利用钾吸收基因表达评价葡萄叶面喷施钾肥效果和喷施浓度

利用钾吸收基因表达评价葡萄叶面喷施钾肥效果和喷施浓度张成;贾海锋;王剑;纠松涛;王梦琦
【摘要】[目的]叶面喷施钾肥可以快速、高效地为葡萄补充钾营养,促进葡萄的高产和优质,已经被广泛应用于葡萄生产中.本实验通过对葡萄叶面喷施不同种类及浓度钾肥,测定葡萄叶片和果实等生理指标变化,以及钾吸收相关基因的表达变化,从生理和基因水平上评价这些钾肥的喷施效果,为葡萄生产中钾肥的施用提供一定指导.[方法]本实验以‘夏黑’葡萄为试材,选择两个葡萄生长关键时期盛花期和果实膨大期分别对葡萄叶片喷施0.2％、0.5％和0.8％三种浓度的K2SO4、K2CO3、K2SO4·2MgSO4和KCl.然后对葡萄叶片和新梢的生长率,坐果率,叶绿素含量,单粒重,可溶性固形物等生理指标进行统计分析,并利用荧光定量PCR技术分析4个钾吸收相关基因VvHAK13、VvKEA2、VvSIRK和VvSORK的表达情况.[结果]叶面喷施4种钾肥后,葡萄叶片和新梢的生长率,坐果率,叶绿素含量,单粒重,可溶性固形物等各项生理指标均有不同程度的提升.钾肥种类不同,最适喷施浓度不同,同种钾肥在葡萄盛花期和果实膨大期的最适喷施浓度也有所不同,四种钾肥在果实膨大期的最适喷施浓度普遍高于盛花期.四个钾吸收相关基因在喷施不同种类及浓度钾肥后也表现出不同的表达模式,总体来讲VvKEA2、VvSIR、VvSOR的表达上调,而VvHAK13的表达下调.果实膨大期,需喷施较高浓度的钾肥,钾吸收相关基因才表现出较强烈的响应,而在盛花期则只需喷施较低浓度的钾肥.综合生理指标和基因表达两方面结果,得出4种钾肥效果依次为K2SO4·2MgSO4＞K2SO4＞K2CO3＞ KCl.盛花期K2SO4和K2CO3的最适喷施浓度为0.5％,K2SO4·2MgSO4和KCl的最适喷施浓度为0.2％;果实膨大期K2SO4、K2SO4·2MgSO4和KCl的最适喷施浓度为0.5％,K2CO3的最适喷施浓度为0.8％.[结论]葡萄叶面喷施钾肥可以有效促进葡萄叶片和果实的生长发育,四种钾肥的效果依此为:K2SO4·2MgSO4＞K2SO4
＞ K2CO3＞ KCl.盛花期K2SO4和K2CO3的最适喷施浓度为
0.5％,K2SO4·2MgSO4和KCl的最适喷施浓度为0.2％;果实膨大期K2SO4、
K2SO4·2MgSO4和KCl的最适喷施浓度为0.5％,K2CO3的最适喷施浓度为
0.8％.适宜的喷施浓度可以有效提高钾吸收相关基因的表达,是其提高钾吸收利用的机理之一.
【期刊名称】《植物营养与肥料学报》
【年(卷),期】2016(022)004
【总页数】11页(P1091-1101)
【关键词】葡萄;叶面喷肥;钾肥;钾吸收基因;基因表达
【作者】张成;贾海锋;王剑;纠松涛;王梦琦
【作者单位】南京农业大学园艺学院,江苏南京210095;南京农业大学园艺学院,江
苏南京210095;南京农业大学园艺学院,江苏南京210095;南京农业大学园艺学院,
江苏南京210095;南京农业大学园艺学院,江苏南京210095
【正文语种】中文
【中图分类】S601;S663.1
作为喜钾植物，葡萄对钾营养的需求巨大，叶面喷肥钾肥具有技术简单、用量少、见效快、利用率高等优点，在葡萄生产中逐渐被广泛应用[1-3]。

