常用标记技术(上课用)20100929
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常用标记技术
标记技术的种类—按标记物分
酶学标记 荧光标记 同位素标记 基因标记 BrdU标记 荧光染料标记 免疫磁珠 MTT比色法
标记技术的种类—按标记方法分
免疫标记技术
分子标记技术
一、免疫标记技术
定义：是将抗原与抗体用可以微量检测的标
记物（如荧光素、酶、放射性同位素等）进行
3.待测组织细胞标本中DNA或RNA的检测
人乳头状瘤病毒 HPV
FISH
基因芯片技术——是集成化的核酸分子杂交技术。
1.双抗体夹心法
免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原
2.竞争法
免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图
3．间接法
为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG
与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低 了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗 体常设计成反流免疫层析法(图22-4)。
测定时先将缓冲液加在D处层析至C处使金标物复溶， 然后将标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用 下向F端移动，若标本中有待测抗体存在，则与膜上 抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至 膜上标记线G处时，在F处加缓冲液，合上测试卡， A处的强大吸水作用使膜上液体反向流动，标本中非 特异性IgG及无关物向E处反向层析，随后而来的金 标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕红色 线条。无棕红色线条出现则表明血清中无特异性抗 体。
对
照
管
测
定
管
BAS-ELISA:以生物素-亲和素-过氧化物酶复 合物作为指示剂，组成一种新的生物放大系 统，进一步提高检测的敏感度。 一个亲和素分子可以结合四个生物素分子， 结合非常稳定。亲和素和生物素可以与酶、 抗体、荧光素等分子结合，而不影响后者的 生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素 分子，通过生物素又可连接多个亲和素。因 此大大提高检测的敏感度。
二、原位分子杂交技术
基本原理：利用已知的核苷酸序列DNA片段作为探 针，按照碱基配对的互补原则去识别组织切片或细 胞涂片中的待测DNA或RNA，并与之特异结合，即 DNA经变性处理（如热、酸、碱），碱基间的氢键 发生断裂，使双链DNA解离成单链。当终止变性处 理，逐渐恢复温度及pH值时，被分开的单链自动地 复性形成原来的双链结构。由于碱基是严格配对的， 因此一种探针DNA只能与待检标本互补DNA结合。因 此将标记有同位素、荧光素、生物素或地高辛的探 针DNA固定在标本上，用放射自显影技术或免疫组 织化学技术可显示出探针DNA相结合的待测DNA或 RNA.
将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗
检测液相中未知抗体
竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记 抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体
ELISA(双抗体夹心法)
检测HBsAg原理示意
测抗原
ELISA-间接法—测未知抗体
竞争法—抗原、抗体
二、原位分子杂交技术
DNA浓度
变性剂 （尿素）、 酸碱、 热、 有机溶剂
DNA片段的大小
DNA片段复杂性
合适的复性温度 适当的离子强度
（乙醇）
二、原位分子杂交技术
1.核酸探针的制备 2.核酸探针的标记 3.待测组织细胞标 本中DNA或RNA的检
测
二、原位分子杂交技术
1.核酸探针的制备
（5）化学发光技术
化学发光免疫测定（CLIA）：是用化学发光
剂直接标记抗原或抗体（化学发光剂标记 物），与待测标本中相应抗体或抗原、磁颗 粒性的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状 态（沉淀部分）和游离状态的化学发光剂标 记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发 光反应，通过对发光强度的检测进行定量或 定性检测。 常用的发光剂是：吖啶酯类发光剂。
二、原位分子杂交技术
2.核酸探针的标记
（一）、标记物
—放射性同位素标记物
—非放射同位素标记物
1.放射性同位素 特点： ●放射自显影技术检测，信号的强弱通过 计数银粒的多少易于进行定量分析。 主要缺点 射线对人体有伤害 放射性物质需特殊的处理 半衰期短不宜存放使用
