纤维素酶的基因克隆及表达研究进展(好嗯).doc

湖北大学
毕业论文设计
题目纤维素酶的基因克隆及表达研究进展专业年级2007 生物工程
学生姓名许莹
学号014607200446
指导老师江正兵
2010年 12 月 5 日
目录
1.前言----------------------------------------------------------------------4
1.1 纤维素酶的组成--------------------------------------------4
1.2纤维素酶的分类与分布-------------------------------------5
1.3纤维素酶降解纤维素的机理研究--------------------------6
1.4纤维素酶的分子结构----------------------------------------7
1.5 纤维素酶在畜禽生产中的应用----------------------------9
1.5.1 在牛日粮中的应用------------------------------9
1.5.2 在鸡日粮中的应用------------------------------9
1.5.3 在猪日粮中的应用------------------------------10 2．纤维素酶的研究现状及展望-------------------------------------10 3. 纤维素酶的基因克隆与表达------------------------------------10
3.1 纤维素酶的基因克隆方法-----------------------------------10
3.2 纤维素酶活力的测定---------------------------------------10
3.3 实验材料试剂----------------------------------------------12
3.4 克隆基因--------------------------------------------------13
3.5 重组质粒的构建-------------------------------------------13
3.6 完整基因序列的克隆和分析--------------------------------13
4. 实验分析及讨论--------------------------------------------------14
参考文献----------------------------------------------------------15
Cloning and Expression of Cellulase Research
Cellulose is an important enzyme product, is a complex enzyme, mainly by the exo β-glucanase, endo-β-glucanase and β-glucosidase enzyme component, there is a high energy Xylanase activity. Since cellulose in feed, alcohol, textile and food industries have great market potential, has been optimistic about the industry at home and abroad, will be following the glucoamylase, amylase and protease enzymes after the fourth-largest industrial species, even in China Entirely possible to become the first major enzyme species, the cellulase enzyme preparation industry is a new growth point.
Cellulose is composed of many highly synergistic enzymes composed of catalytic reactions based on their different functions can be divided into endoglucanase (1,4-β-D-glucan glucanohydrolase or endo-1 ,4-β-D-glucanase, EC3.2.1.4, the C1 enzyme), from fungi referred to as EG, from bacteria called Cen, exo-glucanase (1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase or exo-1,4-β-D-glucannase, EC.3.2.1.91), from the fungus referred to as CBH, from bacteria called Cex) and β-glucanase (β-1, 4 - glucosidase, EC.3.2 .1.21) referred to as BG.
Cellulose molecule is a globular catalytic (Catalytic Domain, CD) or through an hydroxy amino acid proline-rich connecting bridge (Linker) and no catalytic domain of cellulose synthesis (carbohydrate-binding modules, CBM) three Parts. Only a small number of microorganisms and higher plants, cellulose produced no such domain.
China is a very tight national feed resources, land-less population, the contradiction between human and animal food fight is very prominent. China's feed industry and to maintain the sustainable development of animal husbandry, must solve the feed problem, otherwise would severely hinder its development. Cellulose is a very rich natural resources, is a glucose molecule 800-1200 polymerization. Therefore, it can make full use of agricultural products by microbial fermentation of waste, straw, bran production of cellulase additives used to improve livestock and poultry production performance, improve feed utilization, improve the nutritional value of feed, lower feed costs and improve economic efficiency, with Broad development prospects, the future should further strengthen the research and development of cellulase.
前言
纤维素酶（cellulase），是一种重要的酶产品，是一种复合酶，主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等组成，还有很高活力的木聚糖酶活力。

由于纤维素酶在饲料、酒精、纺织和食品等领域具有巨大的市场潜力，已被国内外业内人士看好，将是继糖化酶、淀粉酶和蛋白酶之后的第四大工业酶种，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。

1.1 纤维素酶的组成
纤维素酶是由许多高协同作用的水解酶组成的，根据其催化反应功能的不同可分为内切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan glucanohydrolase或endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4,即C1酶），来自真菌的简称EG,来自细菌的简称Cen、外切葡聚糖酶（1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase
或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91），来自真菌的简称CBH,来自细菌的简称Cex) 和β-葡聚糖苷酶（β-1,4- glucosidase，EC.3.2.1.21）简称BG。

