GST表达系统的PROTOCOL

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自配材料：（接上）
凝血酶：将500裂解单位的冷冻干燥过的牛凝血酶(>7500 单位/毫克蛋白)0.5mL于40 o C 预冷的1xPBS中。

缓慢振荡使凝血酶溶解。

在22o C，16h，10mM谷胱甘肽，50mMTris-HCl,pH8.0的条件下，一单位的裂解酶可裂解90％的100μg的测试融合蛋白。

为保持其活性，应将凝血酶溶液分成小等份于-70o C保存（牛凝血酶分子量约为37kDa）
安全性警告及预防措施
警告：本实验器材只用于科研，不建议用于人类或动物的疾病诊断，不可用于人类或动物的体内或体外研究。

所有化学用品都有潜在毒性，只有经过实验技术训练或熟悉良好实验实践原则的人才可操作使用该产品。

使用时需穿戴合适的保护服，如实验工作服、安全眼镜、手套等。

使用时应小心避免化学用品接触眼和皮肤，一旦接触到则应立即用水清洗（详见材料安全使用页）。

警告：该套器材含有甲酰胺，凝胶试剂中可能含有丙烯酰胺，是一种神经毒素，并怀疑有致癌性。

在合理使用过程中需要用到乙醇，是一种易燃液体，为安全操作和使用这些材料请遵循工业生产上的安全资料使用条例。

P5
自配材料：（接上）
2xYTA培养基：胰蛋白胨16g/l 酵母提取物10g/l NaCl 5g/l
将上述材料溶解于900mL蒸馏水中，用NaOH调pH致7.0后配成1升溶液。

高压灭菌20分钟。

介质冷却后无菌加入1mL100mg/mL的氨苄西林储存液，（使终浓度达到
100μg/mL）加入12-15g琼脂以制成固体培养基。

20% Triton X –100
20% Triton X--100 ---v/v in 1x PBS
器材：用于SDS—PAGE 的试剂，仪器和凝胶
使用指导
谷胱甘肽交联琼脂糖4B用于谷胱甘肽S-转移酶、谷胱甘肽依赖的蛋白及谷胱甘肽重组衍生物，如用pGEX系列表达载体得到的谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白（GST）的快速，单步纯化。

GST融合蛋白可用谷胱甘肽交联琼脂糖4B从细菌溶胞产物中直接纯化得到。

蛋白质需要在温和及未失活的状态下洗脱以保持其功能和抗原性。

所要的蛋白的裂解可用一特异位点蛋白酶从GST上分离得到，该蛋白的识别序列紧靠pGEX质粒的多克隆位点上游。

谷胱甘肽交联琼脂糖4B（27-4574-01）可被证明在结合重组GST中是有用的。

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操作规程
指导：根据下述操作规程使用谷胱甘肽交联琼脂糖4B（27-4574-01）可方便地纯化少至80μg多至400mg的GST融合蛋白。

融合蛋白的产量会有很大程度的变化并受融合蛋白的性质、宿主细胞，培养条件等的影响。

其产量可由1-3mg/L升至10mg/L（2）。

以2.5mg/L为平均产量，表1可用来估计需要的培养量。

注：试剂的剂量要求取决于8mg每毫升脱水凝胶的重组GST的结合能力。

该结合
能力是谷胱甘肽交联琼脂糖4B（27-4574-01）的最小结合能力。

要得到精确的结合能力请参考瓶上的标签。

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表1不同蛋白产量所需试剂的体积
组分80mg 16mg 1.6mg 80μg
培养（基）体积20L 4L 400mL 20mL
超声破碎体积1000mL 200mL 20mL 1mL
谷胱甘肽交联琼脂糖床体积* 10mL 2mL 200μL 10μL
1xPBS** 100mL 20mL 2mL 100μL
谷胱甘肽洗脱缓冲液10mL 2mL 200μL 10μL
*:为获得期望的床体积，可用由操作1中准备的50%的谷胱甘肽交联琼脂糖浆液使用两次（即1mL50%谷胱甘肽交联琼脂糖浆液为0.5床体积）
**：该体积指“每次洗脱”。

