一例汉族瘢痕疙瘩家系全基因组重测序结果及初步分析解析

万方数据
５４’
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３．４％，高景恒和夏兆骥心１报道ｌ ００２名中国瘢痕疙 瘩患者中，家系病例占２５％。瘢痕疙瘩家系遗传规 律为常染色体显性遗传，伴外显不完全，不外显率为
６．８％～９．３％１ ２－３ｊ。我们前期对４个瘢痕疙瘩家系
作者单位：２６６０７１ 青岛，解放军第４０１医院手外科（滕国栋） 解放军总医院第一附属医院烧伤整形外科四病区（滕国栋，陈敏亮
刘畅，梁黎明）
５人进行ＷＧＳ，标记为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇ；其中Ａ是母 亲，为先证者；Ｇ是父亲，非患者；Ｂ、Ｃ、Ｄ是子代瘢 痕疙瘩患者（图２Ｂ—Ｄ）。
通信作者：陈敏亮，Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｍｌ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ
选择合适的家系病例进行wgs与实验的设计密切相关选择一代家系中瘢痕疙瘩病例及正常人和二代家系中3例瘢痕疙瘩病例进行对比筛选既可以维持家系内dna序列的同源性排除其他遗传性疾病及外来基因干扰又可以保证家系瘢痕疙瘩密切相关的snp的一致性有效提高重测序的效率和准确度降低假阳性率
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口正常男性■男性瘢痕疙瘩口男性增生性瘢痕 ０正常女性●女性瘢痕疙瘩ｅ女性增生性癜痕
图１ 火津ｉＺ族懈幢疙｛｝；家系系潜【｝Ｉ
口男性未统计 Ｑ女性未统计
别有９５．７１％，９６．１６％）、与之前测序过的人类基因 组数据比例一致，表明ＳＮＰ数据集的高准确性。去 除已有报道的ＳＮＰｓ后，再进一步在病例间对比筛 选后，共筛选出瘢痕疙瘩患者共有而正常人没有的
ＳＮＰ
２７个。这些变异一共关联至２６个基因，通过 进一步的ＧＯ和ｐａｔｈｗａｙ分析基因 的功能和作用途径，其中８个基因 与细胞凋亡、细胞周期、细胞增殖与
］０
图２ Ｊ、ｒ｜＋，￡ｆ儿１ ｒｆ讪ｊ眨Ｉ？；＇、二＾ 、：，１Ｌ川＾：ｌ｛：ｌ’｜ｌ一二：（．：Ｉ’Ｉｌ一）：】
分化、胶原代谢等功能相关。而这 些机制与瘢痕疙瘩发病机制紧密相 关。我们推测这８个基因与此家系 的瘢痕疙瘩发病有密切关系（图
ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ
Ｗｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｄａｔａ ｏｆ ｔｈｅ ｋｅｌｏｉｄ ｐｅｄｉｇｒｅｅ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ｖｅｎｏｕｓ
ｐｅｄｉｇｒｅｅ．Ｔｈｅ ＤＮＡ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ
ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｇｅｎｏｍｅ
ｏｆ
ｍｕｔａｔｉｏｎｓ
ｗｉｔｈ
ｋｅｌｏｉｄ，ａｎｄ ｐｒｏｖｉｄｅ
ｗａｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ
ｋｅｌｏｉｄ． Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；
【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】
