P450_酶活性中心催化全氟烷基羧酸前体化合物的代谢转化路径研究

生态毒理学报
Asian Journal of Ecotoxicology
第18卷第3期2023年6月
V ol.18,No.3Jun.2023
㊀㊀基金项目:国家重点研发计划项目(2022YFC3902105);国家自然科学基金面上项目(22276020);工业生态与环境工程教育部重点实验室开
放基金(KLIEEE -21-01)
㊀㊀第一作者:常新(1998 ),女,硕士,研究方向为污染物的生物转化行为模拟预测,E -mail:********************* ㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:*************.cn
DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230202001
常新,于晓梅,傅志强.P450酶活性中心催化全氟烷基羧酸前体化合物的代谢转化路径研究[J].生态毒理学报,2023,18(3):55-67
Chang X,Yu X M,Fu Z Q.Investigation on transformation pathways of perfluorinated carboxylic acids precursors catalyzed by active species of P450enzymes [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(3):55-67(in Chinese)
P450酶活性中心催化全氟烷基羧酸前体化合物的代谢转化路径研究
常新,于晓梅,傅志强*
工业生态与环境工程教育部重点实验室,大连市化学品风险防控及污染防治技术重点实验室,大连理工大学环境学院,大连116024
收稿日期:2023-02-02㊀㊀录用日期:2023-04-06
摘要:P450酶催化的前体物质代谢转化是全氟烷基羧酸(PFCAs)重要的间接暴露途径,然而相关反应路径及产物尚不清楚㊂本研究以多氟烷基磷酸酯(PAP)㊁氟调聚磺酸(FTS)和氟调聚醇(FTOH)为模型前体,基于密度泛函理论(DFT)计算,揭示了P450酶活性中心(Cpd Ⅰ)催化PFCAs 前体的代谢反应机制㊂DFT 计算发现,3种前体经Cpd Ⅰ催化的烷基C α H 键羟基化及中间体脱烷基重排两步反应,被转化为氟调聚醛(FTAL)中间产物㊂FTAL 可再次被Cpd Ⅰ氧化,经醛基C H 键羟基化生成氟调聚羧酸(FTCA),与体外实验检测的产物一致㊂3种前体与Cpd Ⅰ的C α H 反应能垒依次为PAP <FTOH <FTS ,PAP 反应最容易㊂对比不同碳链长度的前体发现,PAP 分子链长越短,其与Cpd Ⅰ的羟基化反应能垒越低,更容易被转化为PFCAs ㊂
值得注意的是,反应中间体的预测水生急性毒性普遍强于母体及产物㊂本研究揭示了PFCAs 前体的P450酶促转化路径及产物,有望为PFCAs 的生物转化归趋㊁内暴露及健康风险预测奠定科学依据㊂关键词:全氟烷基羧酸;P450酶;生物转化;密度泛函理论;间接暴露;前体化合物文章编号:1673-5897(2023)3-055-13㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:A
Investigation on Transformation Pathways of Perfluorinated Carboxylic Acids Precursors Catalyzed by Active Species of P450Enzymes
Chang Xin,Yu Xiaomei,Fu Zhiqiang *
Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering (Ministry of Education),Dalian Key Laboratory on Chemicals Risk Control and Pollution Prevention Technology,School of Environmental Science and Technology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,China
Received 2February 2023㊀㊀accepted 6April 2023
Abstract :The metabolic conversion of precursors by P450enzymes represents a significant indirect exposure route for perfluoroalkyl carboxylic acids (PFCAs)in organisms,whereas the relevant pathways and products remain unknown.In this study,polyfluoroalkyl phosphate (PAP),fluorotelomer sulfonates (FTS),and fluorotelomer alco -hols (FTOH)were used as model precursors to reveal the metabolic mechanism of PFCAs precursors by the active center of P450enzymes (Cpd Ⅰ)using density functional theory (DFT).DFT calculations showed that the three
56㊀生态毒理学报第18卷
precursors are metabolized by CpdⅠinto a fluorotelomer aldehyde(FTAL)intermediate through a two-step reac-tion involving alkyl Cα H hydroxylation and dealkylation rearrangement of the hydroxylated intermediates.Sub-sequently,FTAL is further oxidized via formyl C H hydroxylation,leads to the formation of a fluorotelomer car-boxylic acid(FTCA),which is consistent with the experimentally detected product.The Cα H reaction energy barriers of the three precursors with CpdⅠfollowed the order of PAP<FTOH<FTS,suggesting that metabolism of PAP was the most parison of precursors with varying perfluorinated alkyl chain lengths revealed that shorter PAPs had lower hydroxylation barriers,thus were more readily metabolized to PFCAs.Notably,the predicted acute aquatic toxicities of the reaction intermediates were generally higher than their precursors and prod-ucts.This study elucidated the transformation pathway and products of PFCAs precursors by P450s,which is ex-pected to lay a scientific basis for assessing the biological fate,internal exposure and potential health risk associated with PFCAs.