需要洗脱3次
P8
①50%谷胱甘肽交联琼脂糖4B匀浆的制备
谷胱甘肽交联琼脂糖4B可用于以pGEX系列为表达载体的谷胱甘肽S-转移酶或重组GST融合蛋白产品的批量纯化或柱纯化。

当凝胶平衡时，可被转移至合适的层析柱中，如果要求的话。

[空的一次性PD-10柱，其Amersham Bioscience 号为17-0435-01，总容量（凝胶以及样本）约为13mL]关于谷胱甘肽S-转移酶蛋白的柱纯化细节请参照操作步骤3
1.1参照表1可根据您使用需求来决定谷胱甘肽交联琼脂糖4B的床体积。

所提供的
谷胱甘肽交联琼脂糖4B约为75%的浆液。

下列步骤可用于配制50%的匀浆
1.2轻轻晃动谷胱甘肽交联琼脂糖4B使凝胶重新悬浮。

1.3用吸管将足够使用量的匀浆转至合适的容器/试管中，按要求每毫升床体积配制
1.33mL原始谷胱甘肽交联琼脂糖4B匀浆。

每mL干凝胶可结合至少8mg的重组
GST，要得到精确结合能力请参照瓶上标签。

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1.4500xg离心5分钟，使凝胶沉淀，小心倒去上层液体
1.5用10mL4℃的1xPBS（见自配材料）冲洗由每1.33mL初始谷胱甘肽交联琼脂糖
4B配制的谷胱甘肽交联琼脂糖4B，上下翻转以混匀。

注谷胱甘肽交联琼脂糖4B必须用1xPBS彻底冲洗以除去20%的乙醇贮存液。

乙醇液由剩余将会影响随后的产物。

1.6500xg离心5分钟使凝胶沉淀，去上层液体。

1.7向由每1.33初始谷胱甘肽交联琼脂糖4B配制的匀浆中加入1mL1xPBS,50%的匀
浆就制成了,在随后的吸取步骤前混合均匀.
注:用1xPBS平衡的谷胱甘肽交联琼脂糖4B可在4℃存放一个约月.
P10
②批量纯化谷胱甘肽S-转移酶蛋白
2.1向每100mL超声破碎的细菌(附录3)中加入2mL用1xPBS(操作步骤1)平衡的50%
的谷胱甘肽交联琼脂糖4B匀浆.
2.2用温和的激动剂室培育30分钟
注：这一步中，吸附了混合蛋白的凝胶可填充于免洗脱柱中而易于冲洗和洗脱，如果使用免洗柱，请参考操作规程3中冲洗和洗脱的说明
2.3将混悬液500xg离心5分钟使凝胶沉淀，弃上清。

注：大部分上清液可被抛弃，但可保留部分样品用SDS-PAGE或CDNB分析鉴定（参照GST检测模型27-4590-01）以估记凝胶结合率
2.4用10倍床体积*的1xPBS洗谷胱甘肽交联琼脂糖4B小珠
2.5 500xg离心5分钟，使凝胶沉淀，弃洗液
2.6重复洗2次使洗的次数累计达到三次
注：用谷胱甘肽洗脱缓冲液可直接将结合在凝胶上的蛋白洗脱下来（参照“自配材料”）。

如果需要的话，GST融合蛋白可能会裂解，裂解后的凝血酶、凝血因子Ⅹa 或PreScission TM蛋白酶仍然结合在凝胶上而感兴趣的蛋白从GST上游离出来。

如果pGEX的构建中包含有凝血酶的识别序列请参照附录4。

*床体积相当于0.5×的50％的谷胱甘肽交联琼脂糖匀浆体积。

P11
洗脱
2.7按每毫升床体积谷胱甘肽交联琼脂糖4B1mL的量向沉淀凝胶中加入谷胱甘肽洗脱缓冲液（参照“自配材料”）
2.8轻轻晃动使凝胶重新悬浮，室温（22-25℃）培养10分钟使融合蛋白从凝胶中游离出来
2.9 500xg离心5分钟使凝胶沉淀，将上请转至一洁净离心管中
2.10洗脱洗脱及离心步骤再重复两次，将三次洗脱物集中起来
注：按此洗脱步骤，会有大量蛋白仍会结合在凝胶上，因此步同蛋白融合的洗脱时间及体积会有很大的变化。

