊁Fer-1组与Model组比较,②P<0.05;ReA-H组㊁
Fer-1组与ReA-L组比较,③P<0.05;ReA-H+
perifosine组与ReA-H组比较,④P<0.05㊂
图4Western Blot检测各组大鼠心肌组织p-AKT/AKT㊁Nrf2㊁GPX4和TfR1蛋白表达条带图
表6各组大鼠心肌组织p-AKT/AKT㊁Nrf2㊁GPX4和TfR1蛋白表达比较(xʃs)
组别p-AKT/AKT Nrf2/GAPDH GPX4/GAPDH TfR1/GAPDH Sham组0.93ʃ0.08 1.08ʃ0.090.87ʃ0.060.25ʃ0.03 Model组0.24ʃ0.03①0.31ʃ0.03①0.29ʃ0.02①0.79ʃ0.06①ReA-L组0.51ʃ0.04②0.49ʃ0.03②0.43ʃ0.05②0.62ʃ0.05②ReA-H组0.76ʃ0.07②③0.81ʃ0.06②③0.67ʃ0.06②③0.44ʃ0.05②③Fer-1组0.79ʃ0.06②③0.85ʃ0.06②③0.69ʃ0.05②③0.39ʃ0.04②③ReA-H+perifosine组0.56ʃ0.05④0.53ʃ0.04④0.47ʃ0.04④0.59ʃ0.04④注:Model组与Sham组比较,①P<0.05;ReA-L组㊁ReA-H组㊁Fer-1组与Model组比较,②P<0.05;ReA-H组㊁Fer-1组与ReA-L组比较,③P<0.05;ReA-H+perifosine组与ReA-H组比较,④P<0.05㊂
3讨论
MI/RI是心肌缺血恢复血液供应后心肌损伤反而加重的一种现象,是冠心病的主要病理表现[14]㊂伴随着MI/RI发展可造成急性心肌梗死的发生,而急性心肌梗死是导致冠心病病人死亡的主要原因[15]㊂控制MI/RI发生发展是改善冠心病病人预后的关键㊂MI/RI 发病机制复杂尚未完全阐明,因此,阐明MI/RI发病机制对控制MI/RI发展具有重要意义㊂本研究采用左冠状动脉前降支结扎法建立MI/RI大鼠模型,结果显示,与Sham组比较,Model组大鼠心肌梗死面积及心肌细胞凋亡率增加,心肌组织形态结构严重受损;此外,血清中心肌酶LDH㊁CK-MB和cTnI水平上升,这可能是大量心肌细胞损伤,导致胞内心肌酶释放到血液中的结果,以上结果进一步提示了MI/RI大鼠模型成功建立㊂研究发现,MI/RI发生后,心肌细胞中往往存在大量铁离子蓄积,进而促进细胞脂质过氧化发生,诱导细胞铁死亡,加重组织损伤[16]㊂在本研究中,与Sham 组相比,Model组大鼠心肌组织中Fe2+含量增加,且心肌组织中GSH-Px和SOD水平降低,MDA水平升高,提示了铁死亡与MI/RI发生密切相关㊂
当前,尚无十分有效的治疗方法来保护心脏免受MI/RI,因此,寻求及开发新策略来预防MI/RI具有重要的临床意义㊂ReA来源于玄参科植物地黄的干燥块根,已被证实具有抗氧化㊁抗炎㊁抗凋亡等生物学功能[17]㊂研究报道,ReA可提高认知障碍模型大鼠脑组织中GSH-Px和内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)水平,降低MDA产生,进而抑制脂质过氧化㊁细胞凋亡和细胞铁死亡的发生[9]㊂在本研究中,低㊁高剂量ReA及Fer-1处理后大鼠心肌组织中Fe2+含量及MDA水平降低,GSH-Px和SOD水平上升,且血清中心肌酶LDH㊁CK-MB和cTnI水平下降,心肌梗死面积及心肌细胞凋亡率降低,心肌组织损伤减轻,提示ReA可能通过抑制心肌细胞铁死亡,改善心肌组织损伤㊂细胞铁死亡机制与细胞内铁离子代谢失衡及氧化损伤密切相关[18]㊂TfR1是调控细胞内铁离子代谢的重要蛋白,负责循环中Fe3+跨膜转运到细胞内被还原为Fe2+所利用,研究发现,敲低TfR1可通过抑制细胞铁死亡改善MI/RI[19]㊂细胞发生铁死亡时Fe2+可在细胞内蓄积,因Fe2+具有强氧化性,可与细胞内H2O2反应引起大量羟自由基生成,促进脂质过氧化发生,进而损伤细胞膜[20]㊂GPX4是调节细胞铁死亡的关键蛋白,GPX4表达降低可打破细胞内氧化平衡,诱导脂质过氧化发生,进而促进细胞铁死亡[21]㊂Nrf2受AKT 