2. 非放射性标记物 常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物 素（biotin）、荧光素。 特点： 敏感性不如同位素标记 稳定性和分辨率高 检测时间短 操作简便 不需特殊的防护设备 不存在放射性污染
技术要点
①
②
斑点金免疫渗滤试验： 金免疫层析试验：是指用胶体金标记技术和 蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的 快速固相膜免疫分析技术。将各种反应试剂 分点固定在试纸条上，检测标本加在试纸条 的一端，通过毛细血管作用，使样品溶液在 层析材料上泳动，样本中的待测物与层析材 料中的反应试剂发生特异性结合反应，形成 的复合物被富集或固定在层析条上的特定区 域（检测线），通过标记免疫技术显色。点：检查每种抗 原均需制备相应的 特异性荧光抗体， 敏感性低于间接法。
2.间接法 优点：敏感性高、只需制备一种荧光素标记
抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原。
3.放射免疫技术(radiommunoassay,RIA)是
指将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应 的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪 物的标记免疫测定方法。
假设受检标本中不含抗原时的反应条件为： 4（Ag*）＋2（Ab）→2（Ag*Ab）＋2（Ag*） 在标本中存在抗原时，举例如下： 4（Ag*）＋4（Ag）＋（2Ab）→ 1（Ag*Ab）＋3（Ag*）＋1（AgAb）＋3（Ag）
4.金免疫技术
金免疫测定技术是指对体液中抗原、抗体含 量定量测定的技术，包括斑点金免疫渗滤试 验和免疫层析试验。 想的圆球核，较小的胶体金颗粒 基本是圆球形的，较大的胶体金 颗粒（一般指大于30nm以上的） 多呈椭圆形。在电子显微镜下可 观察胶体金的颗粒形态。
酶标仪
酶标仪
（2）免疫荧光技术
免疫荧光技术是免疫标记技术中发展最早
的一种，是用化学方法使荧光素标记的抗 体（或抗原）与组织或细胞中的相应抗原 （或抗体）结合，进行定性定位检查抗原 或抗体的方法。
常用的荧光色素：
异硫氰酸荧光素（FITC）—黄绿色荧光
藻红蛋白（PE）—红色荧光
（2）免疫荧光技术 —将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精 确性相结合。
常用的免疫标记物质
类别 荧光素 标记物 FITC、RB200、TRITC 镧系元素螯合物 放射性核素
3H、14C、32P、57Gr 125I、131I
用途 免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定
酶
HRP、AP
免疫组化 免疫分析测定
化学发光物 Luminol、lucigenin 金属颗粒 胶体金、铁蛋白
（一）探针的概念： 探针（probe） 指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被 特殊方法所检测的分子。 例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探 针与靶分子的相互作用。 基因探针 指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交 后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同 位素标记）的核苷酸链。
胶体金颗粒的基础金核并非是理
①
②
斑点金免疫渗滤试验：是指将抗原或抗体 点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制成 抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水 材料上，依次在膜上滴加标本、免疫金及 洗涤液等试剂并与硝纤膜上的相应抗体或 抗原发生反应，过量试剂很快渗入吸水材 料中。抗原抗体反应后，形成大分子胶体 金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红 色斑点。 金免疫层析试验：
（二）探针种类 （1）基因组DNA探针 为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码 序列。 （2）cDNA探针 以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于 mRNA的DNA链。 （3）RNA探针 以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。 具高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。 （4）寡核苷酸探针