也许需要额外的洗脱。

洗脱物可用SDS-PAGE或CDNB 检测GST蛋白（GST测定模块，27-4590-01）
注：融合蛋白的产量可由280nm处的吸光度估量，对GST亲和标记，
1A280≈0.5mg/ml
注：蛋白质的产量同样可用标准显色方法测定（如：Lowry、BCA、Braford等）如果使用Lowry或BCA类似的方法，样品必须用2000体积的1xPBS透析以除去谷胱甘肽，后者会干扰蛋白质的测量，而Braford法可在谷胱甘肽存在的条件下使用
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③谷胱甘肽S-转移酶的柱纯化
平衡
3.1每次纯化时都要将免洗柱的顶盖移开并将柱子直立置于合适的架子或夹子上
3.2参照表1，根据使用情况来决定谷胱甘肽交联琼脂糖4B床体积
3.3轻轻晃动谷胱甘肽交联琼脂糖4B使凝胶重新悬浮
3.4根据要求向酶mL床体积中用移管加入1.33mL初始的谷胱甘肽交联琼脂糖4B匀浆
3.5轻拍柱子除去凝胶床中存在的气泡，使沉降完成。

3.6移去底盖，以备后用。

（由于柱子缺少一个可重复利用的底盖，因此降封底折断。

Parafilm TM在其后的步骤中可代替底盖）
3.7用10mL4℃的1xPBS冲洗由每1.33初始谷胱甘肽交联琼脂糖4B匀浆配制的谷胱甘肽交联琼脂糖4B，将底盖重新放置好或用Parafilm包裹柱子以避免凝胶干燥。

注：谷胱甘肽交联琼脂糖4B必须用1xPBS彻底洗净以除去20%乙醇贮存液。

残余乙醇会对随后的步骤产生影响。

注：用1xPBS平衡的谷胱甘肽交联琼脂糖4B可在4℃保存一个月
P13
结合
3.8用吸管将超声破碎的细菌涂于柱上的凝胶上，此时谷胱甘肽交联琼脂糖4B柱子已经干燥并已平衡过
注：如果需要的话在将超声破碎物涂于柱上前可先用0.45μm的滤孔过滤
3.9将Parafilm底盖移去，使破碎物能顺利流过。

注：大部分的流过物可被丢弃，但可从中取样做SDS-PAGE或CDNB测定（参照GST检测模块，27-4590-01）以估计凝胶结合效率
3.10用10倍量的1xPBS洗柱子。

将柱子干燥，重复洗两次，使洗的次数达到三次
注：用谷胱甘肽洗脱缓冲液可直接将结合在凝胶上的蛋白洗脱下来（参照“自配材料”）。

如果需要的话，GST融合蛋白可能会裂解，裂解后的凝血酶、凝血因子Ⅹa 或PreScission TM蛋白酶仍然结合在凝胶上而感兴趣的蛋白从GST上游离出来。

如果pGEX的构建中包含有凝血酶的识别序列请参照附录4。

GST基因融合蛋白系统手册中有详细步骤。

参见Amersham BioSciences文件18-1157-58
3.11当有结合蛋白柱洗完并干燥后，将底盖重新安置好或由Parafilm包好
P14
洗脱
3.12向每mL床体积中加入1mL谷胱甘肽洗脱缓冲液将融合蛋白洗脱，将柱室温下放置10分钟以洗脱融合蛋白
3.13将底盖或Parafilm移去，将洗脱物收集起来，其中包含有融合蛋白
3.14重复洗脱及收集步骤两次，将三次洗脱物收集起来
注：按此洗脱步骤，会有大量蛋白仍会结合在凝胶上，因此步同蛋白融合的洗脱时间及体积会有很大的变化。

