两性聚合物光敏剂的合成及性能

两性聚合物光敏剂的合成及性能
骆司航;赵春常
【摘要】本文设计合成了一种用于光动力治疗的聚合物光敏剂PDPA-AMA-BOD.研究表明,在pH中性时,聚合物自组装形成胶束,疏水端的光敏剂被包裹在疏水内腔中,处于局部高浓度聚集态,引发homo-FRET效应,单重态氧效率大幅降低;而在弱酸性条件下,由于疏水端的氨基功能团质子化,胶束形态被破坏,聚合物分子均匀分散水中,降低了光敏剂的自粹灭,PDPA-AMA-BOD具有较高的单重态氧效率.PDPA-AMA-BOD的pH响应特性赋予其在肿瘤细胞弱酸性环境中光动力靶向治疗肿瘤的能力.%We designed and synthesized anamphiphilic polymer-based PDT photosensitizer PDPA-AMA-BOD.Experimental results demonstrated that PDPA-AMA-BOD could self-assemble into micelles in neutral aqueous environment and thus enabled the BODIPY photosensitizer trapped within the hydrophobic interior,which induced a high local concentration of BODIPY.As such,the efficiency of 1O2 generation was reduced by homoFRET effect.In contrast,the protonation of amino sites attached to the hydrophobic end of PDPA-AMA-BOD resulted in the polymer well-dispersing in acidic aqueous solutions.As a consequence,concentration induced inhibition of 1O2 production was abolished.In this way,PDPA-AMA-BOD showed the acidity-controlled production of 1O2,suggesting the potential application as a selective PDT photosensitizer towards acidic tumor microenvironment.
【期刊名称】《影像科学与光化学》
【年(卷),期】2016(034)005
【总页数】9页(P426-434)
【关键词】两性聚合物;光敏剂;胶束;单重态氧;光动力学治疗
【作者】骆司航;赵春常
【作者单位】华东理工大学化学与分子工程学院精细化工研究所,上海200237;华
东理工大学化学与分子工程学院精细化工研究所,上海200237
【正文语种】中文
光动力学疗法(Photodynamic Therapy, PDT)是选择性地杀死肿瘤细胞的一种常
用方法[1-2\]，其主要原理是利用光敏剂(Photosensitizer，PS) 在特定的光照激
发下，将基态氧分子(3O2)敏化为单重态氧分子(1O2)。

由于1O2具有强氧化性，可对细胞组织产生不可逆转的破坏，从而杀死细胞[3\]。

PDT光敏剂具有较低的暗毒性，副作用小，因此利用PDT来治疗肿瘤有着巨大的研究潜力。

PDT要求光敏剂对肿瘤细胞具有高度的选择性，具有辨识肿瘤细胞与正常细胞的能力，以避免对正常细胞的损伤。

研究表明，肿瘤细胞相比正常细胞(pH 7.4)往往具有偏酸性(pH 6.5～6.8)的微环境[4\]。

因此，研究开发出一种对pH敏感、在弱酸性条件下具有高1O2效率的光敏剂，对于PDT具有非常重要的意义[5\]。

本文以一种对pH敏感的两性高分子聚合物PDPA-AMA为载体，开发合成了一种基于自组装体系的高效纳米胶束光敏剂。

图1与图2所示为聚合物光敏剂PDPA-AMA-BOD的结构及在中性与酸性环境下的存在形态。

PDPA-AMA具有一个聚
乙二醇结构的亲水端和一个含叔胺和伯胺的疏水聚合物片段[6-7\]。

本文将碘代BODIPY光敏剂通过共价酰胺键连接到PDPA-AMA的疏水端。

中性
环境下，PDPA-AMA根据疏水、亲水作用形成胶束纳米粒子，疏水腔中的光敏剂
处于局部高浓度状态。

由于该BODIPY光敏剂的Stokes位移较小(17 nm)[8-10\]，容易发生homo-FRET自粹灭现象，因此局部高浓度的光敏剂产生单重态氧的效
率显著下降。

