人类唾液中的蛋白质组稳定的方法发展

摘要：人类唾液是新兴的早期检测并具有诊断潜能的生物流体。

然而，唾液蛋白质组易于迅速降解，从而危及其平移于临床实用程序。

因此，迫切需要人类唾液样本储存的简单、可靠、实用的方法。

在这项研究从健康人的唾液样本被收集和存储在室温下(RT) 和不同的时间和无特定蛋白稳定化处理长度为4 ◦C。

电泳法进行比较样本之间蛋白质分析。

选择引用蛋白、-肌动蛋白和白细胞介素-1 (IL1) 评价唾液蛋白的稳定性。

免疫分析用于这些目标蛋白的检测。

与一直在−80 ◦C 积极控制，所有的数据进行比较。

结果显示大约两个星期，而不会显著降低一直存放在4 ◦C 添加的蛋白酶抑制剂与唾液蛋白质组学是稳定。

通过添加样本乙醇，唾液蛋白质组被稳定在常温，经过优化，一个简单、可靠和方便的方法被发展稳定问题不会影响下游的平移和临床应用的人类唾液中的蛋白质。

而不会显著降低，通过为大约两个星期在RT 添加乙醇能够稳定下来唾液蛋白质组。

这种优化的方法可以大大加快唾液为今后诊断的临床应用.
1.序言
人类唾液是可以翻译的具有临床潜力的生物流体。

它在疾病的诊断及预防方面有包括非侵入性，底成本、易于收集和处理样本在内的关键优势，从而成为提供血液、血清或血浆极具吸引力的替代品。

此外，众所周知唾液是人体健康的镜子，并且许多血液成分反映于唾液[1]
人类唾液通过三对主要唾液腺分泌: 腮腺、颌下腺和舌下腺。

唾液包含各种各样的蛋白质，它可以提供腔疾病（例如口腔癌[2] 和舍综合征[3]）和系统性疾病（例如乳腺癌[4，5] 和肺癌[6]）的检测信息。

在病情进展上分析唾液中的蛋白质可以揭示潜在生物标志指示性的疾病的不同阶段，这在早期检测和/或医疗诊断上也许很有用处[7]。

先进的检测仪器和发达的分析技术，蛋白质组学研究被广泛作为一种独特而强大的生物标志物发展办法。

蛋白质组学研究技术不断成熟，蛋白质组学在唾液蛋白质生物标志物发展和临床及其进一步应用方面具有巨大潜力[8，9]。

分离的的唾液样本通常存储在−80 ◦C。

这种方法在现场运用或诊所的日常诊所运作上是不切实际，人类唾液为临床应用广泛利用，主要的挑战是，在诊断中稳定并保持的唾液蛋白质组的完整性[10,11]。

这是因为唾液蛋白质组易于迅速降解，从而危及其平移于临床实用程序，唾液蛋白配置文件明显地不同于那些腺涎腺分泌物[12]。

主要的原因似乎是内源性蛋白酶的存在使得唾液蛋白家族的主要成员快速水解[12,13]。

通常添加不同蛋白酶抑制剂以防止蛋白质在样本采集过程中降解。

当发现人类唾液中的蛋白质稳定的简单和方便的方法，不同温度和ph 值条件也包括在内，因为其会很大程度上影响蛋白质降解[14,15]。

最近一份报告发现，甚至抑制剂的混合物不能防止组胺素5、蛋白或PRP1 在整个唾液中降解[15]。

前一份报告显示，甘油可稳定蛋白和防止蛋白质聚集[16]。

此方法通常用于保存蛋白质和抗体。

但是，添加的甘油将在下游分析导致并发症。

在我们以前的工作，我们发现RNAprotect ® 唾液试剂巴伦西亚，CA QIAGEN Inc.）提供有效的并发稳定到唾液蛋白DNA 和RNA 在RT [10]。