钾素在提高葡萄抗逆性、抗病性，促进果实发育，提高产量，增进品质等方面作用显著[4-7]，如Alt1ndili等[8]报道葡萄喷施1%2%的KNO3可以显著提高葡萄的产量和质量，
郑秋玲等[9]研究表明叶面喷施KH2PO4能使赤霞珠葡萄枝条中可溶性糖及淀粉的含量分别提高74.7%和27.7%。

近年来，葡萄全基因的测序为基因信息应用于农
业生产提供了全新的思路和条件[10-12]，初建青等利用葡萄N代谢相关基因的表达信息判断施肥效果[13-14]，王晨等利用葡萄花果发育相关基因的表达信息描绘
了葡萄物候期，并用来指导葡萄精确施肥[15]。

葡萄生长发育不仅受营养状况影响，还受各种外界环境的影响，基因信息可以精准反映植物营养吸收、转运、代谢等生理状态。

通过分析葡萄叶面喷施钾肥后其叶、花、果等生理指标的变化以及钾吸收、转运相关基因的表达，我们可以从宏观和微观两个层面全面而精准地评价
不同钾肥的作用效果，并筛选出适合葡萄叶面喷施的钾肥种类及浓度。

本文拟通过葡萄叶面喷施钾肥实验，从葡萄新梢生长、叶片生长、叶绿素含量、坐果率、
果实单粒重、可溶性固形物等生理指标，以及4个钾吸收相关基因: 钾离子转运体13(probable K+ transporter 13, HAK13)、钾离子反向转运体2(K+ efflux antiporter 2, KEA2)、 shaker家族内向整流钾离子通道(inward rectifying shaker-like K+ channel, SIRK)、 shaker家族外向整流钾离子通道(shaker-like potassium channel, SORK)的表达量两方面综合分析，评价不同种类钾肥及其浓
度的作用效果，以期为葡萄生产中钾肥的施用提供一定参考。

1.1 材料来源
本研究所用实验材料为5年生‘夏黑’(V. vinifera×V. labrusca Sumerblack)葡萄，由江苏省农博园提供。

K2SO4、K2CO3、KCl购自南京化学试剂有限公司，K2SO4·2MgSO4购自青海中信国安科技发展有限公司。

反转录试剂盒购自南京基天生物技术有限公司。

荧光定量染料SYBR GreenⅠ购自上海浦迪生物科技有限公司。

所用引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成(表1)。

1.2 试验设计
试验采用两个喷施时期和三个喷施浓度，以喷清水为对照。

喷施时期为盛花期(2014年5月25日)和果实膨大期(2014年7月16日)，三个喷施浓度为0.2%、0.5%、 0.8%的K2SO4、 K2CO3、K2SO4·2MgSO4和KCl溶液(质量比)。

选长
度和粗度基本一致的葡萄植株，于上午7点对葡萄叶面和叶背分别喷施钾肥，喷施量以叶面滴水为度。

每个处理3棵葡萄，分别于喷施后0、 6、 12、 24和48 h采第15个节位长枝条上的第9、 10节位的成熟叶片，液氮处理后-40℃保存备用。

1.3 测定项目与方法
1.3.1 生理指标测定每个处理随机选取10个枝条，分别于处理前和处理10天后测量新梢长度和成熟叶的长与宽，计算新梢生长率和叶片大小增长率。

盛花期喷施钾肥后，每个处理随机选取10个花序，统计花蕾数，待坐果后统计坐果数，计算坐果率。

坐果率(%)=(坐果数/花蕾数)×100。

喷施处理10天后采第15个节位长枝条上的第9、 10节位的成熟叶片测定叶绿素含量。

测定和计算方法参考郝再彬等[16]和叶济宁[17]的方法。

果实成熟时(8月10日)，每处理随机选取10穗葡萄，用电子天平(0.01g)称量单果重，并用可溶性固形物含量浓度检测仪(LH-T32，杭州陆恒生物)测量葡萄可溶性固形物含量。

测得的各项生理数据采用SPSS进行方差分析。

1.3.2 RNA的提取与CDNA的合成‘夏黑’葡萄叶片总RNA的提取、消化参照张彦苹等[18]和Chang等[19]的方法。

mRNA的纯化采用Promega公司生产的PloyATtract® mRNA Isolation System IV试剂盒进行。

cDNA合成以mRNA为模板，引物P01反转录合成cDNA第一条链，引物P02延伸加帽子，空气加热条件下42℃保温1 h，75℃保温10 min，冰上冷却2min后，-70℃保存备用。