Ｇｅｎｅ
Ｋｅｌｏｉｄ；Ｐｅｄｉｇｒｅｅ；
Ｗｈｏｌｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；
Ｆｕｎｄ ｐｒｏｇｒａｍ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ（８１２７２１０３）
ｎｅｗ
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因。
的调查后选择此例家系进行ＷＧＳ，主要因为此家系 中无不外显病例，说明其致病基因遗传的稳定性高， 瘢痕疙瘩相关ＳＮＰ的检出率及稳定性都可以得到 保障。 选择合适的家系病例进行ＷＧＳ与实验的设计 密切相关，选择一代家系中瘢痕疙瘩病例及正常人 和二代家系中３例瘢痕疙瘩病例进行对比筛选，既 可以维持家系内ＤＮＡ序列的同源性，排除其他遗传 性疾病及外来基因干扰，又可以保证家系瘢痕疙瘩 密切相关的ＳＮＰ的一致性，有效提高重测序的效率 和准确度，降低假阳性率。 二、ＷＧＳ应用于瘢痕疙瘩家系筛选结果的初步 分析 以往对汉族瘢痕疙瘩相关的ＳＮＰ的研究，都是 利用其他种族瘢痕疙瘩相关ＳＮＰ在汉族人群中进 行验证试验。本研究利用对汉族瘢痕疙瘩家系 ＷＧＳ发现的是全新ＳＮＰ，对瘢痕疙瘩的病因研究具 有重要意义。 对瘢痕疙瘩家系进行ＷＧＳ相互比对后获得 ２６个基因，经过定制软件筛选，获得与瘢痕疙瘩发 病机制相关的８个基因，其中６个（ＳＨ３ＲＦｌ、 ＨＵＳｌＢ、ＭＹＨ８、ＲＡＥＴｌＧ、ＴＵＢＢｌ、ＧＰＲｌ２６）与细胞 周期、凋亡、增殖相关，２个（ＥＮＴＰＤ４、ＣＯＬｌ７Ａ１）与 胶原蛋白的合成和分解有关。 ＳＨ３ＲＦｌ基因通过编码泛激素连接酶调控ｃ． Ｊｕｎ氨基末端激酶信号通路调节细胞凋亡；ＨＵＳｌＢ 基因编码细胞周期检测蛋白，过度表达会引起细胞 凋亡减少，而成纤维细胞凋亡减少会导致创伤愈合 过程中瘢痕组织异常增生，加速了瘢痕疙瘩的形成 和发展；ＧＰＲｌ２６基因编码蛋白作用于Ｇ．蛋白偶联 受体蛋白信号通道，并能调控环腺苷酸及磷脂酰肌 醇信号通道，调节细胞代谢及增殖、分化；ＲＡＥＴｌ Ｇ 基因与ＮＫ细胞介导的细胞毒性相关，是细胞增殖、 凋亡调控的补充调节方式；ＴＵＢＢｌ基因编码微管蛋 白组成微管结构，与细胞周期及细胞间隙连接有关， 影响细胞的增殖。当机体局部受外伤刺激后，基因 的异常表达会导致大量成纤维细胞聚集于受刺激部 位，这可能是瘢痕疙瘩形成的一个重要环节。 ＥＮＴＰＤ４基因编码ＡＴＰ双磷酸酶家族蛋白，管理钙
瘢痕疙瘩致病基因众多且具体表达途径复杂并 受多种因素影响，这可能也是瘢痕疙瘩遗传不稳定 及多变的原因。 三、瘢痕疙瘩家系和散发人群ＳＮＰ的异同 特定瘢痕疙瘩家系与散发瘢痕疙瘩人群的瘢痕 疙瘩相关ＳＮＰ是否一致，在本实验中并未被证实。 既往研究表明不同疾病在家系和散发病例中，疾病 相关ＳＮＰ分型一致性并不完全相同Ｍｊｌ。但对于瘢 痕疙瘩的家系和散发病例间ＳＮＰ的差异性研究尚 未见报道，我们将在今后进一步深入研究验证其间 关系，希望可以筛选出具有普遍性的新的与疾病相 关的ＳＮＰ及相关基因。 四、ＷＧＳ技术应用于瘢疫疙瘩研究的优势 ＷＧＳ技术已经在医学领域得到了部分应用并 得到了一些突破性的成果，如对罕见病例的诊 断１６ Ｊ、流行病的预测＂Ｊ、癌症病例的研究坤１以及寻 找遗传病的致病基因位点∽－等。 瘢痕疙瘩被认为是多基因调控的疾病，大量的 瘢痕疙瘩相关基因通过采用全基因组关联分析及基 因芯片等高通量检测技术被发现‘１…，但仅能通过对 已发现的瘢痕疙瘩特征（如肿瘤特性）相关的ＳＮＰ 或基因进行验证。ＷＧＳ技术可以更全面地检测瘢 痕疙瘩患者的基因突变位点，发现新的与瘢痕疙瘩 相关的ＳＮＰ及相关基因。 不同的种族、民族瘢痕疙瘩易感基因并不完全 一致，Ｍａｒｎｅｒｏｓ等…１发现了１个日本家系和１个非 洲裔美国人家系瘢痕疙瘩易感基因位点，在汉族易 感人群中未能得到验证¨２｜。所以针对汉族瘢痕疙 瘩人群进行ＷＧＳ分析具有必要性，并且针对瘢痕疙 瘩病例ＷＧＳ筛选发现的ＳＮＰ及相关基因与瘢痕疙 瘩关系更密切，其结果必将推动汉族瘢痕疙瘩研究 的进一步深入。 五、研究方向及展望 通过对瘢痕疙瘩家系的重测序分析获得的ＳＮＰ