(1)外切葡聚糖酶，这类酶作用于纤维素分子的末端，一次从纤维素分子中切下纤维二糖，它可以作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区和羧甲基纤维素。

对于外切纤维素酶，传统上认为是从纤维素链的非还原端切下纤维二糖。

可是，从一些微生物的外切酶的研究中发现了另一种纤维素酶，它们优先从纤维素分子的还原末端切下纤维二糖。

这些研究说明存
在两种不同功能的外切酶，它们分别从还原端和非还原端水解纤维素分子[ 1 ]。

（2）内切葡聚糖酶，这类酶是纤维素酶中最重要的酶，可作用于纤维素分子内的无定形区，随机水解糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量的小分子纤维素，即纤维素末端。

内切型纤维素酶可为外切酶提供大量的反应末端，同时它也能水解小分子的纤维素寡糖。

（3）葡聚糖苷酶，这类酶的作用是将纤维二糖水解为葡萄糖。

纤维二糖酶在水解过程中可以大大减小低聚糖对外切酶和内切酶的产物抑制。

纤维二糖是一种非专一性酶，可以水解多种糖苷键，也能水解纤维三糖、纤维六糖等。

内切葡聚酶显影照片
内切葡聚糖酶随机切割纤维素多糖链内部的无定型区,产生不同长度的寡糖和新链的末端。

外切葡聚糖酶作用于这些还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端,释放葡萄糖或纤维二糖。

β-葡萄糖苷酶水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖。

真菌纤维素酶产量高、活性大，在畜牧业和饲料工作中主要应用真菌来源的纤维素酶[ 2 ]。

纤维素和几丁质分子结构图示
1.2纤维素酶的分类与分布
纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中。

细菌、真菌、动物体内等都能产生纤维素酶。

一般用于生产的纤维素酶来自于真菌，比较典型的有木酶属(Trichoderma)、曲霉属（Aspergillus）和青霉属(Penicillium）。

纤维素酶种类繁多，来源很广。

不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大。

由于真菌
纤维素酶产量高、活性大，故在畜牧业和饲料工业中应用的纤维素酶主要是真菌纤维素酶。

1.3 纤维素酶降解纤维素的机理研究
纤维素酶反应和一般酶反应不一样，其最主要的区别在于纤维素酶是多组分酶系，且底物结构极其复杂。

由于底物的水不溶性，纤维素酶的吸附作用代替了酶与底物形成的ES复合物过程。

纤维素酶先特异性地吸附在底物纤维素上，然后在几种组分的协同作用下将纤维素分解成葡萄糖。

1950年，Reese等提出了C1 - C x 假说，该假说认为必须以不同的酶协同作用，才能将纤维素彻底的水解为葡萄糖[ 3 ]。

协同作用一般认为是内切葡聚糖酶( C1 酶)首先进攻纤维素的非结晶区，形成C x 所需的新的游离末端，然后由C X 酶从多糖链的还原端或非还原端切下纤维二糖单位，最后由β-葡聚糖苷酶将纤维二糖水解成二个葡萄糖。

不过，纤维素酶的协同作用顺序不是绝对的，随后的研究中发现，C1-Cx和β-葡聚糖苷酶必须同时存在才能水解天然纤维素。

若先用C1酶作用结晶纤维素，然后除掉C1酶，再加入Cx酶，如此顺序作用却不能将结晶纤维素水解。

研究发现，反刍动物瘤胃中的厌氧型真菌分泌到胞外的纤维素酶和木聚糖酶对降解木质纤维素有重要的作用。

这些真菌分别属于5个属：Neocallimastix，Cacomyces，Orpinomyces，Piromyces和Rurainoraycesl361。

t扣Neocallimastixfrontalis研究得最多。

M frontalis分泌的纤维素酶是多组分的复合酶称之为结晶纤维素溶解因子(crystalline cellulose solubili zingfactor，CCSF)1371，其分子量为700 KDa，由许多分子量在68．135 KDa的亚基组成[ 4 ]。