1.3.3 荧光定量PCR 应用Bio-Rad My-IQ 2荧光定量PCR仪进行实时定量。

反应体系按SYBR GreenⅠ(TOYOBO)说明书进行。

以葡萄看家基因UBI作为内参。

扩增体系含1 μL cDNA，上下游引物各0.8 μL(引物信息详见表1)，10 μL反应
MIX，7.4 μLddH2O，总体系20μL。

反应程序为95℃变性1 min，95℃变性10 s，Tm退火20 s，72℃延伸30 s，40个循环; 反应结束后分析荧光值变化曲线以及融解曲线。

试验设3次重复，试验数据用LinRegPCR[21]和Excel软件分析，采用2-△△CT计算方法，以0 h为对照进行相对表达量分析。

2.1 叶面喷施不同浓度钾肥对坐果率的影响
钾肥可以促进葡萄花果发育，对葡萄坐果率有重要影响。

本实验结果显示叶面喷施四种钾肥对葡萄坐果率的影响均达到了显著水平。

其中K2SO4·2MgSO4效果最佳，在0.2%的喷施浓度下坐果率高达48.3%，比对照增长19.8%。

K2SO4效果次之，其喷施浓度为0.5%时坐果率最高，为46.33%，比对照提高14.9%。

K2CO3和KCl效果最差，其喷施浓度均为0.5%时坐果率最高，分别为43.63%和43.30%，分别比对照提高8.1%和7.4%(表2)。

2.2 叶面喷施不同浓度钾肥对叶片和新梢生长的影响
葡萄叶片和新梢是葡萄的重要营养器官，叶面喷肥可以直接作用于叶片和新梢，对其生长有着巨大影响。

本实验结果显示盛花期和果实膨大期喷施钾肥均可以显著影响叶片和新梢的生长。

四种钾肥均以K2SO4·2MgSO4效果最佳，其在盛花期喷施浓度为0.2%时叶片增长率和新梢增长率最高，果实膨大期喷施浓度为0.5%时叶片增长率最高，喷施浓度为0.2%时新梢增长率最高。

K2CO3效果次之，其在盛花期的喷施浓度为0.5%时新梢和叶片的增长率最高，在果实膨大期的喷施浓度为0.8%时新梢和叶片增长率最高。

K2SO4和KCl效果最差，这两种钾肥在盛花期的喷施浓度为0.2%时新梢和叶片的增长率较高，而在果实膨大期的喷施浓度为0.5%时新梢和叶片的增长率较高(表3)。

2.3 叶面喷施不同浓度钾肥对叶片叶绿素含量的影响
四种钾肥在不同喷施浓度下对葡萄叶片叶绿素含量的影响均达到了显著水平。

其中K2SO4·2MgSO4效果最显著，盛花期喷施浓度为0.2%时叶绿素含量最高，果实
膨大期喷施浓度为0.5%时叶绿素含量最高。

K2SO4和K2CO3效果次之，盛花期两种钾肥喷施浓度均为0.5%时葡萄叶片叶绿素含量最高，果实膨大期K2SO4喷
施浓度为0.5%时叶绿素含量最高，K2CO3喷施浓度为0.8%时叶绿素含量最高。

KCl效果最差，其在盛花期和果实膨大期的喷施浓度均为0.5%时叶绿素含量最高(表4)。

2. 4 叶面喷施不同浓度钾肥对葡萄果实品质的影响
葡萄果实可溶性固形物含量主要指葡萄果实中可溶性糖类物质的积累量，葡萄单果重则指葡萄单粒果实的平均重量，这两项指标是评价葡萄果实品质的重要参考。

本实验结果显示葡萄叶面喷施不同种类及浓度钾肥对这两项指标的影响差异较大。

K2SO4·2MgSO4效果最显著，其在盛花期的喷施浓度为0.2%时果实单粒重和可
溶性固形物均达到最高，在果实膨大期喷施浓度为0.5%时两项指标均达到最高。

K2SO4和K2CO3效果次之，其中K2SO4在两个时期的喷施浓度均为0.5%时葡
萄果实单粒重和可溶性固形物达到最高，而K2CO3在盛花期的喷施浓度为0.5%
时果实单粒重和可溶性固形物含量最高，在果实膨大期喷施浓度为0.8%时单粒重最高，喷施浓度为0.5%时可溶性固形物含量最高。