Ｗｈｏｌｅ・ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
ｏｎ
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Ｇｕｏｄｏｎｇ’，Ｃｈｅｎ Ｍｉｎｌｉａｎｇ，Ｌｉｕ
２６６０７１，Ｃｈｉｎａ
Ｃｈａｎｇ，Ｌｉａｎｇ Ｌｉｍｉｎｇ．‘Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈａｎｄ Ｓｕｒｇｅｒｙ，４０１
Ｈｏｓｐｉｔａｌ，ＰＭ，Ｑｉｎｇｄａｏ
镁通道溶酶体调节，与胶原酶分解相关；ＣＯＬｌ７Ａ１ 基因与胶原１７ｃｔ链蛋白相关；ＭＹＨ８基因与肌球蛋 白关系密切，肌球蛋白是瘢痕增生挛缩的内在因素。 基因变异导致胶原酶调节紊乱，瘢痕疙瘩的胶原纤 维粗大、紊乱与之关系密切，肌球蛋白主要存在于骨 骼肌中，但在非肌细胞中也有存在，并且在非肌细胞 的收缩中发挥重要作用［３ Ｊ，此基因的调节作用可能 决定了瘢痕疙瘩和增生性瘢痕挛缩性质不同的原
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＷＧＳ），期望筛选出与瘢痕疙瘩
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
相关的单核苷酸多态性位点（ｓｉｎｇｌｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）及相关基因信息。 资料和方法 一、瘢痕疙瘩家系的选取
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－４５９８．２０１６．叭．０１４
症状重且典型，瘢痕分布于胸背部，面积约５％，双 侧乳房被瘢痕覆盖，伴有瘙痒、破溃（图２Ａ）。其他 病例症状典型，但面积较先证者小。选取家系中的
３）。
讨
论
一、瘢痕疙瘩遗传模式及ＷＧＳ 病例的选择
二、ＤＮＡ的提取 提取外周血液样本约６ ｍｌ，其过程严格遵照赫 尔辛基宣言的要求，明确告知参与研究的家系成员 本实验的目的及意义，并签署知情同意书。采用 Ｔｉａｎｇｅｎ中量血液基因组ＤＮＡ提取试剂盒，并严格 按照说明书进行操作提取全基因组ＤＮＡ。 三、全基因组序列的重测序及筛选步骤 ①通过Ｉｌｌｕｍｉｎａ
万方数据
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结
果
通过标准化流程对５个样本ＤＮＡ进行ＷＧＳ 后，在全基因组范围内每个样本平均检出３
４３６ ５５１
个ＳＮＰｓ，其中１９ ５３７个ＳＮＰｓ位于编码区，通过与人 类ＤＮＡ序列变异数据库的对比，发现绝大部分ＳＮＰ 在变异数据库中已有报道（基因组和编码区平均分
万方数据
主堡鳌堑丛登盘查！！！！至！旦箜！！鲞箜！塑
垦！也！！！！璺！！坚！！塑：！！！！！！！！：！！！堕！：！
－５５
实验论著・
人单根毛发毛囊单位体外培养模型的建立
马丽
王继萍
冯苏云
李毅民
赵康峰
雷鸣
【摘要】
目的
建立人单根完整毛发毛囊单位体外培养模型，并对其进行形态学和组织学观