Keywords:perfluoroalkyl carboxylic acids;cytochrome P450enzymes;biotransformation;density functional theo-ry;indirect exposure;precursor compounds
㊀㊀全/多氟烷基类物质(PFASs)已成为国际社会广泛关注的一类新污染物㊂根据经济合作与发展组织(OECD)的最新定义,PFASs是至少含有一个
CF
3 或 CF2 (不含任何H/Cl/Br/I原子)的含氟化合物[1]㊂PFASs分子热稳定好,且疏水疏油,因此常作为添加剂应用于防火材料㊁防水面料和不粘锅涂层等产品[2]㊂其中,全氟烷基羧酸(PFCAs)是一类典型的PFASs㊂PFCAs是典型的环境持久性㊁生物蓄积性㊁有毒(PBT)化学物质:一些PFCAs的环境降解半减期高达半年以上[3],在环境及生物介质中广泛检出[4],如在我国20个沿海城市饮用水中检出PFCAs的总浓度为39.8~127mg㊃L-1[5];PFCAs在水生食物链/网中产生生物累积和放大效应[6];活体动物实验和流行病学研究表明,PFCAs可能破坏人体免疫功能,产生甲状腺毒性㊁肝毒性,还会影响生殖发育,甚至引发癌症[7]㊂因此人和生物体暴露PF-CAs的途径及风险值得关注㊂
PFCAs暴露来源大致分为2类:饮食摄入㊁皮肤接触等直接来源,以及经PFCAs前体代谢转化的间接来源[8]㊂研究表明,前体代谢转化可贡献PF-CAs整体暴露的60%[9]㊂氟调聚醇(FTOH)㊁多氟烷基磷酸酯(PAP)和氟调聚磺酸(FTSA)是常见的PF-CAs前体㊂FTOH是生产表面活性剂和防污聚合物的中间体[10],被大量用于防雾剂产品中[11];PAPs多用于食品包装纸中的防油脂剂,而FTSA用于油漆㊁涂料和工业清洁产品[12]㊂细胞色素P450酶是生物体内转化PFCAs前体的主要酶系[13]㊂P450酶是以血红素为活性中心的蛋白酶,能够催化75%的药物代谢以及95%的生物氧化还原反应[14]㊂PFCAs前体的P450酶代谢转化可能产生毒性产物,如FTOH 经P450酶催化转化的中间产物(如醛类物质)对大鼠细胞的毒性显著增强[15]㊂因此研究P450酶催化的PFCAs前体代谢转化路径及动力学对评价其生物暴露途径及毒性风险具有重要意义㊂
研究表明,PAP,FTOH及FTS等前体在生物体内可被P450酶转化为PFCAs,然而相关的反应路径及产物尚不清楚㊂例如,Zhao等[16]在粗P450酶提取液中加入6:2氟调聚磺酸(6:2FTSA),检测到代谢产物全氟戊酸(PFPeA)和全氟己酸(PFHxA)等PF-CAs㊂Zhao等[17]使南瓜暴露于6:2FTSA并添加P450酶抑制剂氨基苯并三唑,发现PFCAs浓度降低,表明P450酶参与6:2FTSA的生物转化过程,可将其转化为PFCAs㊂Li等[18]研究了8ʒ2FTOH在人体重组P450酶中的离体代谢过程,观测到8ʒ2 FTAL产物,而在大鼠肝微粒体中6ʒ2FTOH的主要代谢产物为6ʒ2FTCA[19]㊂Rand和Mabury[20]使大鼠口服暴露6ʒ2diPAP,在肝脏中发现代谢产物PF-HxA㊂总体上,PFCAs前体的P450酶促转化产物各有差异,不同前体分子官能团结构(如磷酸基㊁磺酸基和羟基等)对反应活性的影响尚不清楚,不同碳链长度PFCAs前体的反应特征差异也有待研究㊂基于活体㊁离体实验难以检测高反应活性的中间产物,且逐一测试种类众多的PFCAs前体花费大㊁周期长㊂相比之下,量子化学计算方法可以阐明电子结构特征,揭示反应路径,在环境有机污染物代谢研究方面发挥着重要作用㊂前人基于量子力学密度泛函理论(DFT)计算,成功阐明了P450酶催化典型外源化合物的代谢机制[21],如农药(狄氏剂)[22]㊁抗
第3期
常新等:P450酶活性中心催化全氟烷基羧酸前体化合物的代谢转化路径研究57
㊀生素(替达霉素)[23]以及酚类抗氧化剂(丁羟基茴香醚和二丁基羟基甲苯)[24]等㊂
P450酶活性中心卟啉环π轨道上存在单电子,形成最低非占据分子轨道(LUMO)㊂根据前线分子轨道理论,当与底物发生代谢反应时,LUMO 轨道会捕获底物中最高占据分子轨道(HOMO)的电子㊂DFT 计算时通常建立三维团簇模型来模拟酶活性中心及底物分子,通过模型定义的原子类型和坐标,近似求解薛定谔方程(Schr ödinger equation)并进行电子布居分析(population analysis),获得体系的电子轨道分布与势能极小值㊂由此构筑体系势能随反应坐标变化的势能剖面,结合过渡态理论,实现电子转移模式及产物结构预测的目的㊂在此基础上,通过产物分子的理化性质(如辛醇水分配系数),借助定量构效关系模型软件(如ECOSAR)预测其水生急性毒性,考察代谢转化对底物毒性的影响㊂
因此,本研究以6ʒ2FTOH,6ʒ2PAP 和6ʒ2FTS 为前体模型化合物,采用DFT 计算,揭示P450酶活性中心催化不同PFCAs 前体的转化反应㊂上述3种前体在环境介质及生物体内检出率较高,且具有部分代谢实验研究,相关结果可作为计算结果的佐证㊂研究阐明了PFCAs 前体转化生成PFCAs 的内暴露途径,发现不同结构前体的P450酶促转化存在动力学差异,分子氢键及氟代碳链长度可能对反应能垒及产物产生影响,结果为阐明PFCAs 的生物归趋㊁暴露及健康风险奠定科学依据㊂
1㊀材料与方法(Materials and methods )1.1㊀计算模型
使用简化的团簇模型Compound I (Cpd Ⅰ)模