KCl效果最差，其对单粒重和
果实可溶性固形物的影响均不显著，甚至对果实可溶性固形物产生了不利影响，例如在果实膨大期三个喷施浓度均降低了葡萄果实的可溶性固形物含量(表5)。

2.5 叶面喷施不同浓度钾肥对钾吸收相关基因表达的影响
2.5.1 叶面喷施4种钾肥对VvHAK13表达的影响VvHAK13属于高亲和性钾离
子转运体KUP/HAK/KT家族，不仅负责对K+的吸收，对K+在植物体内的运输也有着重要作用。

本实验结果显示叶面喷施4种钾肥均对VvHAK13的表达产生了
不同程度的抑制作用，VvHAK13的表达主要呈现先降低后升高和不断降低两种模式。

在盛花期，K2SO4和K2CO3的喷施浓度不超过0.5%，K2SO4·2MgSO4和KCl的喷施浓度不超过0.2%时，VvHAK13的表达呈先降低后升高趋势，超过时，
VvHAK13的表达则呈不断降低趋势。

在果实膨大期K2SO4、K2SO4·2MgSO4和KCl的喷施浓度不超过0.5%时VvHAK13的表达均呈先降低后升高趋势，超过0.5%时VvHAK13的表达则呈不断降低趋势，而K2CO3在三个喷施浓度下VvHAK13的表达均呈先降低后升高趋势(图1)。

2.5.2 叶面喷施4种钾肥对VvKEA2表达量的影响VvKEA2编码K+/H+反向转运体，属于CPA2家族，主要参与钾的装载，如在液胞中，KEA可能通过质子泵介导H+/K+的交换，从而完成钾的装载。

本研究结果显示，两个时期喷施4种钾肥均明显促进了VvKEA2的表达。

喷施K2SO4·2MgSO4对VvKEA2表达的促进作用最明显，K2SO4和K2CO3次之，KCl最差。

盛花期K2SO4和K2CO3喷施浓度为0.5%时VvKEA2的表达量最高，而K2SO4·2MgSO4和KCl的喷施浓度为0.2%时VvKEA2的表达量最高，在最适喷施浓度下该时期VvKEA2的表达量呈先提高后降低趋势。

果实膨大期K2CO3的喷施浓度为0.8%时VvKEA2的表达量最高，其余三种钾肥的喷施浓度均为0.5%时VvKEA2的表达量最高，在最佳喷施浓度下该时期VvKEA2的表达均随时间延长不断提高，说明该时期钾肥的效果比盛花期更加持久(图2)。

2.5.3 叶面喷施4种钾肥对VvSIRK表达量的影响VvSIRK属于Shaker钾离子通道中内向整流K+通道基因，主要负责钾离子的低亲和吸收。

本实验研究结果显示叶面喷施K2CO3对VvSIRK的影响最为明显，其次是K2SO4·2MgSO4、
K2SO4和KCl。

叶面喷肥处理后VvSIRK在两个时期的表达均呈先升高后降低趋势。

盛花期四种钾肥的喷施浓度均为0.2%时VvSIRK的表达量达到最高。

果实膨大期K2SO4·2MgSO4的喷施浓度为0.2%时VvSIRK的表达量最高，K2SO4和KCl的喷施浓度为0.5%时VvSIRK的表达量最高，而K2CO3的喷施浓度为0.8%时VvSIRK的表达量最高。

相比于其他3个基因，VvSIRK的表达受到低浓度钾肥的影响较为明显，尤其在盛花期，几种钾肥均在0.2%的喷施浓度下使VvSIRK的
表达量达到最高(图3)。

这可能与SIRK属于低亲和钾离子吸收通道，主要负责低
浓度钾离子的吸收有关。

2.5.4 叶面喷施4种钾肥对VvSORK表达量的影响
VvSORK属于Shaker钾离子通道中外向整流K+通道，在植物地上部K+的积累
中起着重要的作用。

实验结果表明叶面喷施K2SO4·2MgSO4对VvSORK的影响
最明显，其次是K2SO4、 K2CO3和KCl。

盛花期K2SO4和K2CO3的喷施浓度为0.5%时VvSORK的表达量最高，K2SO4·2MgSO4和KCl的喷施浓度均为0.2%时VvSORK的表达量最高。

果实膨大期K2SO4、K2SO4·2MgSO4和KCl的喷
施浓度均为0.5%时VvSORK的表达量最高，而K2CO3的喷施浓度为0.8%时VvSORK的表达量最高。