察。方法取志愿者术中所切除的正常头皮组织，显微镜下分离获取处于生长期的毛囊，置于无血 清Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ培养基内培养。实验共分３组，对照组：去除皮脂腺、毛囊周围全层组织的单根毛发毛 囊单位；实验Ａ组：去除皮脂腺开Ｉ＝Ｉ以上皮肤部分，保留毛囊皮脂腺单位的单根毛发毛囊单位；实验 Ｂ组：包含毛囊皮脂腺单位、毛囊周围全层组织的完整的单根毛发毛囊单位。观察不同组单根毛囊 单位在体外培养模型中的成活率、毛发的生长速度、毛发的成活时间，毛囊细胞增殖能力及凋亡等。
・临床论著・
一例汉族瘢痕疙瘩家系全基因组重测序 结果及初步分析
滕国栋 陈敏亮
刘畅
梁黎明
【摘要】 信息。方法
目的
通过对瘢痕疙瘩家系进行全基因组重测序筛选与疾病相关的单核苷酸多态性
收集瘢痕疙瘩家系资料，绘制家系图谱；选取家系特定成员外周血样，提取ＤＮＡ进行 本例瘢痕疙瘩家系
全基因组重测序并设计软件分析比对，筛选相关突变位点及致病基因。结果
遗传稳定，筛选出疾病相关的单核苷酸多态性２７个，筛选出８个基因与瘢痕疙瘩发病机制密切相 关。结论全基因组重测序技术可以筛选出新的与瘢痕疙瘩相关的基因突变信息，为瘢痕疙瘩的 病因研究提供一种新的途径和方法。 【关键词】 瘢痕疙瘩；家系；全基因组重测序；单核苷酸多态性；基因
基金项目：国家自然科学基金（８１２７２１０３）
Ｈｉｓｅｑ
２０００对基因组ＤＮＡ进
行完整测序，获得原始序列数据。②通过序列分析 软件与正常人类基因组数据库（ｈｇｌ９）进行对比获 取家系ＤＮＡ变异的序列。③获取的变异序列与已 知变异数据库（ｄｂＳＮＰ等）比较，去掉人群中广泛 存在的序列变异，获得家系特有的变异序列。④通 过对５个样本之间相互比较找出Ａ—Ｄ ４例患者共 有而正常人Ｇ中不存在的变异。⑤根据变异注释 及预测软件（ＧＯ和ｐａｔｈｗａｙ分析）筛选出影响瘢痕 疙瘩相关的基因功能的ＳＮＰ。
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：Ｃｈｅｎ Ｍｉｎｌｉａｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｃｈｅｎｍｌ＠ｓｏｈｕ．ｃｏｒｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】０ｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｃｈａｒｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｔｏ
ｓｃｒｅｅｎ
ＳＮＰ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｏｆ
ｋｅｌｏｉｄ
ｐｅｄｉｇｒｅｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ
瘢痕疙瘩是皮肤创伤后病理性愈合并过度瘢痕 化的病症，其发生原因尚无定论，但瘢痕疙瘩家系的 存在证明其具有遗传特性。我们对１例汉族瘢痕疙 瘩家系病例进行了临床及遗传学调查，对部分病例 提取ＤＮＡ进行了全基因组重测序分析（ｗｈｏｌｅ
ｇｅｎｏｍｅ
（一）瘢痕疙瘩家系病例符合瘢痕疙瘩形态学 及病理学诊断标准。如呈蟹足样浸润生长，单纯手 术切除后复发，病理切片见胶原纤维粗大、紊乱，呈 嗜酸性透明样变，血管增生伴炎性细胞浸润等。 （二）本组瘢痕疙瘩家系来自天津，汉族，家系 夫妻间无亲缘关系，家系成员无与汉族以外种族婚 配史，无其他遗传疾病。４代２６人，男性１６人，女 性１０人，年龄５～８１岁，其中瘢痕疙瘩患者６人，增 生性瘢痕３人（图１）。先证者（Ｐ Ｉ．２），现年８１岁，