拟P450酶活性中心,结构如图1所示㊂Cpd Ⅰ由铁-卟啉环(血红素去除烷基侧链的简易结构),轴向的
Fe
O 键及巯基配体(模拟半胱氨酸配体)构成㊂虽然不同物种㊁不同亚型的P450酶蛋白结构存在差异,但本质上均共有类似的血红素活性中心㊂因此在相对精确的DFT 计算水平下处理P450酶活性中心,不仅能有效回答酶反应中局部构型和电子结构等问题,也可提供反应途径的细节㊂理论研究已经证实采用Cpd Ⅰ模型阐明P450酶催化反应机制,具有较高的可靠性[25-27]㊂基态的Cpd Ⅰ包含3个单电子,其中2个自旋向上的单电子位于Fe
O
的π反键轨道上,另一个单电子位于卟啉环的a 2u 轨道上,自旋向上或向下都有可能,分别对应高自旋(HS)四重态及低自旋(LS)二重态,形成了2个能量简并的自旋态[28]㊂
本研究中,考虑了Cpd Ⅰ模型2种自旋状态下
催化3种PFCAs 前体转化的分子机制㊂FTOH,PAP 和FTS 的分子结构如图1所示,由全氟代烷烃连接亚甲基及相应的官能团构成㊂由于磷酸及磺酸根属于强酸基团,采用半经验软件MOPAC 预测得到6ʒ2FTS 和6ʒ2PAP 的解离常数(p K a)分别为-2.83和-0.16[29-30],表明这2种前体在生理环境下完全电离,因此采用阴离子态底物进行模拟计算
㊂
图1㊀本研究采用的P450酶活性中心模型(化合物Ⅰ)及底物(6ʒ2PAP ,6ʒ2FTOH 和6ʒ2FTS )结构图
Fig.1㊀Structures of the active center model of P450enzymes (Cpd Ⅰ)and substrates
(6ʒ2PAP,6ʒ2FTOH and 6ʒ2FTS)used in this study
58
㊀生态毒理学报第18卷
1.2㊀反应途径猜测
根据已有的烷烃羟基化反应的机制研究[21],推
测3种PFCAs 前体与Cpd Ⅰ的反应可能遵循以下路径(图2):(a)Cpd Ⅰ催化前体分子的C α和C β位氢原子转移(HAT)形成中间体;(b)中间体经羟基反弹生成醇产物,醇产物在非酶环境下可发生氢转移
分子内重排过程;(c1)羟基化6ʒ2PAP 脱磷酸基生成6ʒ2FTAL 和磷酸二氢根(H 2PO -4);(c2)羟基化6ʒ2
FTS 通过脱磺酸基生成6ʒ2FTAL 和亚硫酸氢根离
子(HSO -3);(c3)羟基化6ʒ2FTOH 通过分子内重排脱
水生成6ʒ2FTAL ㊂
1.3㊀密度泛函理论(DFT)计算方法
所有计算在Gaussian 09软件包中进行[31]㊂因
为反应是开壳层体系,使用非限制的B3LYP 泛函结合2种基组进行计算㊂优化几何构型时采用基组LACVP(Fe)/6-31G*(C,H,O,N,S,F,P),记作B1㊂单点能(SPE)的计算采用了更高水平的基组LACV3P +*(Fe)/6-311+G**(C,H,O,N,S,F,P),记作B2㊂经典的B3LYP 泛函没有考虑色散弱作用对反应的影响,因此使用DFT -D3来校正色散能量的影响[32]㊂在B1水平上进行频率计算以表征过渡态并获得零点能量(ZPE)㊂以上泛函和基组在P450酶催化转化外源
化合物计算研究方面被证实是有效的[24,33-34]㊂
计算得到的过渡态构型有且仅有一个虚频,且
沿反应坐标方向振动,并通过内禀反应坐标(IRC)计算得到了验证,其它能量极小值点优化构型无虚频㊂使用隐式溶剂化模型SMD 模拟体系的溶剂效应,采用氯苯溶剂(介电常数为5.6)模拟酶环境,水溶剂模拟非酶环境(介电常数为78.4)㊂势能面图采用UB3LYP/B2//B1水平的相对SPE 能量(包含ZPE 和色散能量校正)构建㊂2㊀结果(Results )
2.1㊀不同PFCAs 前体的反应路径
计算结果表明,Cpd Ⅰ与6ʒ2PAP 首先形成反
应复合物(RC),而后Cpd Ⅰ的氧原子摘取烷基C H 键的氢原子,经反应过渡态(TS),并伴随羟基反弹过程,生成羟基化产物PC H α㊂由图3可知,摘氢反
应是该反应的速率控制步骤,而羟基反弹是无垒的㊂
P450酶催化的C H 键羟基化有2种可能的反应机制:自旋选择反应机制(SSM)和双态反应机制(TSR)[35],计算发现6ʒ2PAP 的C β H 羟基化反应在二㊁四重态上的整体反应能垒接近,遵循TSR 机制[36],而C α H 羟基化反应遵循SSM 机制,
与氨图2㊀6ʒ2PAP ,6ʒ2FTS 和6ʒ2FTOH 被P450酶活性中心(化合物Ⅰ)催化转化反应的可能路径
注:HAT 代表氢原子转移,R 代表 C 6F 13基团,紫色区域表示酶环境下的反应过程,绿色区域表示非酶环境下的反应过程㊂
Fig.2㊀Possible pathways for the transformation of 6ʒ2PAP,6ʒ2FTOH and 6ʒ2FTS catalyzed by the active species
of cytochrome P450enzymes (Cpd Ⅰ)
Note:HAT represents hydrogen atom transfer,and R represents C 6F 13group;the purple region represents the reaction process in the enzymatic
environment,while the green region represents the reaction process in the non -enzymatic environment.
