第二章 物证分析方法

3．高效 高效液相色谱的柱效比气相色谱更高， 使分离效率大大提高。柱长一般在5～40cm。
4．高灵敏度 高效液相色谱广泛采用高灵敏度检 测器，进一步提高分析的灵敏度。如紫外检测器灵 敏度可达10-9g；荧光检测器的灵敏度可达10-11g。 高灵敏度还表现在所需试样量少，微升数量级的试 样就足以进行全分析。
第二节 色谱法
一、气相色谱法 （一）气相色谱仪 气相色谱仪一般由五部分组成 载气系统，包括气源、气体净化、气体流速控制和测量。气 体流速可通过电子流量控制，使气体流速控制的更精确，并 具有线流速控制及体积流速控制等方式。 2.进样系统，包括进样器、气化室。 3.色谱柱和柱箱，包括温度控制装置。 4.检测系统，包括检测器、检测器的电源及控温装置。 5.记录系统，包括放大器、记录仪，有的仪器还有数据处 理装置。

第一节 显微镜法
显微镜—般分为光学显微镜和非光学显微 镜，前者包括生物显微镜、立体显微镜、偏光 显微镜、比对显微镜、金相显微镜等，后者包 括扫描电子显微镜、透射电子显微镜，隧道 (原子力)电子显微镜等。
一、光学显微镜 光学显微镜由光学系统和机械系统两部分构成。 光学系统由成像系统和照明系统两部分组成，成 像系统由物镜和目镜组成。 照明系统 2.物镜 又称接物镜，高性能光学显微镜的有效 放大率可达1500倍。 3.目镜 又称接目镜，作用是将来自物镜的中间 像放大，出射在目镜上方人眼处形成虚像。 光学显微镜的主要机械部件有焦距调节器、载 物台、镜筒、照相摄像接口等。
2.梯度淋洗装置 就是载液中含有两种或两种以上不同极性 的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的 配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分 离因素，以提高分离效果。优点：应用梯度洗提还可以使分 析时间缩短，分辨能力增加，由于峰形的改善，还可以提高 最小检测量和定量分析的精度。
（2）外标法 外标法也称为标准曲线法。配不同浓 度的欲测组分的标准样品，在相同的操作条件下分 别注入相同量的样品，测得响应值。然后绘制响应 值与含量关系的校正曲线，在相同的条件下，测量 相同量的被测样品的响应值，再从校正曲线上查得 含量。
特点及要求：外标法不使用校正因子，准确性较 高。操作条件变化对结果准确性影响较大。对进样 量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快 速分析。
3．信号收集系统 由闪烁体、光导管、光电倍增 管组成，作用是将电子信号收集并成比例地转换成 光信号，再增益放大成可调制图像的电信号。
（二）扫描电子显微镜的工作原理 扫描电子显微镜是由电 子枪发射出电子束，经会聚镜、物镜缩小、聚焦，在样品 表面形成具有一定能量的电子束。电子束从样品中激发出 的二次电子，通过探测系统和成像系统，使之在屏幕上呈 现一幅亮暗程度不同、反映样品表面形貌的二次电子像。 （三）扫描电子显微镜的主要性能
由于电磁透镜可以将电子束调节得非常精细，使其在很小 的范围内扫描，因此扫描电镜在放大倍率、分辨率、图像 景深等方面要远远优于光学显微镜。
1.放大倍率 一般扫描电镜在10倍~15万倍范围内连续可 调。
2.分辨率 高分辨率是扫描电镜最突出的特性，可达0.6～ 6nm。
3.景深 扫描电镜以大景深著名，即图像的立体感、层次 感好。
5.与其它方法结合定性 可与质谱、红外仪等联用。
（五）气相色谱定量分析 定量分析的依据是被测组分的重量或其在载气
中的浓度与检测器的响应信号成正比。即物质的 量正比于色谱峰面积（或峰高）：
m i = fi ·Ai fi为比例系数（绝对校正因子），Ai为峰面积， m i 为物质的量。
1.峰面积的测量 （1）峰高（h）乘半峰宽（Y1/2）法 该法是近似将色谱
（二）光学显微镜的主要参数 1.分辨率 是指在显微镜下能清晰看到的两点
间最小距离。一般光学显微镜的分辨率在几百至 几千纳米量级。
2.放大率 取决于物镜和目镜的匹配，即： 放 大率=物镜放大率×目镜放大率
3.像清晰度 指物镜像轮廓的清晰程度。
（三）几种常见的光学显微镜
1.生物显微镜 它可选用不同的物镜，如低倍镜(8×～ 10×)，高倍镜(40×～50×)、油浸镜(90×～100×)。 偏光显微镜 在普通生物显微镜的光路上加上起偏镜、检 偏镜和补偿片，使自然光过滤为在固定方向振动的偏振光。