的调控,是维持细胞氧化还原稳态的关键转录因子, AKT-Nrf2通路的激活可促使下游GPX4表达升高,抑制细胞铁死亡的发生[7]㊂本研究结果显示,Model组大鼠心肌组织p-AKT/AKT㊁Nrf2和GPX4蛋白水平下调,TfR1蛋白水平升高,而经低㊁高剂量ReA及Fer-1处理后心肌组织p-AKT/AKT㊁Nrf2和GPX4蛋白水平上升,TfR1蛋白水平下降,提示ReA可能通过激活AKT/Nrf2/GPX4信号通路抑制心肌细胞铁死亡,改善心肌组织损伤㊂为验证ReA是否通过激活AKT/Nrf2/ GPX4信号通路,抑制心肌细胞铁死亡,本研究采用AKT抑制剂perifosine处理干预高剂量ReA大鼠,结果显示,与ReA-H组比较,ReA-H+perifosine组大鼠心肌组织p-AKT/AKT㊁Nrf2和GPX4蛋白水平降低,心肌细胞内Fe2+含量增高,心肌组织损伤严重,以上结果提示perifosine减弱了高剂量ReA对MI/RI大鼠铁死亡的抑制作用,证实了ReA能够通过抑制心肌细胞铁死亡进而改善心肌组织损伤,这可能与AKT/Nrf2/ GPX4信号通路的激活有关㊂
综上所述,ReA能够抑制心肌细胞铁死亡,进而改善MI/RI,这可能是通过激活AKT/Nrf2/GPX4信号通路实现的㊂本研究为开发预防和治疗MI/RI新药提供了理论依据㊂然而,ReA对MI/RI发生后心肌组织的保护作用可能还涉及其他通路,仍需进一步探究㊂
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07-07)
(本文编辑王雅洁)
川芎嗪通过抑制环氧化酶2/前列腺素E2途径减轻血管紧张素Ⅱ
诱导的心肌肥大
韩思梁1,赵泽群1,石云2,孔繁昌2
摘要目的:探究川芎嗪通过抑制环氧化酶2(COX2)/前列腺素E2(PGE2)途径减轻血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌肥大㊂方法:培养小鼠正常心肌细胞H9c2作为对照组,用0.1μmol/L的AngⅡ诱导建立H9c2肥大模型作为模型组,用低剂量(0.01mmol/L)㊁中剂量(0.1mmol/L)㊁高剂量(1mmol/L)的川芎嗪干预AngⅡ诱导的H9c2细胞作为低剂量川芎嗪组㊁中剂量川芎嗪组㊁高剂量川芎嗪组㊂甲基噻唑基四唑(MTT)法检测细胞活性;Leica Qwin V3图像分析系统测量细胞表面积;激光共聚焦显微镜检测细胞[Ca2+]i;采用比色法测定细胞一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性;酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞转化生长因子β1(TGF-β1)含量;反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测细胞COX2和PGE2mRNA表达;蛋白质免疫印迹法(Western Blot)检测细胞COX2和PGE2蛋白表达㊂结果:与对照组比较,模型组H9c2细胞活性㊁细胞NO含量和NOS活性降低(P<0.05),细胞表面积和[Ca2+]i㊁TGF-β1含量㊁COX2和PGE2mRNA及蛋白表达升高;与模型组比较,川芎嗪各剂量组升高H9c2细胞活性㊁细胞NO含量和NOS活性(P<0.05),降低细胞表面积和[Ca2+]i㊁TGF-β1含量㊁COX2和PGE2mRNA及蛋白表达(P<0.05)㊂结论:川芎嗪通过抑制COX2/PGE2途径减轻AngⅡ诱导的心肌肥大㊂
关键词川芎嗪;血管紧张素Ⅱ;环氧化酶2/前列腺素E2途径;细胞活性;心肌肥大;实验研究
d o i:10.12102/j.i s s n.1672-1349.2023.22.010
心肌肥大是一种强有力的代偿形式,如果代偿形
作者单位 1.河北大学附属医院(河北保定071000);2.河北保定脉管炎医院(河北保定071000)
通讯作者孔繁昌,E-mail:****************
引用信息韩思梁,赵泽群,石云,等.川芎嗪通过抑制环氧化酶2/前列腺素E2途径减轻血管紧张素Ⅱ诱导的心肌肥大[J].中西医结合心脑血管病杂志,2023,21(22):4119-4122.式时间持续延长或者强度无限增大,则肥大心肌在一定疾病程度上可转向心力衰竭,危害生命健康[1-2]㊂环氧化酶2(COX2)/前列腺素E2(PGE2)途径可以调控多种疾病的发生和发展,抑制该信号通路可延缓某些疾病的进展[3-4]㊂川芎嗪对心脏有抑制心肌收缩的作用,对心肌缺血再灌注损伤具有保护作用[5-6]㊂但川芎嗪对心肌肥大的影响及其可能作用机制尚未明确㊂本实验探究川芎嗪通过抑制COX2/PGE2途径减轻血管。