第3期
常新等:P450酶活性中心催化全氟烷基羧酸前体化合物的代谢转化路径研究59
㊀
图3㊀Cpd Ⅰ催化6ʒ2PAP 转化生成6ʒ2FTCA 的反应能量及中间物种构型图
注:(a)显示Cpd Ⅰ催化6ʒ2PAP 羟基化反应过程;(b)显示6ʒ2PAP 羟基化产物
P O 辅助的氢转移重排过程;(c)显示6ʒ2PAP 羟基化产物P O 辅助的氢转移重排过程;(d)显示Cpd Ⅰ催化6ʒ2FTAL 的羟基化反应过程;X 基团表示 C 6F 13,括号内为四重态值,键长单位为
Å(0.1nm),键角单位为(⇵),振动频率为i cm -1,能量单位为kcal ㊃mol -1(1kcal =4.1859kJ)是酶反应能垒常用的量纲㊂
Fig.3㊀Optimized geometries of the key species and reaction barriers for the transformation of 6ʒ2PAP
to 6ʒ2FTCA catalyzed by Cpd Ⅰ
Note:(a)Displays the hydroxylation process of 6ʒ2PAP catalyzed by Cpd Ⅰ;(b)Displays the
P O assisted H -transfer rearrangement of
the hydroxylated 6ʒ2PAP;(c)Displays the P O assisted H -transfer rearrangement of the hydroxylated 6ʒ2PAP;and (d)Displays the hydroxylation process of 6ʒ2FTAL catalyzed by Cpd Ⅰ;the X group represents C 6F 13,quartet state values are in parentheses,
bond distances are in angstroms (Å,i.e.0.1nm),angles in degrees (ʎ),vibrational frequencies (ν)in i cm -1and energy in kcal ㊃mol -1(1kcal =4.1859kJ)that is the common scale of enzyme reaction energy barriers.
60
㊀生态毒理学报第18卷
基相连的C α H 羟基化过程类似[37],可能是由于
C α H 靠近富电子的磷酸基团[38-39]㊂从反应构型上看,过渡态时øC H O 分别为166.5ʎ和166.6ʎ,几乎呈直线㊂随着反应进行,Fe O 距离伸长(由1.63到1.68Å,0.163~0.168nm),Fe S 距离缩短(由2.58到2.45Å,0.258~0245nm),上述反应结构特征与前人报道的Cpd Ⅰ催化烷烃摘氢反应路径相符[40]㊂
比较不同反应位点发现,C β H 摘氢反应能垒
为10.7kcal ㊃mol -1(二㊁四重态平均值,1kcal =
4.1859kJ)显著高于C α H 位点(3.3kcal ㊃mol -1,1
kcal =4.1859kJ),这可能是因为C β H 相比C α H
更靠近碳氟长链,而 C 6F 13的强吸电子作用导致C β H 位点的电子密度降低,电荷量增大,使其反应活性降低㊂电荷分析结果表明,C β H 位点电荷
Q H βʈ0.42,高于C α H 位置电荷Q H αʈ0.34(均为
二㊁四重态的均值)㊂由表1可知,Cpd Ⅰ催化的6ʒ2PAP 羟基化反应是一个双电子转移过程,底物上的电子首先转移到
Fe O 的π轨道上(ρFe+O 由2.11到1.57,ρsub 由0到0.56),使得Fe Ⅳ变为Fe Ⅲ,此时卟啉环上仍存在单电子(ρpor+SH ʈʃ1),会接受底物上转移的第2个电子(ρsub 由0.56到0,ρpor+SH 由ʃ1到0),完成催化氧化过程㊂
研究表明,羟基化产物由于极性增强,较容易脱
离活性空腔,进入非酶环境[41]㊂此时,由于氢键作用,醇羟基氢原子会转移到P
O 键的氧(图3(b))
或P O 的氧原子(图3(c))上,引发C O 键断裂,生成6ʒ2氟调聚醛(6ʒ2FTAL)和磷酸二氢根
(H 2PO -4)离子㊂计算结果显示,氢原子更容易转移到
P O 的氧原子上,该反应能垒低于P O 介导的
氢原子迁移过程㊂生成的6ʒ2FTAL 会进一步与Cpd Ⅰ发生醛基C H 键摘氢反应(图3(d)),经羟基反弹后生成6ʒ2氟调聚羧酸(6ʒ2FTCA)㊂计算发现,反应能垒四重态(11.5kcal ㊃mol -1,1kcal =
4.1859kJ)显著高于二重态(6.3kcal ㊃mol -1,1kcal =4.1859kJ),表明该反应具有自旋选择性,更容易在二重态上发生㊂Chai 等[33]通过DFT 计算得到Cpd Ⅰ氧化醛生成羧酸的反应能垒为8.5kcal ㊃mol -1
(1kcal =4.1859kJ),高于本研究的计算能垒,可能由于 C 6F 13基团的吸电子作用,使得C H 键变弱,能垒降低㊂Chen 等[42]使鲤鱼暴露于diPAP ,在肝脏中检出了FTCA 产物,侧面证实了本研究的计算结果㊂
类似地,Cpd Ⅰ与6ʒ2FTS 也可能在C α H 和
C β H 位点发生摘H 反应,生成碳中心自由基和Fe OH 中间体(IM),而后反应路径在不同位点有所差别(图4(a)):在C β H 位点,IM 经过无垒的羟基反弹生成醇产物;而在C α H 位点,除了羟基反弹之外,IM 还可能发生二次摘氢反应,摘取邻碳上
表1㊀Cpd Ⅰ催化6ʒ2PAP 羟基化反应过程中关键物种的密立根自旋密度和原子电荷
Table 1㊀Mulliken spin densities and charges for the key species in the hydroxylation
of 6ʒ2PAP catalyzed by Cpd Ⅰ