尽管这种方法需要唾液样本混合和五次试剂，向下游分析介绍更多的额外工作。

乙醇可取代周围暴露疏水基的环绕的蛋白质的非极性侧链，从而增加稳定性的蛋白质[17] 有序的水分子。

淀粉酶贡献近60%的总唾液蛋白质[18]，这很大程度上可能影响稳定的唾液蛋白质。

此外，淀粉酶去除可能增加其他唾液蛋白质的稳定性，并简化了低丰度蛋白[7] 的表征。

这项研究的假设是唾液蛋白质组可以稳定在室温，并且进一步平移和临床应用程序中使用。

这项工作的目的是发现镇定的唾液蛋白质组的简单、可靠、实用的方法。

预计这种方法会加速人类唾液的广泛临床应用。

蛋白稳定，包括添加蛋白酶抑制剂或乙醇、变性和
移除淀粉酶，不同的方法进行了评估。

一个有效的方法被优化，以最大限度地减慢唾液中的蛋白质降解在直角加入乙醇此方法将为许多疾病的早期检测中的唾液诊断的强大动力。

2.材料和方法
2.1.样本的收集和处理
唾液样本从10个健康项目下经机构审查委员会协议的认可(IRB #10-000505) [5,6]。

从没有一个项目有任何历史的恶性肿瘤、幼童、自身免疫性疾病、肝炎、或艾滋病毒感染，平均年龄为35岁的所有参与者获得知情同意书和问卷数据单。

测试者要求至少采样1 小时前不要吃、喝或使用口腔卫生产品。

用水冲洗嘴后,每个项目中收集5 毫升唾液到50 毫升离心管。

这些唾液样本经过0.45 米聚偏氟乙烯膜（微孔，美国马萨诸塞州比尔里卡）筛选以删除细胞和任何碎片，过滤收集。

期间的样品制备、唾液样本是始终保持在冰点。

图1 是样品制备示意图。

滤过筛选的唾液样本然后转移到微型离心机管，分别存储在RT、4 ◦C 和−80 ◦C，如下所述的四个不同处理后：(一)唾液样本放置在准备好的蛋白酶抑制剂中，RT 和 4 ◦C 存储。

所有样本都所用蒸馏水保持相同的容量。

曾被存储在−80 ◦C 添加的蛋白酶抑制剂小分唾液样本被用作所有的实验的正控制。

蛋白酶抑制剂储存解决方案是由 1 毫升蒸馏水水中加入 1 罗氏完整片(罗氏诊断GmbH、罗氏应用科学、德国）。

每 1 毫升唾液加入20微升储备溶液旋转摇匀简单混合。

(二) 根据前面的报告唾液淀粉酶耗尽[18]。

简单地说，唾液样本是从淀粉列，耗尽淀粉酶。

(三) 蛋白质变性实验、唾液样本的任一煮在95 ◦C 10 分钟或通过添加时间20 卷无水乙醇(Fisher Scientific、新泽西、美国)。

两个星期维持于RT 变性的样品。

唾液蛋白被随后沉淀用离心法20 分钟(IV) 非变性方法20,000 g，每20 升乙醇已添加到100 升唾液。

所有样本都具有蒸馏水平等卷都组成。

在不同的时间点，一直在RT 或 4 ◦C 的唾液样本的1 aliquot 是入−80 ◦C 冰箱冷藏移动和存储直到进一步分析。

2.2.蛋白质浓度测量
每个唾液样本的蛋白质浓度测量使用BCA 蛋白检测试剂盒(热科学皮尔斯、白细胞介素、美国)。

每个样本的平等卷加载到96 孔板中的重复项。

按照制造商的指示执行实验在562 nm读数。

2.3.SDS 和蛋白质印迹法
每个样本容量的唾液相等用于电泳和印迹。

对于SDS-10%双向电泳凝胶是运行在150 V MES SDS 1 h.Pre-stained 蛋白质标准（美国Invitrogen CA）运行缓冲区中的被用来跟踪蛋白迁移。

凝胶然后被斑斑简单蓝（美国Invitrogen CA）。

[5] 的印迹，唾液蛋白被运行，而转移到使用iBlot （美国Invitrogen CA）聚偏氟乙烯膜。

膜是孵化与主要的抗体（鼠标单克隆抗体的肌动蛋白，Sigma–Aldrich，圣路易斯，MI，美国），然后孵化与二级抗体(anti-mouse IgG、过氧化物酶链接从羊物种特异性的整个抗体) 按照制造商的说明，为在直角1 h最后，膜被使用可视化的ECL 加号检测试剂盒冲走(WI，通用电气医疗集团美国)。