常用于标记的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷 酸酶（AP）等。
Ag + AbE
AgAbE+ 底物
呈色反应
EIA
(酶免疫测定法)
固相
聚苯乙烯
Ag 或 Ab 吸 附 到 固 相 上的过程,称为包被
酶免疫技术的基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性； ②酶促反应的专一性，保证了特异性； ③底物反应的放大作用，提高了敏感性； ④酶标试剂保存稳定； ⑤操作简便，安全易行。
免疫分析测定 免疫组化
免疫分析测定
（1）酶免疫技术
酶免疫分析法（EIA）是指用酶标记的抗体进行的抗 原抗体反应。它将抗原抗体反应的特异性与酶对底物 高效催化作用结合起来，通过酶作用于底物后显色， 以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分 析，敏感度可达ng/ml甚至pg/ml水平。 常用方法：酶联免疫吸附试验、酶免疫组合法
酶联免疫吸附试验（ELISA）：是指将已知
的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微 量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相载 体表面进行，通过洗涤将固相上的抗原抗体 复合物与液相中的游离成分分开。 分类：双抗体夹心法、间接法、BAS-ELISA。
分 类
双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 间接法（Indirect ELISA）：
常用酶及其底物
1.辣根过氧化物酶(HRP)
常用底物： (1)邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。 (2)四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌 性, 但水溶性差。 2.碱性磷酸酶(AP) 常用底物 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性较HRP差，且价 高，故应用不如HRP普及。
标记，在与标本中相应的抗体或抗原反应后，
测定复合物中的标记物，是目前应用最广泛的
免疫学检测技术。
通过标记物的放大作用，提高了免疫技术 的 敏感性。
一、免疫标记技术
免疫标记技术
放射物标记技术 酶标记技术 免疫荧光技术 其他标记技术
酶联免疫吸附技术
酶免疫组化技术
双抗体夹心法 竞争法 间接法 双抗原夹心法 双位一点法
标记技术的种类—按标记物分
酶学标记 荧光标记 同位素标记 基因标记 BrdU标记 荧光染料标记 免疫磁珠 MTT比色法
标记技术的种类—按标记方法分
免疫标记技术
分子标记技术
一、免疫标记技术
定义：是将抗原与抗体用可以微量检测的标
记物（如荧光素、酶、放射性同位素等）进行
3.待测组织细胞标本中DNA或RNA的检测
人乳头状瘤病毒 HPV
FISH
基因芯片技术——是集成化的核酸分子杂交技术。
1.双抗体夹心法
免疫层析试验双抗体夹心法测大分子抗原
2.竞争法
免疫层析试验竞争法测小分子抗原原理图
3．间接法
为了消除待测血清标本中大量的非特异性IgG
与特异性IgG竞争结合金标记抗人IgG，降低 了试验敏感性，胶体金间接免疫层析法测抗 体常设计成反流免疫层析法(图22-4)。
测定时先将缓冲液加在D处层析至C处使金标物复溶， 然后将标本加在E处使其与染料一起在膜的层析作用 下向F端移动，若标本中有待测抗体存在，则与膜上 抗原结合形成抗原抗体复合物，待有色染料延伸至 膜上标记线G处时，在F处加缓冲液，合上测试卡， A处的强大吸水作用使膜上液体反向流动，标本中非 特异性IgG及无关物向E处反向层析，随后而来的金 标羊抗人抗体与抗原抗体复合物结合，出现棕红色 线条。无棕红色线条出现则表明血清中无特异性抗 体。
对
照
管
测
定
管
BAS-ELISA:以生物素-亲和素-过氧化物酶复 合物作为指示剂，组成一种新的生物放大系 统，进一步提高检测的敏感度。 一个亲和素分子可以结合四个生物素分子， 结合非常稳定。亲和素和生物素可以与酶、 抗体、荧光素等分子结合，而不影响后者的 生物活性。一个抗体分子可偶联90个生物素 分子，通过生物素又可连接多个亲和素。因 此大大提高检测的敏感度。
二、原位分子杂交技术
基本原理：利用已知的核苷酸序列DNA片段作为探 针，按照碱基配对的互补原则去识别组织切片或细 胞涂片中的待测DNA或RNA，并与之特异结合，即 DNA经变性处理（如热、酸、碱），碱基间的氢键 发生断裂，使双链DNA解离成单链。当终止变性处 理，逐渐恢复温度及pH值时，被分开的单链自动地 复性形成原来的双链结构。由于碱基是严格配对的， 因此一种探针DNA只能与待检标本互补DNA结合。因 此将标记有同位素、荧光素、生物素或地高辛的探 针DNA固定在标本上，用放射自显影技术或免疫组 织化学技术可显示出探针DNA相结合的待测DNA或 RNA.