将这些亚基分开会使纤维素酶降解结晶纤维素的活力降低p81。

这种复合酶水解结晶纤维素的机制与厌氧型细菌C thermoceUum中的纤维小体相似。

Ⅳ．frontalis(RK21)是迄今为止最为有效降解结晶纤维素的微生物，因此，对这种真菌的纤维素降解机制的研究非常有意义。

1.4 纤维素酶的分子结构
纤维素酶分子是由球状的催化结构（Catalytic Domain,CD)通过一个富含脯氨酸或羟基氨基酸的连接桥（Linker)和没有催化作用纤维素合成结构域（carbohydrate-binding modules,CBM)三部分组成。

只有少数微生物和高等植物产生的纤维素酶没有这类结构域[ 5 ]。

纤维素酶分子的催化结构域（CD），主要体现酶的催化活性及对特定水溶性底物的特异性。

Juy采用X光衍射的方法对热纤梭菌的CelDde 催化域进行了结晶和解析。

结果表明，内切酶的活性位点位于一个开放的裂口中，它可结合在纤维素链的任何部位并切断纤维素链。

外切酶的活性位点位于一个长“环”所形成的“内部通道”里面，它只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。

Meinke.A利用蛋白质工程的方法将粪碱纤维单胞菌的外切酶CBHA分子的“环”删除后，发现该酶的内切酶活性提高[6]。

应用定点突变和酶专一性抑制剂的大量研究结果，证明Glu位于细菌的内切酶、外切酶、葡萄糖苷酶的活性位点。

在异头碳原子位通过构型的保留或构型的转化完成催化反应，其中两个保守的羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂，从而证明了细菌纤维素酶降解纤维素的水解双置换机制[7]。

迄今为止，所有已知的纤维素酶的催化结构域根据其氨基酸序列的相似性可分为70
个家族，在同一个家族内具有相似的分子折叠模式和保守的活性位点。

因此，Tomme.P通过比较15种来自己3个家族的纤维素酶的酶解试验认为在同一家族内，纤维素酶的反应机制和对底物的特异性都可能相同[8]。

纤维素结合结构域（CBM）在纤维素酶中位于肽链的氨基端或羧基端，通过连接桥与催化结构域相连[9]。

纤维素结合结构域提高了酶在纤维素上的亲和力，也提高了酶的溶解性。

纤维素结合结构域不具备水解纤维素的功能，但有助于纤维素酶与底物的结合。

CBM可能通过芳香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，由CBM上其余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链从纤维素表面脱离开来，以利于催化区的水解作用。

但有一些纤维素酶并没有CBM，如热纤梭菌是依靠纤维素酶系中的纤维小体(celluosome)吸附纤维素的。

真菌和细菌产生的纤维素酶分子差别很大，但它们的催化区在一级结构上氨基酸数星和三维结构上的大小却基本一致。

但它们的Linker和CBM却存在明显的差异。

真菌和细菌来源的纤维素酶的CBM的三维结构也得到了解析，真菌来源的纤维素酶的CBM由33—36
个氨基酸组成，且具有高度的同源，而细菌来源的纤维素酶的CBM由63--240个氨基酸组成，同源性较低。

一些细菌的CBM顺序有一定的共同特点：带电荷氨基酸含量很低，羟基氨基酸含量很高，都含有V rp、Asn和Gly，而且两个Cys在N、C末端的位置完全相同[10]。

粪碱纤维单胞菌的CcnA或Ccx单独的CBM不具备对纤维素的水解活力，但能破坏棉纤维，形成短纤维，具有疏解结晶纤维素的能力。

因此，细菌纤维素酶中的CBD对酶的催化活力是非必需的，但它们具有调节酶对可溶性和非可溶性底物专一性活力的作用。

真菌的外切酶的CBM的结构形状呈“楔型”，一面亲水，另一面疏水；结构中芳香族氨基酸只有3个Tyr，它们位于平坦的亲水面，执行吸附纤维素的功能；细菌外切酶的cBM
很大，且包含很多芳香族氨基酸，它们中的Trp54和Trp72暴露于蛋白分子表面，执行吸附功能。

这种楔形结构，能插入和分开纤维素的结晶区，在其吸附于纤维素分子链表面后，酶分子连接到纤维素上，可能提高了底物表面有效酶的浓度，或者可能促进了纤维素表面单个葡聚糖链的增溶溶解，具有疏解纤维素链的作用[11]。