2.4.在凝胶胰蛋白酶消化和 NanoLC–MS/MS 分析
凝胶中胰蛋白酶消化和质谱蛋白鉴定了前面所述的[6] 相同。

简单地说，每个切的凝胶切片destained，和凝胶中胰蛋白酶在37 ◦C 通宵进行。

胰酶肽引起消化然后提取和加载到LC–MS/MS (Eksigent NanoLC-2D，与热LTQ XL) 进行蛋白质鉴定。

谱是收集和处理的Xcalibur 软件v3.3.0 马萨诸塞州热科学）。

联合的MS 和MS/MS 谱了从原料转换为mzXML （ReAdW 版本 4.3.1) 和提交数据库搜索再次人类Swissprot 的使用X ！串联（2010.04.21 版）。

搜索参数被胰蛋白酶，1 错过裂解酶、固定变量修改的氧化(M)、
carbamidomethyl (C) 修改父4 Da 离子宽容和片段大规模容忍：± 0.4 Da。

两个多肽和日志（E 值）的标准< −10 被用于蛋白质鉴定。

2.5.酶联免疫吸附法
酶联免疫吸附试验测试的肌动蛋白(总-肌动蛋白夹心酶联免疫吸附试验工具包，细胞信号转导技术公司、马，美国）和IL1 (热科学皮尔斯、白细胞介素、美国) 进行按照制造商的说明。

所有的唾液样本被样品稀释液稀释 2 倍，IL1 和10 倍-肌动蛋白。

2.6.数据分析
Graphpad 棱镜（版本5.01）用于所有数据分析。

P 值计算基于T 检验和p < 0.05 被用作防渗的意义。

单因素方差是运行，以确定是否中测得的特点其实不同群体。

信号强度的印迹乐队是通过使用图像J 软件贝塞斯达，MD，美国国家卫生研究院）的量化。

3.结果
蛋白酶抑制剂通常添加样本收集，以防止蛋白质降解过程。

这项调查还评估蛋白酶鸡尾酒和不同温度条件对蛋白质组稳定，因为知道他们极大地影响速率的蛋白质降解[14]。

淀粉酶去除可能增加其他唾液蛋白质的稳定性，并简化了低丰度蛋白[7] 的表征。

乙醇已充分评估稳定的蛋白质[17]。

所有这些方法都具有已在这项研究中进行测试，以蛋白质组稳定的效率进行评估。

3.1.贮藏温度对总唾液蛋白浓度的影响
存储在RT 和−80 ◦C 的唾液样本的蛋白质浓度测量。

平均总蛋白浓度的积极控制了1.19 ± 0.15 g L−1 后30 天内存储在−80 ◦C。

30 天内存储在RT 的唾液，发现有0.76 ±0.21 g L−1，较积极的控制36%总蛋白质浓度(p = 0.0063 n = 5)，它表明，唾液蛋白质组已受到严重削弱。

3.2.唾液蛋白质组稳定的蛋白酶抑制剂
在人类唾液中的肌动蛋白退化时样品被存储在直角稳定性的-图 2 所示肌动蛋白有系统地进行之间不同处理的酶联免疫吸附试验比较。

如果唾液样本被存放在RT 未经任何处理，有重大的退化。

3 天后有只71.72 ± 18%左时相比，积极的控制。

如果唾液样本保持在蛋白酶抑制剂4 ◦C，超过85 ± 12%的这种蛋白能在唾液中检测到并没有重大的变化，从积极的控制。

蛋白酶抑制剂与存储在RT 的唾液样本中的肌动蛋白被认为是稳定仅3 天。

当唾液样本已被存储在与蛋白酶抑制剂4 ◦C、-肌动蛋白被发现稳定，而不会显著降低约 1 个月。

3.3.唾液蛋白质组稳定的淀粉酶枯竭
淀粉酶是唾液中最丰富的蛋白质，极大地影响到其他唾液蛋白质的稳定性。

从唾液中删除淀粉酶后，我们的数据表明唾液蛋白质变得更稳定。

唾液蛋白质和无淀粉酶消逝的电泳图像中展出图3A和图3a 无淀粉酶去除标记乐队为a、b、c 和d 的车道RT 是明显弱于存储在RT 20%乙醇的3 天。

所有4 波段被量化，然后规范化为相应的积极控制乐队（图3）。

数据表明是−80 ◦C 和RT 的重大区别，是否涉及不治疗(p = 0.024，n = 4)。

当唾液样本被存储在RT 20%乙醇时，有−80 ◦C 样本（图3A）相比没有显著变化（p = 0.31，n = 4)。

相反，如果从唾液中移除了淀粉酶，有20%乙醇(图3B) −80 ◦C 和RT 或RT 之间没有重大退化(p = 0.17 和p = 0.36，分别，n = 4)。