将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗
检测液相中未知抗体
竞争法（Competitive ELISA) ： 将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记 抗原或抗体 检测液相中的可溶性抗原或抗体
ELISA(双抗体夹心法)
检测HBsAg原理示意
测抗原
ELISA-间接法—测未知抗体
竞争法—抗原、抗体
二、原位分子杂交技术
DNA浓度
变性剂 （尿素）、 酸碱、 热、 有机溶剂
DNA片段的大小
DNA片段复杂性
合适的复性温度 适当的离子强度
（乙醇）
二、原位分子杂交技术
1.核酸探针的制备 2.核酸探针的标记 3.待测组织细胞标 本中DNA或RNA的检
测
二、原位分子杂交技术
1.核酸探针的制备
（5）化学发光技术
化学发光免疫测定（CLIA）：是用化学发光
剂直接标记抗原或抗体（化学发光剂标记 物），与待测标本中相应抗体或抗原、磁颗 粒性的抗原或抗体反应，通过磁场把结合状 态（沉淀部分）和游离状态的化学发光剂标 记物分离开来，然后加入发光促进剂进行发 光反应，通过对发光强度的检测进行定量或 定性检测。 常用的发光剂是：吖啶酯类发光剂。
二、原位分子杂交技术
2.核酸探针的标记
（一）、标记物
—放射性同位素标记物
—非放射同位素标记物
1.放射性同位素 特点： ●放射自显影技术检测，信号的强弱通过 计数银粒的多少易于进行定量分析。 主要缺点 射线对人体有伤害 放射性物质需特殊的处理 半衰期短不宜存放使用
2. 非放射性标记物 常用的有地高辛（digoxigenin，Dig）、生物 素（biotin）、荧光素。 特点： 敏感性不如同位素标记 稳定性和分辨率高 检测时间短 操作简便 不需特殊的防护设备 不存在放射性污染
技术要点
①
②
斑点金免疫渗滤试验： 金免疫层析试验：是指用胶体金标记技术和 蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的 快速固相膜免疫分析技术。将各种反应试剂 分点固定在试纸条上，检测标本加在试纸条 的一端，通过毛细血管作用，使样品溶液在 层析材料上泳动，样本中的待测物与层析材 料中的反应试剂发生特异性结合反应，形成 的复合物被富集或固定在层析条上的特定区 域（检测线），通过标记免疫技术显色。点：检查每种抗 原均需制备相应的 特异性荧光抗体， 敏感性低于间接法。
2.间接法 优点：敏感性高、只需制备一种荧光素标记
抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原。
3.放射免疫技术(radiommunoassay,RIA)是
指将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应 的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪 物的标记免疫测定方法。
假设受检标本中不含抗原时的反应条件为： 4（Ag*）＋2（Ab）→2（Ag*Ab）＋2（Ag*） 在标本中存在抗原时，举例如下： 4（Ag*）＋4（Ag）＋（2Ab）→ 1（Ag*Ab）＋3（Ag*）＋1（AgAb）＋3（Ag）
4.金免疫技术
金免疫测定技术是指对体液中抗原、抗体含 量定量测定的技术，包括斑点金免疫渗滤试 验和免疫层析试验。 想的圆球核，较小的胶体金颗粒 基本是圆球形的，较大的胶体金 颗粒（一般指大于30nm以上的） 多呈椭圆形。在电子显微镜下可 观察胶体金的颗粒形态。
酶标仪
酶标仪
（2）免疫荧光技术
免疫荧光技术是免疫标记技术中发展最早
的一种，是用化学方法使荧光素标记的抗 体（或抗原）与组织或细胞中的相应抗原 （或抗体）结合，进行定性定位检查抗原 或抗体的方法。
常用的荧光色素：
异硫氰酸荧光素（FITC）—黄绿色荧光
藻红蛋白（PE）—红色荧光
（2）免疫荧光技术 —将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精 确性相结合。
常用的免疫标记物质
类别 荧光素 标记物 FITC、RB200、TRITC 镧系元素螯合物 放射性核素
3H、14C、32P、57Gr 125I、131I
用途 免疫组化 免疫分析测定 免疫分析测定
酶
HRP、AP
免疫组化 免疫分析测定