不同的CBM以不同的拓扑学结构与结晶纤维素结合，都具有相似的刚性支柱结构，以便进行识别和结合所需的侧链能正确定位。

连接桥(Linker)是一段相当长、高度糖基化的连接肽，此区大多富含脯氨酸和羟脯氨酸，它的作用可能是保持CD和CBM之间的距离，有助于同酶分子间形成较为稳定的聚集体。

这一段肽链由于易暴露于水相，对蛋白酶非常敏感，为了防止被蛋白酶水解，这一肽链常常被O-glycosilated糖基化。

细菌纤维素酶linker富含Pro和Thr，完全FhPro．Thr这样的重复顺序组成，而真菌的纤维素酶linker富含Gly，Ser和Thr。

不同纤维素酶linker的糖基化
程度和糖链也不同，糖化不是纤维素酶活力所必需的[12]。

在高级结构的分子形状上，细菌纤维素酶CD与CBD夹角为135；真菌纤维素酶CD
与CBD夹角为180。

有限酶切时，真菌纤维素酶只具有一个酶切位点，在靠近CD与连接桥边结区，酶切时可将CBD与连接桥一并切去；而细菌的外切酶具有两个酶切位点，有限酶切时，可将CBD和连接桥分别切去。

1.5 纤维素酶在畜禽生产中的应用
常见的畜禽饲料如谷物、豆类、麦类及加工副产品等都含有大量的纤维素。

除了反刍动物借助瘤胃微生物可以利用一部分外，其它动物如猪、鸡等单胃动物则不能利用纤维素。

近年来，国内外利用真菌纤维素酶成为提高畜禽生产性能和饲料利用率的重要措施之一。

1.5.1 在牛日粮中的应用
焦平林等（1996）用阉牛试验，在日粮中按每头每日添加纤维素酶40g，饲喂60天，结果表明加酶组日增重892.78g，对照组日增重746.8g，差异极显著（P<0.01）。

焦平林又用30头荷斯坦奶牛进行试验，试验组按每头每日添加50g纤维素酶，结果表明，试验组15头奶牛在68天总产奶量为2916kg,而对照组15头奶牛在68天的总产奶量为2689kg，差异显著（P<0.05）。

付连胜等（1998）报道，在瘤胃功能正常状态下，成年奶牛及育成牛饲喂纤维素酶5天后，其粪便干物质和饲喂前相比，减少30%，一周后，封闭式牛舍氨含量下降70%左右，粗饲料采食量提高8-10%，尿中尿素下降58.9%，怀孕奶牛在产前30天始饲喂纤维素酶，分娩后，不产生生理性消化不良症状，胎儿体重可增加1.5-3kg，并无畸形和弱胎。

产牛体质恢复快，产奶高峰维持时间长（一直至第四个泌乳月）。

赵长友等（1998）综述了纤维素酶在草食动物日粮中的应用，均取得了显著效果。

1.5.2 在鸡日粮中的应用
肉鸡日粮一般以高鱼粉、高玉米、高豆粕为主。

为减少这些常规原料的使用量，广泛采用廉价的饲料原料，秦江帆等（1996）在肉鸡日粮中提高富含纤维的麦麸比例，添加0、0.05%、0.1%纤维素酶制剂进行试验，结果表明，添加0.1%纤维素酶组比对照组在1-2、3-6、7-8周三个生长阶段日增重分别提高4.31%、4.54%、4.13%，耗料比分别下降1.56%、4.50%、4.3%。

徐奇友（1998）在蛋鸡日粮中添加0.1%、0.15%、0.5%纤维素酶，结果表明，在1-10月的产蛋期间，产蛋率分别提高0.53%、1.25%、2.88%，酶水平0.15%和0.5%组的破蛋率降低34.49%、16.19%，蛋壳强度分别提高14.71%和8.41%。

1.5.3 在猪日粮中的应用
据尹清强等（1992）报道，在基础日粮中添加0.6%和1.2%纤维素复合酶，结果生长
育肥猪增重比对照组分别提高16.84%和21.86%。