与此相对应，在酸性环境中，疏水端的叔胺被质子化，则疏水性能变为亲水性，引起聚合物均匀分散在水中，不能形成胶束。

这样，光敏剂在酸性环境下不会发生homo-FRET自粹灭现象，具有高的单重态氧敏化效率。

1.1 实验试剂与仪器
合成实验所用试剂和药品均为AR级别。

透析所用透析袋截留分子量为3500。

用Bruker AV-400核磁共振波谱仪获得新化合物的氢谱，Magna-IR 550傅里叶红
外光谱仪分析红外光谱，Waters1515凝胶渗透色谱仪测定聚合物分子量分布。

1.2 合成过程
1.2.1 BODIPY光敏剂的合成(合成路线见图3)
(1) 化合物1的合成
称取750 mg (5 mmol) 4-羧基苯甲醛于烧瓶中，加入200 mL干燥的二氯甲烷溶解。

之后均速加入1.13 mL (11 mmol) 2,4-二甲基吡咯及一滴三氟乙酸(TFA)，室温搅拌24 h，可观察到体系颜色逐渐变红并逐渐变深，最后变为深红色。

将1.23 g (5 mmol) 2,3-二氯-5,6-二氰基对苯醌(DDQ)溶于50 mL干燥的二氯甲烷后逐
滴加入反应体系，室温搅拌4 h。

迅速加入5 mL (36 mmol)三乙胺与5 mL (40 mL)三氟化硼乙醚，室温搅拌12 h，TLC检测反应完全。

将体系溶液用水洗涤3
次并用二氯甲烷萃取，有机相合并后用无水硫酸钠干燥，旋干。

硅胶柱析法(洗脱
剂二氯甲烷∶甲醇=100∶1)得到红棕色固体871 mg，产率47.3%。

1HNMR (400 MHz, MeOD) ：8.21 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.49 (d, J=8.1 Hz, 2H), 6.08 (s,
2H), 2.49 (s, 6H), 1.40 (s, 6H).
(2) 化合物2的合成
称取100 mg (0.272 mmol)化合物1与172 mg (0.678 mmol)碘于烧瓶中(烧瓶
外壁用铝箔包裹避光)，加入80 mL乙醇溶解。

将96 mg (0.546 mmol)碘酸溶于1 mL水后滴加到体系中。

缓慢加热到60℃回流搅拌1 h，TLC检测反应完毕。

滴加饱和硫代硫酸钠溶液到体系中，可观察到体系颜色不断变浅并有白色固体析出，滴加至颜色不再变浅为止。

过滤除去白色固体，将滤液旋干，固体溶于乙酸乙酯，用饱和硫代硫酸钠溶液洗涤3次，水洗2次并用乙酸乙酯萃取。

合并有机相后用无水硫酸钠干燥，旋干即得到产物(深红色固体)133 mg，产率为78.9%。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)：8.27 (d, J=8.1 Hz, 2H), 7.42 (d, J=8.1 Hz, 2H),
2.66 (s, 6H), 1.38 (s, 6H).
(3) 化合物3的合成
称取100 mg (0.16 mmol)化合物2、41.4 mg (0.36 mmol) N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与69 mg (0.36 mmol) 1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶于30 mL二氯甲烷，室温搅拌12 h，TLC鉴定反应结束。

用水洗涤3次并用二氯甲烷萃取，有机相用无水硫酸钠干燥，旋干后用硅胶柱提纯，纯二氯甲烷作为洗脱剂，得到产物(橙色固体)88 mg，产率76.7%。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)：8.31 (d, J=8.2 Hz, 2H), 7.48 (d, J=8.2 Hz, 2H), 2.97 (s, 4H), 2.66 (s, 6H), 1.39 (s, 6H).
1.2.2 聚合物PDPA-AMA与PDPA-AMA-BOD的合成(合成路线见图4)
(1) 大分子引发剂PEO-Br的合成
称取10 g (2 mmol)聚乙二醇单甲醚(平均分子量5000)、375 mg (2.25 mmol) 2-溴-2-甲基丙酸、550 mg (2.65 mmol) N,N′-二环己基碳二酰亚胺(DCC)及40 mg (0.33 mmol) DMAP于烧瓶中，加入65 mL干燥的二氯甲烷溶解，室温搅拌24 h。