也许需要额外的洗脱。

洗脱物可用SDS-PAGE或CDNB 检测GST蛋白（GST测定模块，27-4590-01）
注：融合蛋白的产量可由280nm处的吸光度估量，对GST亲和标记，
1A280≈0.5mg/ml
注：蛋白质的产量同样可用标准显色方法测定（如：Lowry、BCA、Braford等）如果使用Lowry或BCA类似的方法，样品不必须用2000体积的1xPBS透析以除去谷胱甘肽，后者会干扰蛋白质的测量，而Braford法可在谷胱甘肽存在的条件下使用
P15
附录1
谷胱甘肽交联琼脂糖4B的特点
配体浓度：每mL凝胶7.15μmol谷胱甘肽
容量：每毫升干燥凝胶，可容纳多于8mg重组GST
珠式样：球形，湿直径45-165μm
隔离臂：12原子（10个碳原子）
化学稳定性：室温下谷胱甘肽交联琼脂糖4B与0.1M柠檬酸盐（pH4.0），0.1M NaOH，70%乙醇或6M盐酸胍接触2小时后并未检测到显著的容量损失。

与1%SDS 接触14天后也未见结合能力的显著损失。

最大工作压：7.845kpa,0.075巴
最大容积流速：HR16/10柱（5cm高）室温下水溶性缓冲液，2.5ml/min（运行中）最大线形流速75cm/h（运行中）
P16
附录2谷胱甘肽交联琼脂糖4B的再生
1.用两倍床体积的0.1MtrisHCl和0.5MnaCl,pH8.5冲洗凝胶
2.用两倍床体积的0.1M醋酸钠+0.5MnaCl,pH4.5冲洗凝胶
3.重复上述步骤3-4次，使缓冲液交换循环次数达到4-5次
4.用3-5倍床体积的1xPBS重新平衡
如果凝胶结合能力出现下降，可能是由于一些沉淀的，变性的或非特性的结合的蛋白引起的。

为除去沉淀的或变性的蛋白，可用2倍床体积的6M盐酸胍冲洗凝胶，并立即用5倍床体积的1xPBS冲洗
为除去疏水性结合物质，可用3-4倍床体积的70%的乙醇或2倍床体积的非离子洗涤剂（浓度为0.1%）洗凝胶，并立即用5倍床体积的1xPBS洗凝胶当需要长期贮藏时（>1个月）建议按下列额外进行冲洗。

1.用10倍床体积的1xPBS冲洗凝胶两次
2.用70%的乙醇洗
3.4℃贮存
4.使用前用1xPBS重新平衡。

P17
附录3
广域细菌超声破碎的准备
pGEX载体含有lacI q基因，故用于质粒增殖或融合蛋白表达的宿主不需要由特殊的要求。

而大肠杆菌BL21[F-,ompT,bsdS(r B-,m B-),gal]（3，4）携带有pGEX载体，该菌株可推荐用于GST融合蛋白的表达。

BL21转化不是很好，因此替代菌株（如JM105）可推荐用于质粒的保存。

在大规模（量程）纯化前，应先测试培养基种蛋白的表达情况，或者可以做一些小的试验性的实验以确定蛋白表达的最佳条件。

融合蛋白的表达可在细菌生长或诱导过程中用SDS-PAGE或根据GST检测模块（27-4590-01）测量GST活性的方法来进行监测。

在实验过程中每个关键步骤中都应保留一些小样本以用于对纯化方法的分析。

1．使用以含有重组pGEX质粒的大肠杆菌单一菌落在2xYTA培养基中培养2~100ml。

（参见未供给材料）。

2．37℃下，有力摇动下培养12~15小时
3．将培养基用预热的2xYTA的培养基按1：100的比例稀释并分装到大小合适的烧瓶中20~30℃条件下摇晃培养直至A600值达到0.5~2
注：为保证足够通气量，每个烧瓶只加入20-25%容量的量。

（如100ml烧瓶中加入20ml）
注：选择最佳诱导生长温度喝A600值，不同融合蛋白见的差距很大。

P18
4．加入100mMIPTG,使终浓度为0.1mM并继续培养2~6小时
5．将培养液转移至合适离心管或离心瓶中，7700xg（如贝克曼JA20 8000rpm）4℃离心10分钟，使细胞沉淀。

6．弃上清，使沉淀干燥，置于冰上。

7．用吸管将细胞沉淀悬浮于冰浴过的1xPBS（每ml培养基50μl）
8．根据悬浮体积置于合适（专用）超声破碎仪上分裂悬浮，细胞在冰上短时超声裂解，保留超声破碎少量样品用于SDS-PAGE分析。