自旋密度(ρ)Spin densities (ρ)
原子电荷(Q )Charge (Q )
Fe
O SH a Por b Sub c H Fe O SH Por Sub H 2RC H β 1.250.86-0.32-0.790.000.000.44-0.43-0.250.22-1.150.174RC H β 1.110.900.250.730.000.000.43-0.43-0.260.24-1.220.232TS H β 1.050.52-0.15-0.890.56-0.080.32-0.63-0.230.20-1.080.424TS H β0.940.580.170.810.59-0.080.32-0.63-0.230.20-1.080.422PC H β 1.170.00-0.07-0.100.000.000.22-0.64-0.05-0.39-0.630.484PC H β 2.970.010.03-0.010.000.000.46-0.64-0.19-0.44-0.670.472RC H α 1.260.85-0.31-0.810.000.000.44-0.43-0.260.23-1.160.184RC H α 1.130.890.260.720.000.000.43-0.44-0.240.25-1.150.152TS H α 1.600.20-0.15-0.24-0.39-0.010.43-0.53-0.18-0.16-0.880.314TS H α 1.380.710.240.120.56-0.010.41-0.57-0.13-0.17-0.900.362PC H α 1.130.00-0.05-0.080.000.000.20-0.67-0.06-0.40-0.570.514
PC H α
2.60
0.01
0.37
0.02
0.00
0.00
0.46
-0.66
-0.29
-0.32
-0.66
0.47
注:a 代表巯基配体;b 代表除Fe 原子外卟啉环;c 代表底物6ʒ2PAP ㊂
Note ʒa represents the thiol ligand;b represents the porphyrin ring except for the Fe atom;c represents the substrate 6ʒ2PAP.
第3期
常新等:P450酶活性中心催化全氟烷基羧酸前体化合物的代谢转化路径研究61
㊀氢原子,生成6ʒ2氟调聚不饱和磺酸(6ʒ2FTUSA)㊂Yang 等[43]在培养菌株(RHA1)时加入6ʒ2FTSA 作为硫源,发现RHA1生长过程中P450酶高度表达,并检测到6ʒ2FTUSA 代谢产物,与本研究预测的产物吻合㊂计算发现,在非酶环境下,生成的醇产物也可能发生分子内氢转移重排,醇羟基氢原子通过氢键作用,转移到磺酸基团的氧上,引发C S 键断
裂,生成6ʒ2FTAL 和亚硫酸氢根离子(HSO -3)㊂同
样地,水分子可以催化该过程,使反应能垒降低1.6kcal ㊃mol -1(1kcal =4.1859kJ)(图4(b))㊂
由图5可知,Cpd Ⅰ与6ʒ2FTOH 可能有3个
反应位点,即C α H,C β H 和醇羟基H ㊂结果发现,相比于其他2个位点,Cpd Ⅰ催化的醇羟基摘氢是反应的优势路径,能垒为14.8kcal ㊃mol -1(1kcal =
4.1859kJ),其次为C α H 位点㊂反应生成氧中心自由基和Fe OH 中间体(IM),而后Fe OH 进一步摘取C α H 形成6ʒ2FTAL 和H 2O ㊂C α H 和C β H 位点发生摘氢反应后,伴随着无能垒的OH 反弹过程,生成二醇产物㊂值得注意的是,C α H 位点摘氢反应产物为偕二醇,
可经过脱水反应生成图4㊀Cpd Ⅰ催化6ʒ2FTS 转化生成6ʒ2FTAL 的反应能量及中间物种构型图
注:(a)显示Cpd Ⅰ催化6ʒ2FTS 转化生成6ʒ2FTUSA 反应过程;(b)显示6ʒ2FTS 羟基化产物S O 辅助的氢转移重排过程;(c)显示水分子催化的6ʒ2FTS 羟基化产物S O 辅助的氢转移重排过程;X 基团表示 C 6F 13,括号内为四重态值,键长单位为Å(0.1nm),键角单位为(⇵),
振动频率为i cm -1,能量单位为kcal ㊃mol -1(1kcal =4.1859kJ)是酶反应能垒常用的量纲㊂
Fig.4㊀Optimized geometries of the key species and reaction barriers for the transformation
of 6ʒ2FTS to 6ʒ2FTAL catalyzed by Cpd Ⅰ
Note:(a)Displays the transformation of 6ʒ2FTS to 6ʒ2FTUSA catalyzed by Cpd Ⅰ;(b)Displays the S O assisted H -transfer rearrangement of the hydroxylated 6ʒ2FTS;(c)Displays the S O assisted H -transfer rearrangement of the hydroxylated 6ʒ2FTS with the assistance of water;the X group represents C 6F 13,quartet state values are in parentheses,bond distances are in angstroms (Å,i.e.0.1nm),angles in degrees (ʎ),vibrational frequencies (ν)in i cm -1and energy in kcal ㊃mol -1(1kcal =4.1859kJ)that is the common scale of enzyme reaction energy barriers.