抽滤除去不溶物，并用二氯甲烷洗涤。

滤液旋干后即得到产品(白色固体)9.2 g，收率约为92%。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)：4.36～4.30 (m, 2H), 3.86～3.44 (m, 454H), 3.38 (s, 3H), 1.94 (s, 6H).
(2) 单体DPA的合成
将8.8 mL (0.05 mol) N,N-二异丙基乙醇胺、6.9 mL (0.05 mol)三乙胺以及55 mg (0.5 mmol)对苯二酚溶于20 mL干燥的二氯甲烷。

将4.8 mL (0.05 mol)甲基丙烯酰氯溶于10 mL干燥二氯甲烷后，在冰浴条件下缓慢滴加到上述溶液中，可
观察到白色烟雾和固体(盐)产生。

室温搅拌12 h后，过滤除去固体，旋干得到油
状液体。

减压蒸馏提纯，收集0.04 mmHg下42～48 ℃的馏分(无色液体)6.7 g，产率92.3%。

1HNMR (400 MHz, CDCl3)：6.13～6.08(m, 1H), 5.58～5.53 (m, 1H), 4.08 (t, J=7.1 Hz, 2H), 3.02 (dq, J=13.1, 6.5 Hz, 2H), 2.69 (t, J=7.1 Hz,
2H), 1.02 (d, J= 6.5 Hz, 12H).
(3) 单体AMA(盐酸盐)的合成
称取4 g (41 mmol)乙醇胺盐酸盐与45 mg (0.41 mmol)对苯二酚于烧瓶中，再
加入4.4 mL (45 mmol)甲基丙烯酰氯，缓慢加热到80 ℃使固体熔融，回流搅拌
2 h。

之后停止加热，待其冷却凝固。

加入适量乙醚，过滤并用乙醚洗涤固体。

剩
余固体为白色粉末和少量黄色块状固体，加少量甲醇溶解白色粉末，过滤除去黄色块状固体，之后旋干滤液，重复几次至黄色块状固体被除尽。

最后用乙醚重结晶，得到白色固体661 mg，产率约为9%。

1HNMR (400 MHz, MeOD)：6.22 (m,
1H), 5.71 (m, 1H), 4.38 (t, J=5.2 Hz, 2H),3.28(t,J=5.2 Hz,2H),1.97(s,3H).
IR(ATR) 2987(br,C—H, NH2),1716(s,CO), 1636(w,CC), 1168(s, C—O) cm-1. (4) PDPA-AMA的合成
参考相关文献[16,37\]，以亲水聚合物PEO-Br为大分子引发剂，利用原子转移自由基聚合(ATRP)原理按照一定比例将含有氨基的单体DPA与AMA聚合到PEO
链上，形成了两性的嵌段聚合物PDPA-AMA。

首先称取250 mg (0.05 mol) PEO-Br、850 mg (4 mmol) DPA与25.7 mg (0.155 mmol) AMA于Schlenk管中，加入1 mL异丙醇与1 mL DMF搅拌溶解，
之后加入12.5 μL (0.06 mmol)五甲基二乙三胺(PMDETA)。

密封后，在氩气的保护下利用液氮与真空油泵进行3次“冻结-抽气-解冻”(freeze-pump-thaw)循环，在冻结的状态下开盖迅速加入8 mg (0.056 mmol)溴化亚铜并立即密封，再进行
2次“冻结-抽气-解冻”循环。