注：细胞破裂可将悬浮液部分清洗来显示，或用显微检查进行检测，同时应避免起泡，以防融合蛋白变性，过度超声破碎会导致宿主蛋白和GST融合蛋白共同纯化出来。

注：在此步中GST活性可用CDNB分析进行监测。

这是项有用的筛选技术并能提供蛋白表达已经足够的证明从而可用于修正随后的步骤（见GST监测模块，27-4590-01）
9．加20%的Triton X-100使种浓度为1%轻轻混合30分钟使融合蛋白溶解。

10.4℃，12000 x g离心10分钟（如1000rpm，贝克曼JA20），将上清液转至洁净容器中，保留上清液和细胞沉淀碎片的小样本做SDS-PAGE分析，这样样本可用于鉴定含融合蛋白的组分。

11.按操作规程2或操作规程3继续操作。

P19
GST融合蛋白的凝血酶裂解
在下面的步骤中样品要在不同时间点取样并做SDS-PAGE分析以确定其产量，纯度及凝血酶消化程度。

不同的GST融合蛋白完全消化所需凝血酶的量，培养温度及时间也应有相应的变化。

总的来说，以10裂解蛋白单位/毫克融合蛋白的比要完全裂解需要过夜处理。

需做试验性实验以确定不同种类融合蛋白裂解的最佳条件。

某些应用中，（裂解后）应利用层析法将样品中的凝血酶除去。

洗脱后GST融合蛋白的裂解
在多数情况下，所感兴趣的蛋白的伴随融合蛋白也保留有功能活性，故可将连有GST的完整蛋白做功能测试。

如果必须将GST亲和尾巴除去，含有凝血酶识别位点的融合蛋白可直接按下列步骤在溶液中裂解：
1.批量纯化或柱纯化洗脱后，向每毫克融合蛋白中加入10μL的凝血酶溶液（10个单位，“自配材料”来准备）
2.轻轻混合，并在室温下（22-25℃）培育2-16小时。

3．？？？
P13
连接于块基质上的融合蛋白的裂解
1.按下准备凝血酶反应物：每毫升谷胱甘肽交联琼脂糖床体积中将50μL重悬凝血酶（按“自配材料”所描述地去准备）和950μL1xPBS混合起来。

2.向由操作规程2得到地谷胱甘肽交联琼脂糖小球中加入凝血酶反应混合物，轻微旋
转混合后室温下摇动匀浆2-16小时
3.混悬液500xg离心5分钟使交联琼脂糖珠沉淀下来
4.将洗脱物小心转移至一洁净试管中保存，其中含有所感兴趣的蛋白，而GST仍结合在凝胶上。

连接于柱基质上的融和蛋白的裂解
1.按上制备凝血酶反应混合物
2.将底盖重置于按操作规程3洗的柱上（或用Parafilm包裹），加入凝血酶反应混合物
3.将底盖或Parafilm从柱上出去使凝血酶反应混合物进入谷胱甘肽交联琼脂糖4B床，当液体从柱底流出时，盖上底盖或用Parafilm包好并使柱子于室温静置2-16小时
4.培育后将底盖或Parafilm移去并用一洁净试管收集洗脱物，向每毫升谷胱甘肽4B床体积中加入0.5mL，1xPBS并收集于含有洗脱物的同一试管中，其中含有所需蛋白，而GST仍旧结合于凝胶上。

P21
P22
疑问：无法从细菌超声破碎的SDS－PAGE凝胶考马斯染色中检测到蛋白
可能原因/解决方法
1.优化表达条件
表达条件的优化可显著提高产量。

请对菌株、介质条件、培养温度及诱导条件对融合蛋白产量的影响进行研究，不同融合蛋白的精确条件会有很大的差别
2.检查DNA序列
将在pPGE载体中合适翻译框架中的蛋白质编码DNA序列克隆出来是非常必要的。

克隆序列结合处用5΄pGEX编码引物（27-1410-01）和3΄pGEX编码引物来证明插入序列和GST序列都在框架中。

3.用SDS-PAGE分析一过夜培养的小样本。

总的来说，当5-10μL已诱导的A600约为1.0的培养物还在凝胶上时，高表达蛋白可很容易地由考马斯染色显示出来。

分别用来转化的大肠杆菌宿主细胞和由亲代pGEX载体转化的细胞平行跑胶以作为阳性和阴性控制。

融合蛋白在整个细胞制备过
程中存在而在超声破碎后不存在则预示着存在有包涵体（见下）
4.隐藏蛋白
免疫印迹法可用于蛋白的表达，一些融合蛋白在SDS-PAGE中可被一些具有相似分
子量大小的细菌蛋白掩盖起来。