Wank等（1993）报道，添加纤维素酶，使中性洗涤纤维消化率由30.3%提高到34.1%，酸性洗涤纤维消化率从68.8%提高到73.9%，能量消化率由69.3%提高到71.8% 。

2 纤维素酶的研究现状及展望
我国是一个饲料资源十分紧张的国家，土地少、人口多，人畜争粮的矛盾十分突出。

要保持我国饲料工业和畜牧业的持续发展，必须解决好饲料问题，否则将严重制约其发展。

纤维素是自然界中十分丰富的资源，是800-1200个葡萄糖分子聚合而成。

因此，可通过微生物发酵充分利用农副产品下脚料、秸秆、糠生产纤维素酶添加剂，用于提高畜禽生产性能，提高饲料利用率，改善饲料的营养价值，降低饲料成本和提高经济效益，具有广阔的开发前景，今后应进一步加强纤维素酶研究和开发工作。

主要有如下几方面：
1、进一步加强纤维素酶的作用机制研究。

纤维素酶应用于饲料，作用于动物消化道，其机制尚未清楚。

从理论上决定其添加量还很困难，目前只能从实验结果来决定，受影响因素很多，往往效果不够理想。

对于单用多种原料的纤维素酶最佳添加量也研究不多，这将严重制约纤维素酶的推广应用。

2、酶的产量和活性都不高，成本偏高。

今后应加强菌种选育和发酵工艺等基础研究工作，以提高其产量和活性，特别是要注意利用DNA基因重组技术的应用，来选育出活性高、产酶量大的菌种。

3、加强纤维素酶检测方法研究。

虽然纤维素酶的检测方法很多，但真正能适合饲料的检测方法还没有，这给实际应用工作带来困难，如无法比较不同厂家的产品质量，确定纤维素酶添加量也很困难，应组织有关力量，制订出统一的检测方法标准，供生产中应用[13]。

3. 纤维素酶的基因克隆与表达
目前，大量纤维素酶的基因得到克隆和表达，极大地丰富了纤维素酶的研究材料。

来源于芽孢卡T菌的纤维素内切酶基因的研究也越来越多。

然而，筛选发掘适用于工业生产应用的纤维素酶及其基因仍然有很长的路要走。

我们已从新分离鉴定的芽孢杆菌Bacillus sp．AC．1中纯化得到一株新的纤维素内切酶Ba．EGA。

它具有一些特殊的性质，如高的最适反应温度，较广的酸性最适反应pH以及耐受非离子型去垢剂的能力，预示着它在工业生产中的应用价值。

在下面的工作中，我们克隆到编码召臼一EGA的基因Ba—ega，并且在大肠杆菌中表达了全酶及其两个结构域，为迸一步的工作提供了基础。

3.1 纤维素酶的基因克隆方法
由于利用纤维素酶的降解作用进行纤维素的生物转化有着广阔的前景，自70年代末就开始了纤维素酶基因的克隆。

现已从40多种细菌和数种真菌中克隆到了踟余个纤维素酶基因并被测序，并且几乎所有已克隆的纤维素酶基因都已在大肠杆菌中表达[59,601。

已克隆了里氏木霉的CBH I、CBHII、EGI、EG Ill、BG五个基因，并测定了这些基因的核苷酸序列1611。

国内也应用各种方法克隆和表达了部分纤维素酶基因，如汪天虹等人用鸟枪法从野油菜黄单胞菌S152中克隆到的内切纤维素酶基因，在大肠杆菌中得以表达；从微紫青霉中克隆到的CBHI基因在体外无细胞系统中表达；从瑞氏木霉cDNA文库中克隆到的内切葡纤维素酶IU基因在酿酒酵母中表达；肖志壮等从罩氏木霉cDNA文库中分离得到了内切葡聚糖酶(EGⅡ1)序列，将其重组到酿酒酵母中。