化学发光物 Luminol、lucigenin 金属颗粒 胶体金、铁蛋白
（一）探针的概念： 探针（probe） 指能与特定靶分子发生特异性相互作用，并能被 特殊方法所检测的分子。 例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探 针与靶分子的相互作用。 基因探针 指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交，杂交 后又能被特殊方法检测的已知被标记（同位素或非同 位素标记）的核苷酸链。
胶体金颗粒的基础金核并非是理
①
②
斑点金免疫渗滤试验：是指将抗原或抗体 点加在固相载体硝酸纤维素薄膜上，制成 抗原或抗体包被的微孔滤膜并贴置于吸水 材料上，依次在膜上滴加标本、免疫金及 洗涤液等试剂并与硝纤膜上的相应抗体或 抗原发生反应，过量试剂很快渗入吸水材 料中。抗原抗体反应后，形成大分子胶体 金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现红 色斑点。 金免疫层析试验：
（二）探针种类 （1）基因组DNA探针 为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码 序列。 （2）cDNA探针 以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于 mRNA的DNA链。 （3）RNA探针 以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。 具高杂交效率，但易于降解和标记方法复杂。 （4）寡核苷酸探针
常用于标记的酶有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷 酸酶（AP）等。
Ag + AbE
AgAbE+ 底物
呈色反应
EIA
(酶免疫测定法)
固相
聚苯乙烯
Ag 或 Ab 吸 附 到 固 相 上的过程,称为包被
酶免疫技术的基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性； ②酶促反应的专一性，保证了特异性； ③底物反应的放大作用，提高了敏感性； ④酶标试剂保存稳定； ⑤操作简便，安全易行。
免疫分析测定 免疫组化
免疫分析测定
（1）酶免疫技术
酶免疫分析法（EIA）是指用酶标记的抗体进行的抗 原抗体反应。它将抗原抗体反应的特异性与酶对底物 高效催化作用结合起来，通过酶作用于底物后显色， 以颜色变化判断试验结果，可经酶标测定仪作定量分 析，敏感度可达ng/ml甚至pg/ml水平。 常用方法：酶联免疫吸附试验、酶免疫组合法
酶联免疫吸附试验（ELISA）：是指将已知
的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微 量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相载 体表面进行，通过洗涤将固相上的抗原抗体 复合物与液相中的游离成分分开。 分类：双抗体夹心法、间接法、BAS-ELISA。
分 类
双抗体夹心法（Sandwich ELISA)： 将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗 检测液相中的可溶性抗原 间接法（Indirect ELISA）：
常用酶及其底物
1.辣根过氧化物酶(HRP)
常用底物： (1)邻苯二胺(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。 (2)四甲基联苯胺(TMB)：反应后呈蓝色，无需避光，无致癌 性, 但水溶性差。 2.碱性磷酸酶(AP) 常用底物 对硝基苯磷酸酯(p-NPP)：产物为黄色。 AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性较HRP差，且价 高，故应用不如HRP普及。
标记，在与标本中相应的抗体或抗原反应后，
测定复合物中的标记物，是目前应用最广泛的
免疫学检测技术。
通过标记物的放大作用，提高了免疫技术 的 敏感性。
一、免疫标记技术
免疫标记技术
放射物标记技术 酶标记技术 免疫荧光技术 其他标记技术
酶联免疫吸附技术
酶免疫组化技术
双抗体夹心法 竞争法 间接法 双抗原夹心法 双位一点法