在这种情况下可用免疫印迹法检出融合蛋白，按上所示，将诱导细胞跑SDS-PAGE，并将蛋白转移至硝酸纤维素或PVDF膜上，用抗GST 抗体，检测融合蛋白（参见GST检测模块；27-4590-01）
P23
问题：大部分蛋白存在于超声破碎后的沉淀物中
可能原因/解决方法
在细菌超声破碎制备中收集到的SDS-PAGE分析样本可能暗示这大部分GST融合蛋白都留在了超声破碎后沉淀中，可能原因及解决方法如下所示：
1．超声破碎不足，细胞破裂可由部分悬浮清除来说明或由显微观察检测到，在超声破碎前加入溶菌酶可能会使结果有所改观（0.1体积的10mg/ml的溶菌酶溶
于25Mm Tris-Hcl中，pH8.0）。

避免起泡，——这可能会引起融合蛋白变性，过度超声破碎可能会使宿主细胞蛋白与GST融合蛋白一起被纯化出来。

2．融合蛋白可能会不溶（包涵体）
如果在超声破碎后离心所得可溶物中找不到足够蛋白，则有必要改变一下生长培养条件。

——诱导过程中降低温度可使融合蛋白溶解度有显著提高，生长培养实验温度应在20-30℃范围内。

——降低IPTG的浓度至0.1mM以下改变诱导水平
——改变诱导时间
——在短时间内诱导
——短时间内高浓度细胞诱导
——增加空气流通，高氧气转移能放置包涵体形成
可将上述处理结合进行，其它条件（改变）则可根据经验及不同融合蛋白决定采用。

如果上述技术仍无法使可融合表达有显著提高，则可用一般变性剂由包涵体溶解得到，这些变性剂诸如4－8M尿素，去污剂，碱性pH（>9）,有机溶剂（8，9）及
N－十二烷基肌氨酸（Sarkosyl）（10，11）其它可变的影响溶解度的因素还有时间、温度离子强度、蛋白变性比及硫醇试剂的存在等。

回顾时可参照参考资料5.8.9及12溶解后，蛋白质必须从合适（构象）折叠以恢复活性。

可由裂解稀释或凝胶过滤以除去变性，使蛋白重新折叠并形成正确的分子内缔合，折叠中决定性的参数包括pH，硫醇试剂的存在及去变性速度。

一旦重折叠完成，可由离子交换层析，凝胶过滤层析及亲和层析对蛋白进行纯化。

变性的融合蛋白可纯化至某一程度，在GST融合蛋白形成包涵体的一些情况下，在2-3M盐酸胍或尿素及最多2％的吐温20存在下，（融合蛋白的）溶解和结合到谷胱甘肽交联琼脂糖4B可（顺利）完成。

P25
疑问：融合蛋白无法结合于谷胱甘肽交联琼脂糖4B上。

1．结构改变
由检测母本PGEX的GST结合能力，制备合母本PGEX质粒的细胞超声破碎片并检查其与凝胶结合能力，如果由母本质粒得到的GST（与凝胶）有高度亲和力，说明融合蛋白那部分改变了GST的构象，从而降低其亲和力，将结合温度降至4℃，并减少冲洗次数可得到足够/合适的结果。

