碳氮代谢测定

碳氮代谢测定
谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脱氢酶（GDH）是碳氮代谢的关键酶。

淀粉酶，转化酶，硝酸还原酶，
谷氨酰胺合成酶活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和M g 2+存在下，它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。

在反应体系中，谷氨酰胺转化为Y-谷氨酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。

谷氨酰胺合成酶活性可用产生的 Y-谷氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位Mmol mg -1 protein h - 1。

也可间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位A mg -1 protein h -1。

【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀；移液管（2 ml、
1ml）。

【试剂】提取缓冲液：0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，内含 2mmol/L Mg 2+，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。

称取 Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 7 H 2 0，0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用
0.05 mol/L HCl 调至 pH8.0，最后定容至 250ml ；反应混合液 A （0.1mol/L Tris-HCl 缓冲，PH7.4）：内含80mmol/L Mg 2+，20mmol/L谷氨酸钠盐，20mmol/L半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，称取 3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 7H 2 0, 0.8628g 谷氨酸钠盐， 0.6057g半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0. 1mol/L HCl调至pH7.4,定容至 250ml ；反应混合液B（含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入 80mmol/L 盐酸羟胺，pH7.4；显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和 0.6mol/L HCl混合液）：3.3176g TCA （三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 6H 2 0，去离子水溶解后，加5ml浓盐酸，定容至100ml；
40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。

【方法】1.粗酶液提取称取植物材料1g于研钵中，加3ml提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4C 下15,000g离心20min，上清液即为粗酶液。

2.反应1.6ml反应混合液氏加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混匀，于37°C下保温半小时，加入显色剂1ml，摇匀并放置片刻后，于5,000g下离心10min，取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6m】反应混合液A的为对照。

3.粗酶液中可溶性蛋白质测定取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml用考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（见实验28）。

4.原始数据记载5.结果计算：GS活力（A mg -1 protein h -1 ）=式中A-540nm处的吸光值；P-粗酶液中可溶性蛋白含量
（mg/ml）； V-反应体系中加入的粗酶液体积（ml）； T-反应时间（h）。

蔗糖合成酶的测定方法
一、仪器设备
冷冻离心机、恒温水浴、分光光度计二、试剂HEPES-NaOH （50mmol/L，pH7.5 ）缓冲液，包括 50mmol/L MgCI2； 2mmol/LEDTA； 0.2%（W/V）BSA； 2%PVP ；
0.1%间苯二酚：称取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。

30%盐酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L 果糖
三、操作方法1、粗酶液制备
称取0.5g样品(植物叶片去掉主叶脉)，洗净剪碎，置于预冷的研钵中，加3ml Hepes-NaOH缓冲液，冰浴研磨，10000Xg离心10min。

2、酶活性测定
依次加入50UL粗酶液，
50uLHepes-NaOH 缓冲液 pH7.5，20uL 50 mmol/LMgCI2， 20uL 100mmol/L UDPG，
20uL 100mmol/L6-磷酸果糖(20^L 100mmol/L 果糖)，
30°C中反应30min后，加入200 ^L 2mol/L NaOH终止反应，沸水煮10min，流水冷却，加入1.5ml 30%盐酸和0.5ml 0.1%间苯二酚，摇匀后置于80C水浴保温10min，冷却后置于480nm处，以提前杀死酶活性为空白比色测定蔗糖含量。

同时取50UL粗酶液，加入200 UL
2mol/L NaOH，以下同上操作，测定蔗糖含量。

3、蔗糖标线制作：
取0、40、80、120、160、200 ug/ml的蔗糖溶液50UL，操作同上，然后以蔗糖浓度为纵坐标，以吸光值为横坐标，得方程。

4、计算
样品中酶活性(Ug- gg 1・hg 1)=
式中C 一反应液催化产生的蔗糖总量(Ug)；V1-提取酶液时加入的缓冲
液体积(ml)；V2—酶反应时加入的粗酶液体积(ml)
淀粉酶活性的测定
1方法
1.1试剂配制淀粉酶提取缓冲液：0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的柠檬酸缓冲液(pH 5.6)配制；标准麦芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)：称取6.5 g 3,5-二硝基水杨酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2mol・L-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，摇匀，冷却后定容到1000 mL。

淀粉和麦芽糖为Sigma产品，其余试剂为国产分析纯试剂。

1.2测定方法
1.2.1酶液的提取
将每一个重复的3个果实去皮后切碎混匀，称取其果肉1g，置于预冷的研钵中，加 2mL预冷的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，将匀浆移入7mL的离心管中，再分别用1mL的0.1mol/L-1柠檬酸缓冲(pH 5.6)冲洗2次，于4C下以15000Xg离心 15min，上清液转移入另一个5mL离心管中，作为酶提取液备用。

1.2.2酶活性的测定取洁净的试管18支，作标记，每一个样品设1个对照。

总反应体积
为0.5mL，测定管含0.2mL的酶提取液和0.3mL的1%淀粉溶液；对照管含0.2 mL的酶提取
液和0.3mL的0.1mol/L-1柠檬酸溶液(pH 5.6,不含底物淀粉)将试管放入恒温40°C的水浴锅中，保温30min后取出，立即加入1.5mL的DNS试剂终止反应再将试管置于沸水浴中
10min，取出后冰浴冷却。

取反应液稀释10倍，测定波长520nm处的吸光值，同上做麦芽糖标
准曲线，从标准曲线上查出麦芽糖的含量，计算淀粉酶的总活性。

周蓓云.a-和B-淀粉酶活性的测定.见：中国科学院上海植物生理研究所，上海市植物生
理学会编.现代植物生理学实验指南.北京：科学出版社，1999.123~124
转化酶的测定
转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物一一蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库
提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的
氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和
利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。

试剂：
1、10%蔗糖溶液
2、葡萄糖标准液(500 ^g/ml)
3、0.05mol/1的磷酸缓冲液
4、(DNS) 3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mo1/1 NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。

2、酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液
1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。

以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。

3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定
①标准曲线：取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液：管号
1 2 3 4 5 6 葡萄糖原液量 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 (ml)
加蒸馏水量(ml) 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0 葡萄糖浓度(P0 100 200 300 400 500 g/ml) 在上述各管中分别加入1.5ml 3,5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，
取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml,混匀，以1号管为空白，测540nm波长下的OD值。

以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

②酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml反应液，加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml，测定540nm波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。

4、结果计算：
A=（N-N’）*V/（T*W*1000） A：转化酶的活性（mg/gfw/h）N：酶反应
液中还原糖的浓度（pg/ml）
N’：钝化酶反应液中还原糖的浓度（Pg/ml）V：酶反应液的总体积T：反应时间
W：材料鲜重
试剂：
谷氨酰胺合成酶：
Tris （三羟甲基氨基甲烷）、MgSO 4 .7 H 2 0、DTT （二硫苏糖醇）、蔗糖、谷氨酸钠盐、半胱氨酸、EGTA、盐酸羟胺、TCA （三氯乙酸）、FeCl 3.6H 2 O、ATP、 Rubisco 酶：
磷酸钾、EDTA （乙二胺四乙酸）、硫基乙醇、KCl、MgCl2、ATP、DDT （二硫苏糖醇）、NADH （还原型辅酶1） KHCO3、RUBP、三磷酸甘油酸激酶、三磷酸甘油醛脱氢酶、
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