完成后待体系升至室温，缓慢加热至50 ℃搅拌反
应24 h。

整个过程须保证体系在氩气的保护下且密封良好(无水无氧)。

反应结束
后加入5 mL THF稀释，然后通过一根中性氧化铝柱除去铜离子(可观察到蓝色的
铜离子吸附到了氧化铝柱上)。

将溶液中的THF低温旋去，剩余液体用去离子水透析10 h(每2 h换一次水)，最后将所得水溶液冻干得到白色固体207 mg。

1HNMR(400 MHz, CDCl3)：4.09(—NCH2CH2OCO—),3.83(—OCH2CH2- OCO—),3.65(—OCH2CH2—), 3.38(CH3O-CH2CH2—),3.00(—
NCH2CH2OCO—), 2.63(—NCH(CH3)2), 1.9 5～1.8 1(—CH2C(CH3)—), 1.0
1(—NCH(CH3)2), 0.8 9(—CH2C(CH3)—,—OCO—C(CH3)2CH2—).GPC(THF): Mn=8510 Da, Mw=11207 Da, PDI=1.32.
(5) PDPA-AMA-BOD的合成
利用NHS活化羧基后的BODIPY光敏剂(化合物3)很容易对PDPA-AMA上的伯
胺进行酰化，从而连接到PDPA-AMA载体聚合物上。

这一步的关键在于要除去
过量的小分子光敏剂，以防小分子光敏剂对聚合物光敏剂PDPA-AMA-BOD的性质测试产生干扰。

由于此类BODIPY光敏剂水溶性很差，很难用透析的方法除去，因此本文创造性地利用了索氏提取器，用乙醚作为小分子溶剂洗涤聚合物的方法来除去小分子光敏剂。

称取100 mg (11.8 μmol) PDPA-AMA与16.9 (23.5 μmol)化合物3，加入6
mL DMF溶解，室温搅拌48 h。

反应结束后用去离子水透析10 h(每2 h换一次水)，然后冻干。

所得固体转入索氏提取器，置于一个装有足量乙醚的烧瓶上方，
不断加热回流乙醚来洗涤索氏提取器中的固体至下方流出的乙醚呈无色。

最后将剩
余固体溶于THF，低温旋干得到紫红色固体产物85 mg。

1HNMR(400
MHz,CDCl3)：8.29(phenyl-H),7.4 4(phenyl-H),4.11(—NCH2CH2OCO—),3.8 4(—OCH2CH2OCO—),3.66(—OCH2CH2—),3.39(CH3OCH2CH2—),3.01(—NCH2CH2O-CO—),2.6 7 (pyrrole-CH3),2.6 4(—NCH(CH3)2),1.9 4～1.7 9(—CH2C(CH3)—),1. 3 9(pyrrole-CH3),1.0 3(—NCH(CH3)2),0.9 1(—
CH2C(CH3)—,—OCO—C(CH3)2CH2—).
2.1 载体聚合物PDPA-AMA分子量的分析及相关计算
利用凝胶渗透色谱(GPC)法，得到聚合物PDPA-AMA的分子量Mn=8510 Da，Mw=11207 Da，PDI为1.32，因此聚合物PDPA-AMA的分子量分布均匀。

根据PDPA-AMA的分子量Mn以及已知亲水端的聚乙二醇长链分子量5000 Da，并根据特征性核磁信号，计算得到疏水端部分分子量约为3510 Da。

根据单体DPA与AMA的分子量与它们的反应投料比，可粗略计算得到PDPA-AMA结构
式中的m(DPA的数目)=16，n(AMA的数目)=0.6，所得数值均为统计学平均值。