62㊀生态毒理学报第18
卷
图5㊀CpdⅠ催化6ʒ2FTOH转化生成6ʒ2FTAL的反应能量及中间物种构型图注:(a)显示CpdⅠ催化6ʒ2FTOH转化生成6ʒ2FTAL反应过程;(b)显示偕二醇产物脱水重排过程;(c)显示水分子辅助偕二醇产物脱水重排过程;X基团表示 C6F13,括号内为四重态值,键长单位为Å(0.1nm),键角单位为(⇵),振动频率为i cm-1,能量单位为kcal㊃mol-1
(1kcal=4.1859kJ)是酶反应能垒常用的量纲㊂
Fig.5㊀Optimized geometries of the key species and reaction barriers for the transformation of6ʒ2FTOH
to6ʒ2FTAL catalyzed by CpdⅠ
Note:(a)Displays the transformation of6ʒ2FTOH to6ʒ2FTAL catalyzed by CpdⅠ;(b)Displays the dehydration of the gem-diol;
(c)Displays the dehydration of the gem-diol with the assistance of water;the X group represents C6F13,quartet state values are in
parentheses,bond distances are in angstroms(Å,i.e.0.1nm),angles in degrees(ʎ),vibrational frequencies(ν)in i cm-1and energy in kcal㊃mol-1(1kcal=4.1859kJ)that is the common scale of enzyme reaction energy barriers.
醛㊂计算表明,直接脱水的反应能垒较高(图5(b)),相比之下,1个水分子催化的脱水反应容易发生(图5(c)),而脱水反应的能垒均高于酶催化的羟基化过程㊂由此可见,氟调聚醛是FTOH的P450酶代谢过程中的稳定中间产物㊂Li等[18]采用人重组P450酶研究8ʒ2FTOH的转化过程,也检测到了醛类产物,与本研究的计算结果一致㊂
2.2㊀氢键作用对反应的影响
值得注意的是,6ʒ2PAP的Cα H羟基化过程中,CpdⅠ氧原子可能受到6ʒ2PAP羟基的氢键影响(图6)㊂此时,由于氢键的稳定作用,RC的能量较低,过渡态反应能垒为6.8kcal㊃mol-1(1kcal= 4.1859kJ),高于没有氢键作用时的能垒(4.7kcal㊃mol-1)(1kcal=4.1859kJ)㊂可见,氢键的形成导致反应活性降低㊂此外,氢键的存在也改变了反应路
径,CpdⅠ摘取Cα H后,不再发生羟基回弹,而是进一步摘取磷酸根羟基的氢原子,实现了2个氢原
子的共同转移,伴随着O P键断裂,生成6ʒ2
FTAL,水和偏磷酸根离子(PO2-
3
)㊂可见,氢键的作用使得醛产物FTAL通过酶内反应直接生成㊂Zhang等[44]研究发现,胆固醇上羟基和CpdⅠ的氧形成氢键会显著影响摘氢反应能垒(增加了约2kcal
第3期
常新等:P450酶活性中心催化全氟烷基羧酸前体化合物的代谢转化路径研究63
㊀㊃mol -1,1kcal =4.1859kJ),与本研究计算结果一致[44]㊂可见,在P450酶促反应研究中,有必要考察分子间氢键对反应机制的影响㊂2.3㊀不同PFCAs 前体反应动力学差异
通过计算4ʒ2PAP,6ʒ2PAP,8ʒ2PAP 和4ʒ2FTS,6ʒ2FTS,8ʒ2FTS 以及4ʒ2FTOH,6ʒ2FTOH,8ʒ2FTOH 与Cpd Ⅰ反应速率控制步骤(氢原子转移反应)的能垒,考察了不同碳链长度对反应活性的影响㊂结果发现,随碳链长度增加,PAP 与Cpd Ⅰ反应的能垒升高(图7),反应变得愈发困难㊂Lee 等[45]使虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss )分别暴露于碳原子数为6㊁8和10的全氟烷基膦酸(PFPAs),发现随碳链长度增加,PFPAs 在鱼体内的代谢半减期增大,与本研究的动力学计算结果吻合㊂FTS 和FTOH 与Cpd Ⅰ反应的能垒随碳链长度增加有所差别,但未呈现线性规律㊂总体上看,计算得到的不同链长PAP,FTS,FTOH 反应的平均能垒(分别为4.57㊁14.1和10.3kcal ㊃mol -1
,1kcal =4.1859kJ)从大到
小依次为:氟调聚磺酸>氟调聚醇>多氟烷基磷酸酯,表明PAP 最易被转化成PFCAs ,其次为FTOH
和FTS ㊂Just 等[46]研究了PFCAs 前体在玉米根部的降解速率,发现PAP 降解速率高于FTOH ,与计算的反应动力学结果一致㊂
2.4㊀反应产物的生态毒性预测通过ECOSAR 软件[47]预测了PFCAs 前体及