2．超声破碎使融合蛋白变性。

过量超声破碎会使融合蛋白变性并使其难以结合于谷胱甘肽交联琼脂糖4B上，因此在细胞裂解中采用温和的条件。

3．细胞裂解前加入TT
在细胞裂解前加入终浓度为5mM的DTT可显著提高某些GST融合蛋白与谷胱甘肽交联琼脂糖4B的结合能力。

4．使用新鲜的谷胱甘肽交联琼脂糖4B
如果谷胱甘肽交联琼脂糖4B已使用多次，则有必要使用新鲜的凝胶，细节参见附录2。

P26
问题1 融合蛋白不能从谷胱甘肽交联琼脂糖4B上有效洗脱
可能原因/解决方法
1．洗脱时间不够
某些情况下，室温或4℃过夜洗脱效率最高
2．洗脱缓冲液不够
增加洗脱缓冲液的体积
对于超过2Ｘ107道尔顿分子量（蛋白）谷胱甘肽交联琼脂糖4B可作为凝胶过滤介质而起作用，小（分子量）蛋白（尤其是那些被特异点蛋白酶裂解后游离出来的蛋白需要大洗脱体积，在这种情况下，应予使用批量纯化（参见操作规程2）由大体积洗脱的蛋白应由超滤进行浓缩
3．谷胱甘肽不足
增加洗脱缓冲液终谷胱甘肽的浓度。

一般的操作规程中用5mM谷胱甘肽进行洗脱。

注意，在根据说明溶解时，洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度为10mM，而这浓度在大多情况下都已足够而其他降低（浓度）的谷胱甘肽需另制，如果谷胱甘肽浓度显著上升至15mM，必须提高缓冲液浓度，以保证合适的pH值（14）
4．低离子浓度
提高洗脱缓冲液的离子强度，向洗脱缓冲液中加入0.1－0.2M的NaCl可改进（洗脱）结果。

谨记疏水蛋白在高盐状态下会沉淀，这样的话，加入非离子清洁剂会改善结果（见P24）
有认使用交替洗脱缓冲液而取得良好结果，其组成是20mM谷胱甘肽，100mM Tris-HCl（pH8.0）和120mMNaCl（14）+㎜
P27
5.非离子疏水相互作用可能会导致融合蛋白在谷光甘肽交联琼脂糖4B无法溶解和洗脱（11）。

向缓冲液中加入非离子detergent。

非离子detergent能对结果有所改进。

加入0.1%的Triton X-100或是2%的N-octyl glucoside 能显著改进一些GST融合蛋白的洗脱（效果）。

疑问：凝血酶裂解不完全
可能原因/解决方法
1．凝血酶：融合蛋白比不正确。

请检查消化的融合蛋白的量。

调整凝血酶的量至10裂解单位/每mg融合蛋白。

2．孵育时间不足
如果融合蛋白在孵育过程中没有被凝血酶（完全）降解，则可增加反应时间至20小时并增加反应中凝血酶的量。

3．改变凝血酶位点
检查构建的DNA序列。

于已知序列比较，并确证凝血酶识别位点在克隆融合蛋白过程中没有改变。

疑问：凝血酶裂解后的SDS胶中有多条带出现
1．Proteolysis。

调查一下在凝血酶裂解前是否有多余的条带出现。

如果是的话，宿主细胞可能降解融合蛋白。

这种情况下，使用蛋白酶缺陷菌株，如BL21也许能解决该问题。

P28
2．融合蛋白可能含有凝血酶的识别位点。

凝血酶最佳的裂解位点有如下两种结构：
1）P3－P4－Pro－Arg/Lys·P1’－P2’ P3 和P4是疏水氨基酸而P1’和P2’是非离子氨基酸。

Arg/Lys·P1’键裂解。

例如：
P4 P3 Pro R/K ·P1’ P2’
A) Met Tyr Pro Arg ·Gly Asn
B) Ile Arg Pro Lys ·Leu Lys
C) Leu Val Pro Arg ·Gly Ser
在A的情况下，Arg·Gly键会被凝血酶很快地裂解。

在B中，Lys·Leu键被裂解。

C是在pGEX系列质粒载体中发现的凝血酶识别位点，Arg·Gly键被降解。

2）P2－Arg/Lys·P1’，P2或P1’是Gly。

Arg/Lys·P1’键被降解。

如：
P2 R/K ·P1’
A) Ala Arg ·Gly
B) Gly Lys ·Ala
在A中，Arg·Gly键被高效裂解。

在B中，Lys·Ala键被裂解。

检查融合部分序列以确定凝血酶识别位点的存在。

调整消化时间和温度可在想要的凝血酶位点进行选择性裂解。

如果条件调整无法解决问题，则可将插入（序列）再克隆至以pGEX Factor Xa 为基础的表达载体中。