盛花期喷施K2SO4和KCl后VvSORK的表达量先升高
后降低，而在果实膨大期喷施后VvSORK的表达量则随时间延长不断升高。

喷施
K2CO3和K2SO4·2MgSO4后，VvSORK表现出独特的表达模式，喷施K2CO3
后VvSORK的表达量先升高后降低再升高，而喷施K2SO4·2MgSO4后VvSORK 的表达则先降低，随后又开始大幅度升高(图4)。

钾是植物细胞中最丰富的离子，在植物的生长和发育中起重要作用，如促进酶的活化、蛋白质合成、光合作用，维持渗透压、调节叶片和气孔运动和细胞伸长等[20-25]。

葡萄钾吸收、转运机理的研究主要集中在根际施钾对葡萄浆果及葡萄酒品质的影响上[26-30]，对于葡萄叶面喷施钾肥相关理论的研究尚且不多。

叶面喷
施钾肥技术已经在棉花[31-33]、小麦[34]、马铃薯[35]等作物上得到了广泛应用和深入研究，研究结果均表明叶面喷施钾肥可以有效提高作物的产量、品质、抗病性等。

本研究表明对葡萄叶面喷施钾肥不仅可以促进葡萄叶片和新梢的营养生长，为后期果实的发育提供充足的物质基础，也可提高葡萄的坐果率和单粒重、可溶
性固形物等品质指标，有助于提升葡萄的产量和质量。

不同种类钾肥由于其物理化学性质不同，其肥效也不尽相同。

本实验综合葡萄生理
指标和基因表达水平得出四种钾肥喷施效果为:
K2SO4·2MgSO4>K2SO4>K2CO3>KCl。

盛花期K2SO4和K2CO3的最适喷施
浓度为0.5%，K2SO4·2MgSO4和KCl的最适喷施浓度为0.2%; 果实膨大期
K2SO4、K2SO4·2MgSO4和KCl的最适喷施浓度为0.5%，K2CO3的最适喷施浓度为0.8%。

按照传统观念，葡萄是典型的“忌氯”植物，氯元素会影响葡萄植株的发育，阻碍葡萄果实糖分积累等。

然而本实验结果显示选择合适的喷施浓度和喷施时期，KCl和其他钾肥一样可以有效促进葡萄叶片生长和果实发育。

例如在盛花期对葡萄喷施0.2%的KCl有效促进了葡萄叶片、新梢的生长，提高了果实单粒重和可溶性固形物含量，但在果实膨大期喷施KCl则降低了葡萄果实可溶性固形
物含量。

周淑惠等[36]的研究也证明了KCl可以有效促进葡萄果实的生长发育。

朱本岳等试验发现，施用钾肥后浆果中的Mg含量比对照降低4.7%14.7%，据此他提出了K与Mg之间存在着拮抗作用[37]。

但在实际施肥过程中发现，二者同时
存在着互助作用，Nahdi等[38]连续两年的田间试验发现葡萄K/Mg比例不协调
会导致葡萄主茎坏死，患黄叶病。

张漱茗等[39]、亓桂梅等[40]的试验得出类似结论，认为K、Mg配合后，可以明显提高钾肥增产量。

本实验得出了相似的结果，实验所选用的4种钾肥中，K2SO4·2MgSO4对葡萄叶片生长和果实品质的促进作用最明显，四个钾吸收基因对喷施K2SO4·2MgSO4的响应也最显著。