P450转化中间体/产物对鱼的急性毒性(半数致死浓度(LC 50)),结果如图8所示㊂整体上随碳链增长,中间产物的毒性增强㊂Mitchell 等[48]检测了FTCA 对水藻的毒性,发现FTCA 毒性随着碳链长度的增加而增加,与ECOSAR 预测结果一致㊂此外,对碳链长度相同的PFCAs 来说,中间体(如FTAL)毒性显著强于前体化合物及产物㊂Rand 等[49]将PFCAs 中间体代谢物FTALs ㊁氟调聚物不饱和醛(FTUALs)㊁FT -CAs 和氟调聚物不饱和羧酸(FTUCAs)与人肝上皮细胞(THLE -2)一起孵育,发现中间体代谢物(FTALs,FTUALs,FTCAs 和FTUCAs)毒性与官能团有关,强弱顺序为:FTUALs ȡFTALs >FTUCAs ȡFTCAs >PFCAs ,与预测结果一致㊂因此,在PFCAs 的风险评估中,代谢中间体及产物的毒性值得关注㊂但当前体的疏水性较大时(如8ʒ2FTOH 和8ʒ2FTAL
的
图6㊀有无氢键作用时Cpd Ⅰ催化6ʒ2PAP C α—H 摘氢反应的能量过程图及关键中间物种的优化构型
注:X 基团表示 C 6F 13,括号内为四重态值,键长单位为Å(0.1nm),键角单位为(⇵),振动频率为i cm -1,
能量单位为kcal ㊃mol -1(1kcal =4.1859kJ)是酶反应能垒常用的量纲㊂
Fig.6㊀Optimized geometries of key species and reaction barriers for C α H abstraction of 6ʒ2PAP catalyzed
by Cpd Ⅰwith or without hydrogen bonding
Note:The X group represents C 6F 13,quartet state values are in parentheses,bond distances are in angstroms (Å,i.e.0.1nm),angles in degrees (ʎ),vibrational frequencies (ν)in i cm -1and energy in kcal ㊃mol -1(1kcal =4.1859kJ)that is the common scale of enzyme reaction energy barriers.
64㊀生态毒理学报第18卷
辛醇水分配系数log K
ow
预测值均>5),中间体的毒性反而小于前体,这可能是由于化合物分子量过大,难以跨膜进入生物体,导致其生物积累性及毒性减小㊂3㊀讨论(Discussion)
基于密度泛函理论计算,阐明了P450酶活性中心催化转化典型PFCAs前体的反应机制㊂结果发现FTAL是PFCAs前体P450酶代谢转化过程的共同中间产物㊂CpdⅠ先通过C H键羟基化将前体转化为醇中间体,而后经非酶环境分子内重排,脱除磺酸基/磷酸基/羟基生成FTAL,FTAL进一步与CpdⅠ发生二次转化生成FTCAs,相关产物得到体外实验的证实㊂发现前体化合物分子的磷酸基㊁磺酸基以及羟基可能通过给电子作用㊁氢键作用影响反应复合物或过渡态的稳定性,进而改变反应路径和产物㊂整体上,3种PFCAs前体被CpdⅠ转化反应存在动力学差异,反应的难易程度依次为FTS< FTOH<PAP㊂全氟碳链长度越长的PAP,CpdⅠ催化转化的能垒越高㊂
PFCAs前体的生物转化途径复杂,除P450酶催化氧化外,还涉及水解㊁氧化/还原脱氟等过程㊂例如,D Eon和Mabury[50]发现PAP在小鼠肠道中可水解生成FTOH㊂Martin等[51]将分离的大鼠肝细胞与8ʒ2FTOH一起孵育,检测到了脱氟反应产物8ʒ2FTUCA㊂FTCA脱氟矿化被认为是其代谢脱毒的重要途径[52]㊂因此,PFCAs前体的其他生物转化途径也值得关注㊂此外,PFCAs前体的生物转化是多种生物酶参与的过程㊂Li等[53]的研究表明,氟乙酸脱卤素酶(FAcD)可催化2-氟丙酸发生Cα F
键
图7㊀不同碳链长度全氟烷基羧酸(PFCAs)前体与化合物Ⅰ反应能垒(1kcal=4.1859kJ)
Fig.7㊀Calculated reaction barriers of perfluorinated carboxylic acids(PFCAs)precursors with different fluorocarbon
chain lengths catalyzed by CpdⅠ(1kcal=4.1859
kJ)
图8㊀PFCAs前体P450酶促转化中间体及产物的鱼水生急性毒性预测结果
注:红色区域表示剧毒,橙色区域表示有毒,黄色区域表示有害,绿色区域表示无害㊂
Fig.8㊀Predicted acute toxicity of fish for transformation intermediates and products of PFCAs precursors by P450s Note:The red region indicates very toxic,the orange region indicates toxic,the yellow region indicates
harmful and the green region indicates not harmful.