印迹的-肌动蛋白后还存储了7 天的唾液中表明淀粉酶删除（图3D 和E）后趋于稳定。

如果添加20%乙醇，稳定效率-肌动蛋白是更好。

要检查什么样的蛋白质可能由淀粉酶去除保护，LC–MS/MS 是运行图3B 巷直角的4 波段蛋白质鉴定A、三波段确定蛋白质，包括desmoplakin，在恶性脑肿瘤 1 蛋白与龙萃结合蛋白 2 中删除。

在乐队b、7 蛋白被发现(黏蛋白7、四肽重复同源蛋白1、杀菌/增渗proteinlike 1，lactotransferrin，过氧化物酶体激活受体伽玛共激活因子相关蛋白1，
α-2-巨球和聚合物的免疫球蛋白受体）。

在乐队 c 中，几个亚型的免疫球蛋白重链等出现了V-III，α-2 γ 1 γ 2 和γ-4。

此外，还确定碳酸酐酶6、珠相关蛋白和细胞质1 肌动蛋白。

在乐队d 中，发现了 6 蛋白质。

她们Ig lambda 1、Ig kappa、酶原颗粒蛋白16、短口感肺癌和鼻上皮癌相关蛋白2、3-磷酸甘油醛脱氢酶和l-乳酸脱氢酶。

3.4.唾液蛋白质组稳定变性
我们还探讨了高温和乙醇使稳定唾液蛋白质组变性的使用。

保持在95 ◦C 10 分钟或20%乙醇唾液样本会聚沉。

然后这些唾液样本，储存在常温下后两个星期，这些-肌动蛋白样品被印迹法检测到并在有效控制下（图4A）作比较。

这些变性的样品保持在常温没有重大改变，特别是-乙醇沉淀后，五个样品中的肌动蛋白是一致的稳定（图4B、p = 0.42，n = 5)，虽然没有煮的唾液样本偏差相对较大(p = 则会增加0.071 n = 5)。

3.5.唾液蛋白质组通过最小化乙醇非变性方法稳定
通过比较这些已被用来稳定唾液蛋白质的方法，20%乙醇被选为优化的方法，通过添加乙醇样品和保持他们在不同的时间间隔来稳定在室温的唾液蛋白质组，两种蛋白在室温已被免疫法测量，包括-肌动蛋白和IL1。

印迹的-肌动蛋白不同处理中如图5A 所示。

其相应的quantifications 被显示在图5B。

结果表明有重大的肌动蛋白降解在RT 3、7 和14 时相比，−80 ◦C 的天后。

通过添加20%乙醇唾液样本，观察到在RT 的蛋白质降解受到阻碍与发现的−80 ◦C (图5B) 相比无显著差异(p > 0.05，n = 8）。

但是，经过30 天，严重降低-肌动蛋白指出即使添加乙醇(p = 0.0071，n = 7）。

IL1 已被确认为口腔癌唾液生物标志，进行测试的酶联免疫吸附试验在这项研究。

虽然长时间的时间段的退化，图 6 中的数据表明IL1 30 天(p > 0.05）后甚至是稳定在RT。

通过添加20%乙醇，这种蛋白的稳定性增加(p > 0.05，n = 10）。

4.讨论和结论
4.1.唾液组分和他们对蛋白质稳定性的影响
除了蛋白质、人类唾液，如RNA [19]、microRNA [20]、DNA [21]、代谢产物[22]、[23] 细胞和微生物[24] 中还有其他类型的程序。

所有这些程序可能会影响质量和唾液蛋白质组的组成。

例如，有不同种类的唾液，可以消化多种蛋白中的蛋白酶。

在这次调查中使用的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片旨在抑制广泛的丝氨酸、半胱氨酸和金属蛋白酶，以及钙激活[14]。