2.2 临界胶束浓度的确定
临界胶束浓度(CMC)是指两性聚合物溶解在水中能够形成胶束的最低临界浓度，当聚合物浓度低于CMC时无法形成胶束。

本文根据芘在不同极性环境中的光谱变化来测定聚合物PDPA-AMA-BOD的临界胶束浓度。

一般情况下，芘在370～400 nm之间呈现5个荧光发射峰，372 nm处发射峰强度(I1)与382 nm处发射峰强
度(I3)的比值(I1/I3)随环境极性的降低而呈显著的减小趋势(见图5)，因此I1/I3常被用来鉴定芘所处的溶剂环境的极性大小[11\]。

当两亲聚合物形成胶束时，有机
小分子芘处于胶束内腔的疏水环境，极性较低；反之若聚合物不能形成胶束，则芘会处于极性较大的水体系中。

水体系中芘的荧光发射强度值(I1/I3)对PDPA-AMA-BOD浓度作图，获得图6。

由图可以看出，I1/I3的值随浓度增大有一个突变减小的趋势，突变拐点处所对应
浓度是1.6 μg/mL,即为PDPA-AMA-BOD的临界胶束浓度。

在中性环境中，只要PDPA-AMA-BOD的浓度大于CMC，则可以形成胶束纳米粒子。

2.3 不同pH条件下的聚集状态
PDPA-AMA-BOD是一种对pH敏感的两性聚合物，在中性环境中聚集成胶束而
在酸性环境中则会均匀分散。

本文采用测定CMC的方法，根据芘的光谱变化推测PDPA-AMA-BOD(200 μg/mL)在不同pH条件下的聚集状态。

I1/I3相对pH作图，得图7。

从图7中可以看出，I1/I3值在pH 6.4～7.4之间有一个突变，突变中点大约在
pH=6.9处。

当pH大于6.9时，PDPA-AMA-BOD主要形成胶束体，而当pH小于6.9时，PDPA-AMA-BOD主要表现为均匀分散在水体系中。

TEM(图8)实验进一步证实了该结论。

从图8可以看出，pH 7.4的中性溶液中的PDPA-AMA-BOD 呈大小均匀的颗粒状，说明形成了稳定的胶束粒子，粒子的直径约为20～30 nm；而在pH 5.4的酸性环境下，PDPA-AMA-BOD呈现散乱不规则的斑状分布，没
有形成稳定的胶束颗粒。

2.4 单重态氧效率与pH值的关系
在光照激发下，光敏剂通过敏化周边环境的基态氧产生具有强氧化活性的单重态氧，破坏细胞生物环境。

单重态氧效率的高低是评价PDT光敏剂优劣的最重要的一条
标准。

本文采用ABDA(9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸)单重态氧指示探针来研究PDPA-AMA-BOD在不同pH条件下的单重态氧效率[12\]。

根据参比孟加拉红在水溶液
中的单重态氧效率(ΦΔ=0.75)[13\]，计算获得不同pH下PDPA-AMA-BOD的单重态氧效率，并对pH作图，得图9。

由图9可以看出PDPA-AMA-BOD的单重态氧效率随pH的增大显著减小，从
pH 5.0～7.8，单重态氧效率从0.5左右降低到0.1左右。

这说明PDPA-AMA-
BOD是一种pH响应型光动力学治疗光敏剂，在酸性环境中具有较高的光毒性。

在无光照激发下，探针ABDA的吸收谱图几乎无变化(图10)，这说明PDPA-AMA-BOD在暗环境中不会产生单重态氧。

本文设计合成了聚合物光敏剂PDPA-AMA-BOD，研究表明其具有相对均匀的分子量分布和低的临界胶束浓度。

进一步的研究证明PDPA-AMA-BOD是一种对pH敏感的两性聚合物，在中性环境中聚集成胶束而在酸性环境中则会均匀分散。

更重要的是，PDPA-AMA-BOD单重态氧效率随pH的增大显著减小，酸性环境下产生单重态氧的效率显著高于中性环境。

因此PDPA-AMA-BOD呈现出靶向肿瘤微环境识别能力，在光动力学疗法方面具有一定的应用前景。

*Correspondingauthor,E-mail:********************.cn
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