第3期常新等:P450酶活性中心催化全氟烷基羧酸前体化合物的代谢转化路径研究65
㊀
断裂㊂Peskett和Rand[54]研究发现,人肝脏S9以及
小肠细胞具有水解酶和氧化酶,使8ʒ2monoPAP发生转化生成PFCAs产物㊂因此需要研究其他生物酶催化转化PFCAs的反应,以全面揭示PFCAs的生物转化过程㊂
基于量子化学计算研究P450酶催化的PFCAs 前体代谢反应,虽可准确预测转化产物及反应机制,但在实际环境中,不同物种及亚型的P450酶活性中心处蛋白环境也存在差异,均可能对反应的动力学产生影响㊂这方面,量子力学/分子力学(QM/MM)多尺度模拟可以探究真实蛋白环境的影响,已成为研究酶化学反应的重要工具㊂Lonsdale等[55]通过QM/ MM计算发现双氯芬酸在过渡态时能与CYP2C9 Arg108侧链形成氢键,导致代谢实验产物与反应优势产物不同㊂Yadav等[56]基于QM/MM计算发现,不同亚型P450酶因活性中心附近残基差异导致脂肪酸转化产物不同,P450
BSβ
通过常规的反弹机制生
成羟基化产物,P450
OleT
通过去羧基化生成烯烃产物㊂未来考虑使用QM/MM方法,以探究PFCAs前体在真实酶环境下的转化反应过程及影响因素㊂
获取种类众多PFASs物质的毒代动力学参数
(如肝脏固有清除率CL
int
)是评价其生物积累及毒性的前提㊂由于计算理论及效率的限制,基于量子力学的方法难以直接计算上述参数㊂考虑到P450酶是生物体内污染物代谢清除的主要酶系,可以在计算不同结构PFASs的P450酶代谢活化能垒基础上,探索建立毒代动力学参数与反应活性的定量构效关系(QSAR)模型,进而为PFAS毒理及健康风险提供高效准确的预测方法㊂
通信作者简介:傅志强(1989 ),男,博士,主要研究方向为新污染物的生物代谢转化行为及毒理效应的模拟预测㊂
参考文献(References):
[1]㊀Organisation for Economic Co-operation and Develop-
ment.Reconciling terminology of the universe of per-and
polyfluoroalkyl substances:Recommendations and practi-
cal guidance[R/OL].[2023-02-02].https://www.food-
/news/oecd-report-reconciles-pfas-ter-
minology
[2]㊀Glüge J,Scheringer M,Cousins I T,et al.An overview of
the uses of per-and polyfluoroalkyl substances(PFAS)
[J].Environmental Science Processes&Impacts,2020,22
(12):2345-2373
[3]㊀Evich M G,Davis M J B,McCord J P,et al.Per-and
polyfluoroalkyl substances in the environment[J].Sci-
ence,2022,375(6580):eabg9065
[4]㊀Zheng G M,Schreder E,Dempsey J C,et al.Per-and
polyfluoroalkyl substances(PFAS)in breast milk:Con-
cerning trends for current-use PFAS[J].Environmental
Science&Technology,2021,55(11):7510-7520
[5]㊀Cao X Z,Xin S H,Liu X X,et al.Occurrence and behav-
ior of per-and polyfluoroalkyl substances and conversion
of oxidizable precursors in the waters of coastal tourist re-
sorts in China[J].Environmental Pollution,2023,316(Pt
1):120460
[6]㊀Lewis A J,Yun X Y,Spooner D E,et al.Exposure path-
ways and bioaccumulation of per-and polyfluoroalkyl
substances in freshwater aquatic ecosystems:Key consid-
erations[J].The Science of the Total Environment,2022,
822:153561
[7]㊀Fenton S E,Ducatman A,Boobis A,et al.Per-and poly-
fluoroalkyl substance toxicity and human health review:
Current state of knowledge and strategies for informing
future research[J].Environmental Toxicology and Chem-
istry,2021,40(3):606-630
[8]㊀杨琳,李敬光.全氟化合物前体物质生物转化与毒性
研究进展[J].环境化学,2015,34(4):649-655
Yang L,Li J G.Perfluorinated compound precursors:Bio-
transformation and toxicity[J].Environmental Chemistry,
2015,34(4):649-655(in Chinese)
[9]㊀Gebbink W A,Berger U,Cousins I T.Estimating human
exposure to PFOS isomers and PFCA homologues:The
relative importance of direct and indirect(precursor)ex-
posure[J].Environment International,2015,74:160-169 [10]㊀Liu X Y,Guo Z S,Folk E E,et al.Determination of fluo-
rotelomer alcohols in selected consumer products and pre-
liminary investigation of their fate in the indoor environ-
ment[J].Chemosphere,2015,129:81-86
[11]㊀Herkert N J,Kassotis C D,Zhang S,et al.Characteriza-
tion of per-and polyfluorinated alkyl substances present
in commercial anti-fog products and their in vitro adipo-
genic activity[J].Environmental Science&Technology,
2022,56(2):1162-1173
[12]㊀Jiao X C,Shi Q Y,Gan J.Uptake,accumulation and me-
tabolism of PFASs in plants and health perspectives:A
critical review[J].Critical Reviews in Environmental Sci-
ence and Technology,2021,51(23):2745-2776
[13]㊀Daramola O,Rand A A.Emerging investigator series:
Human CYP2A6catalyzes the oxidation of6:2fluorote-
lomer alcohol[J].Environmental Science Processes&
Impacts,2021,23(11):1688-1695
[14]㊀Rendic S,Guengerich F P.Survey of human oxidoreduc-。