微生物也可能会产生一些代谢物，可以改变人类唾液蛋白质组的组成。

RNA 可能与蛋白质交互，并成为稳定的[25]。

存储温度也会更改不同的蛋白酶，会改变不同的蛋白质的稳定的活动。

通过考虑所有这些因素，唾液蛋白质组正面临巨大的风险正在消化或在不同的情况下更改。

4.2.唾液蛋白质组稳定途径
这份报告来达到稳定在直角的唾液蛋白质的目标一直在测试不同的方法他们的工作效率对测试选定的蛋白指标的评价。

以正常稳定唾液蛋白质，应抑制涎腺蛋白酶的活动。

否则，我们有图3a 所示，将快速降级唾液蛋白质。

为了降低微生物的代谢，唾液样本应保持在−80 ◦C 根据我们标准操作程序[5]。

添加了蛋白酶抑制剂，以阻碍蛋白质降解。

我们的数据表明没有任何治疗的唾液样本将很快被消化。

其唾液蛋白浓度在直角的30 天后被大大低于积极控制我们的研究结果显示，增加的蛋白酶抑制剂和存储 4 ◦C 在大约两个星期可以有效地稳定这种蛋白质。

然而，唾液样本能够只稳定在RT 3 天无显著变化通过添加蛋白酶抑制剂。

淀粉酶耗尽后唾液蛋白质组变得更稳定。

通过删除淀粉酶，RT 唾液蛋白降解不明显时相比，没有淀粉酶消耗（图3A 和B）。

总共有24 蛋白已选定 4 凝胶频带，可能受淀粉
酶去除。

大多数人都具有约束力和催化活性的分子功能。

淀粉酶去除可大大有助于低丰度蛋白[7] 的表征。

然而，虽然这一战略是唾液蛋白稳定的希望不大，但有几个弱点为此方法。

首先，唾液样本需要额外的处理，增加复杂性的样品采集。

第二，唾液样本是淀粉酶枯竭，可能会影响下游分析后的稀释5-10 倍。

最后，一些唾液蛋白还可通过使用淀粉列中删除。

蛋白质的变性杀死微生物和改变蛋白质的结构。

热和有机溶剂可通过更改其结构[26] 稳定蛋白质。

我们的数据表明无显著变化时相比，积极控制的两个星期的变性的唾液样本可以存储在RT。

不过，从临床使用情况，看这些蛋白质不适于一些分析，例如结构相关的分析和检测，以及免疫酶联免疫吸附试验等。

通过降低至20%的乙醇的添加的量，唾液中的蛋白质能够仍然稳定在RT 而不会显著降低至少两个星期（图5 和6）。

在这此方法存储的样本可很容易和广泛用于标记物的发现和生物标记验证（通过西方吸墨水纸或酶联免疫吸附试验或其它方法），这是令人鼓舞的。

4.3.评价标记的选择
两种蛋白，包括-肌动蛋白和IL1，在这项研究中被选为评价标记。

-肌动蛋白一直被用作唾液样本的蛋白质量的评价参考[19]。

IL1 已被确认为口腔癌检测的生物标志物[2,27]。

5.结论
在常温下通过添加少量的稳定剂稳定唾液蛋白质组在临床应用中至关重要，在这项研究中,不同的方法发现和评估唾液蛋白质组稳定。

虽然文献表明，甘油可稳定蛋白和防止蛋白质聚集[16]，大量的甘油会增加分析的复杂性。

这里选择乙醇，因为它可以取代周围环绕的蛋白质[17] 非极性侧链的暴露疏水基序的水分子。

此外，乙醇在样品分析加工过程中的影响最小。

它甚至可以通过真空冷冻干燥轻松地删除。

最令人兴奋的是，所有的数据表明，唾液样本在20%乙醇中常温下可能会稳定大约两个星期而不会明显降低。

有意义的是，在两个星期都足够从外地将唾液样本运输到其目的地，用于临床分析或进一步长期存储。

虽然核查的此方法需要全面分析大样本量的大小，但是平移和临床应用中唾液中的蛋白质组稳定，选择这一条件是一个良好的开端。