5．分析范围宽 高效液相色谱法，只要试样能制 成溶液，而不需要气化就可以进行分析。对高沸点、 热稳定性差、相对分子量大的有机物，原则上都可 以用高效液相色谱法来进行分析。
（二）高效液相色谱法的分类 1.液-固吸附色谱
液-液分配色谱 3．离子交换色谱 固定相
（三）高效液相色谱法仪 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器及放
第二章 常见的仪器分析方法
教学目的及要求： 1、了解常用于微量物证检测的化学分析方法。 2、通常本章学习，让学生掌握扫描电子显微镜法、气相 色谱法、液相色谱法以及气质联用分析方法。 教学重点：扫描电子显微镜和色谱－质谱联用技术的学习 和掌握及操作。 教学难点：对常用仪器分析方法的基本理论学习及理解。 教学课时：6学时
3.立体显微镜 是利用侧射光照明，观察不透明物体立体 形状或表面结构的显微镜。
4.比较显微镜 是利用两个并排放置的显微镜通过同一个 视野对两个物体同时进行观察、比较的显微镜。通常由两 个物镜、一个目镜、两组照明系统和两个载物台组成，要 求将两个比照样品表面置于同一水平面、光照度和角度。
5.金相显微镜 是专门用于观察金属及合金金相结 构的显微镜。它用较强的光源由正面和侧面照射 样品，由光学系统接收反射光。金属与合金的性 质和性能，与其金相结构有着内在的联系。这些 性质、性能，包括机械性能(强度、硬度、塑性)、 物理性能(导电、导热、抗磁)、化学性能(耐腐蚀、 抗氧化等)及工艺性能(铸造性、焊接性、冷热加工 等)，都可以通过金相形态来反映。比如同型号钢 材，如热处理方法不同，即可由金相组织观察来 鉴别。材料断裂、缺陷造成的损伤都可用金相显 微镜来观察分析。用于金相显微镜观察的样品， 其表面必须光滑，因此在观察之前首先要对样品 进行磨光和腐蚀处理。
（二）气相色谱常用的检测器
检测器是将流出色谱柱的载气中被分离组分的浓度(或质量)变化转化 为电信号(电压或电流)变化的装置，常用的有三种。
1.氢火焰离子化检测器（FID） 简称氢焰检测器。利用有机物在氢气中燃烧作用下发生化学电离而形 成离子流，通过测定离子流的强度对组分进行检测。它对含碳的有机物 有很高的灵敏度，能检测至10-12g·s-1的痕量物质，故适于痕量有机物 的分析。因结构简单，灵敏度高，响应快，稳定性好，死体积小、线性 范围宽，可达106以上，因此它也是一种理想的检测器。 2.电子俘获检测器（ECD） 电子俘获检测器是一种对电负性组分有选择响应的检测器，仅对含有 卤素、磷、硫、氧等元素的化合物有很高的灵敏度，检测下限10-14 g /ml，是生物化学、医学、药学、毒物学中一种强有力的检测手段。 3.氮磷检测器（NPD） 碱盐离子化检测器（FTD）又称氮磷检测器，因为它对含氮、磷等杂 原子的有机化合物具有高选择性和灵敏度，因此在农药和药物分析等方 面得到广泛的应用。最小检测量可达10-12～10-14g，线性范围达103。
峰当作等腰三角形进行面积计算。当色谱峰的峰形对称且不 太窄时，该法方便、快捷，较多采用。此法计算出来的面积 是实际峰面积的0.94倍。
A=1.064h·Y1/2 在相对计算时，1.064可略去。 （2）峰高乘平均峰宽法 当峰形不对称时，可在峰高0.15 和0.85倍处分别测定峰宽,由下式计算峰面积:
2.利用相对保留值和保留指数定性 在实际工作中 会发现，尽管固定相相同，由于填充的密度、固定 液配比、担体等差别，同一组分的保留值不同。
3.利用多柱定性 不同组分有可能在同一柱上具有相 同的保留值，因此未知组分和已知物的保留值一致， 有时也不能完全肯定两者是同一物质。
4.利用检测器的选择性 不同类型的检测器对不同 结构、不同性质的组分选择性和灵敏度是不相同的。
内标物要满足以下要求：试样中不含有该物质； 与被测组分性质比较接近；不与试样发生化学反应； 出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰影响。
内标法特点：内标法的准确性较高，操作条件和 进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。每个试 样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样 的快速分析。