葡萄生长发育不同时期对营养的需求有所差异，因此各时期的施肥效果也不同，其中施肥效果最好的时期应为植物营养的最大效率期[41]。

据Abha等的研究报道，在葡萄坐果30天后叶面喷施K2SO4，随着K2SO4浓度的增大，葡萄果实可溶性固形物总量及总糖含量明显增加[42]。

马文娟等[43]、张志勇等[44]研究显示，果实膨大期葡萄钾累积量最大，该时期葡萄浆果快速生长、糖分快速积累，此时施
用钾肥，既可满足葡萄成熟对钾的需求，又有助于提高葡萄品质。

Pratelli等研究发现VvSIRK在葡萄果实快速发育时期具有较高的表达量[45]，说明该时期葡萄植
株需要从外界吸收较多的钾元素，以满足葡萄浆果快速膨大对营养元素的需求。

本实验结果与前人研究较为相似。

在葡萄果实膨大期喷施钾肥效果更佳，且肥效更加持久。

在果实膨大期喷施钾肥后，葡萄叶片和果实各项生理指标提升幅度明显高于盛花期，该时期三个重要钾吸收基因VvSIRK、 VvKEA2、 VvSORK在最佳喷施浓度下均能保持较长时间的高表达水平，且表达量随时间延长不断升高，说明该时期喷施钾肥比盛花期喷施具有更高更持久的肥效。

此外，果实膨大期葡萄对钾肥喷施液浓度要求更高，例如KCl和K2SO4·2MgSO4在该时期的最适喷施浓度为0.5%，而在盛花期则为0.2%。

本实验中所选的4个钾吸收相关基因所编码的蛋白是葡萄钾离子吸收、转运的重要通道或载体，其表达量反映了葡萄植株中钾离子吸收运输的活跃程度，叶面喷施钾肥后，这些基因表达越活跃，说明其对钾的吸收效率越高，因此也越有利于葡萄叶片和果实等的生长发育。

本实验结果也证明了这一观点，钾吸收基因的表达和葡萄生理指标的变化具有较高的一致性，叶面喷施钾肥后，基因响应剧烈、持续时间长的，叶片和果实等生理指标提升也更明显。

这也证明了利用基因表达水平评价钾肥肥效的有效性。

实验中喷施K2CO3和K2SO4·2MgSO4后VvSORK呈现出独特的表达模式，其表达量先下降后上升，或者先上升后下降再上升。

Lacombe 等的研究表明植物中SORK通道受到细胞内外pH的强烈影响[46]，而K2CO3溶液呈弱碱性，K2SO4·2MgSO4溶液呈弱酸性，这可能是造成VvSORK独特表达模式的原因。

这种现象也提示我们在对作物进行叶面喷肥的时候，肥料喷施液的pH也会影响植物对肥料的吸收效果，应当给予充分考虑。

此外，VvHAK13和其他三个钾吸收相关基因不同，其表达受到了叶面喷施钾肥的抑制。

Maser等，Ahn等[47-48]的研究表明缺钾可诱导KUP /HAK/KT家族高亲和性成员的表达，可能是因为缺钾时，KUP /HAK/KT家族高亲和性成员参与到不同组织或细胞间K+的转运以平衡K+的分布。

然而当K+供应充分时，其转运、平衡K+的作用降
低，这可能是造成叶面喷施钾肥后VvHAK13表达量降低的原因。

缺钾可以诱导VvHAK13的表达，这一特性使得VvHAK13可被当作“信号基因”用来预测葡萄对钾素的需求程度。

当该基因表达量较高时，说明葡萄植株缺少钾元素，则可以通过叶面喷施钾肥快速补充钾元素。

当其表达量较低时，则说明葡萄植株中钾元素充足，不需补充钾素。

然而钾素对VvHAK13的抑制可能涉及更为复杂的机制，需要进一步研究。

葡萄叶面喷施钾肥可以有效促进葡萄叶片和果实的生长发育，四种钾肥的效果依此为: K2SO4·2MgSO4>K2SO4>K2CO3>KCl。

盛花期K2SO4和K2CO3的最适喷施浓度为0.5%，K2SO4·2MgSO4和KCl的最适喷施浓度为0.2%; 果实膨大期
K2SO4、K2SO4·2Mg SO4和KCl的最适喷施浓度为0.5%，K2CO3的最适喷施浓度为0.8%。

适宜的喷施浓度可以有效提高钾吸收相关基因的表达，是其提高钾吸收利用的机理之一。

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