二、高效液相色谱法 高效液相色谱分析（HPLC）是以液体为流动相
（三）气相色谱分离条件的选择 1.色谱柱的选择 2.柱温的选择 3.气化室和检测室温度的选择 4.载气流速的选择 5.进样时间和进样量
（四）气相色谱定性分析 定性分析的依据是各种物质在一定的条件（固定
相、操作条件）下均有确定不变的保留值，比较组 分的保留值就可判断组分的异同。
1.利用保留值定性 保留值是与被分析组分本身特 性和仪器操作条件有关的、表示组分与固定相之间 作用力大小的参数。
二、扫描电子显微镜 扫描电子显微镜简称扫描电镜(SEM)，是用于样
品表面形态分析的电子光学仪器。普通光学显微镜 是以光线作为成像媒介，而电子显微镜是以电子束 为成像媒介。 （一）扫描电子显微镜的构成
扫描电镜通常由电子光学系统、扫描系统、信号 收集系统、图像显示和记录系统、真空系统、电源 系统。最主要是以下3个部分：
的色谱分析方法。高效液相色谱分析方法是在经典 液相色谱的基础上发展起来的。 （一）高效液相色谱法的特点
1．高压 液相色谱法以液体为流动相，液体流经 色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速地通过色 谱柱，必须对载液施以高压。一般可达到150～ 350×105Pa。
2．高速 高效液相色谱所需的分析时间较之经典 液相色谱法少得多，一般都少于1h。很多样品只需 要几分钟。载液流速一般可达1～10ml/min-1。
有两种，外梯度：利用两台高压输液泵，将两种不同极性的 溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内 梯度：
一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
3.进样装置 通常使用耐高压的六通阀进样装置。 4.高效分离柱 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱 长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 5.液相色谱检测器 常用的检测器有紫外检测器、光电二极 管阵列检测器、示差折光检测器、荧光检测器 等。
第三节 紫外-可见光吸收光谱法
一、紫外—可见光谱法的基本原理 物质在紫外—可见光的辐射下，其分子外层电子
或价电子将发生能级跃迁，从而对入射光产生吸收， 吸收的波长和强度与物质的种类有关。以吸收光强 度对入射光波长作图得到的关系曲线称作物质的紫 外—可见吸收光谱。利用紫外—可见吸收光谱进行 分析的方法叫做紫外—可见吸收光谱法，简称紫 外—可见光谱法，可用来进行物质的定性和定量分 析。紫外光区是波长约在10～400nm的光波区， 它又可分为近紫外区（200～400nm）及远紫外区 （又称真空紫外区10～200nm）两个区段，可见 光区是波长400～780nm的光波区。
大记录系统组成。 1.高压输液泵 是高效液相色谱仪的主要部件之一，可提供
的压力：150～350×105 Pa。为了获得高柱效而使用粒度 很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将 产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之 一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特 性。
A=h·（Y0.15+Y0.85）/2 （3）峰高乘保留时间法 在一定操作条件下，同系物的半 峰宽与保留时间成正比，对于难于测量半峰宽的窄峰、重叠 峰（未完全重叠），可用此法测定峰面积：
A=h·b·tR
3.定量分析方法 （1）归一化法：
方法的特点及要求：归一化法简便、准确；进样 量的准确性和操作条件的变动对测定结果影响不大； 仅适用于试样中所有组分全出峰的情况。
1.电子光学系统 由电子枪、电磁透镜（线圈)、 物镜、样品室等部件组成，作用是将热电子流调节 成高亮度、小束斑的高能电子束来轰击样品，产生 各种物理信号。
2.扫描系统 由扫描线圈、扫描发生器组成，作 用是使高能电子束在样品上扫描并同步调制阴极射 线显像管电子束在荧光屏上扫描，调节扫描振幅以 改变放大倍率。