除了酵母外，许多细菌、真菌也可以作为纤维素酶克隆的宿主菌。

如罩氏木霉的纤维素酶产量高，可化系统的构建日趋成熟。

同时，通过对有关启动子的研究，可根据需要进行调控。

如删除调控葡萄糖阻遏作用的纤维素酶启动子的有关核苷酸片段，可保证在葡萄糖积累的情况下纤维素酶启动子的活性。

另外，由于木霉属中里氏木霉和黑曲霉产纤维素酶的能力强，故近些年已有了对这两个远属问的基因能否相容性遗传和表达的研究。

另外，对于瘤胃微生态区系中的纤维素分解菌群的遗传改造也将是纤维素酶分子生物学研究的一个重要领域。

同时，人们通过定向进化和分子改造的方法筛选到重组型商比活力的纤维素酶。

利用基因工程技术将纤维素酶的基因克隆到细菌、酵母、真菌和植物中以期得到新的高比活力的。

重组型纤维索酶[631。

Wood[641等在大肠杆菌 E coli Koll中表达了欧氏菌(Erwinia Chrysanthemi e86021)的葡聚糖内切酶基因，最终得到的纤维素酶在每升培养基中可产生高达3200 u。

从嗜酸耐热菌(Acidotherraus cellulolyticus)得到的一种热稳定性的葡聚糖内切酶EGl被表达ZEArabidopis thaliana的叶子中，马铃薯以及烟草中。

另外，将构建的编码木糖同化作用和戊糖磷酸化途径的操纵子转入细菌发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)dP，可以有效地将木糖发酵转化成乙醇[14]。

除此之外，定点突变以及基因重排(gene shufling)技术也被应用到高比活力纤维素酶的筛选当中。

例如：在里氏木霉中，需要产生至少14种酶协同作用才能水解未经化学处理过的植物干物质。

为了降低纤维素酶的复杂性，将里氏木霉的CBHl、嗜酸耐热菌的葡聚糖内切酶EGI以及曲霉(Aspergillus niger)的6-葡萄糖苷酶以90：9：1(质量比)混合形成一个三元复合物，此三元复合物在120d,时内水解预处理过的纤维素的能力与里氏木霉中纤维素酶
体的水解能力相当。

为了提高此三元复合物水解纤维素的活力，利用定点突变的方法对葡聚糖内切酶EGI的活性位点进行修饰，结果与突变前的三元复合物相
比，其水解纤维素的活性提高了12％。

3.2 纤维素酶活力的测定
不同微生物产生的纤维素酶以自然纤维素质的底物，形成不同的纤维素酶酶活的测定方法。

由于采用的底物种类不同，不同纤维素酶各个组分酶活测定方法的变化以及纤维素酶各个组分之间的协同作用，使得比较不同实验方法结果相对困难。

因此，IUPAC在1987年发布了标准的纤维素酶活力的测定方法1661。

其中一些推荐的方法很快被采用，但是，很多酶研究学者认为一些方法对条件非常限定，而且，对在细节上纤维素酶作用的机制和底物的特异性的了解并不令人满意。

因此，Wood和Bhat对不同的真菌纤维素酶活力的测定方法进行总结，并着重论述了各种方法的优缺点。

虽然，这些方法描述的是Trichoderma纤维素酶，但这些方法也适用于其它的纤维素酶。

这些酶活的测定方法和所用底物见表1．2
3.3 实验材料试剂
Bacillus sp．Strain AC-1为本实验室分离鉴定保存，感受态细胞DHl2S，B121(DE3)来自本实验室；pET一28aV ector(本实验室保存)，pMDl8一TV ector(Takara)；pyrobestDNA polymerase、BamH I、Nde I(Takara)细菌基因组抽提试剂盒(BioDev),胶回收试剂盒、Taq DNA polymerase：上海天根生物工程有限公司；质粒抽提试剂盒：博大泰克；PMSF、
CMC-Na(medium viscosity)购自Sigma公司；IPTG：Sanland—them，USA：电泳试剂：丙稀酰胺、甲叉双丙稀酰胺、十二烷基磺酸钠(SDS)购自PharmaciaAB (Sweden)公司；蛋白分子量标准购自上海西巴斯公司。

其余试剂为国产试剂分析纯。

3.4 克隆基因
用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒抽提Bacillus sp．Strain AC．1基因组作为PCR的模板；用引物pEGA-N1，pEGA．C1以及pEGA-N2，pEGA-C2(表2．1)分别克隆得到编(iSBa —EGA的核心序列和全基因序列。

PCR反应程序见表2．2
PCR片段用胶回收试剂盒纯化之后与pMDl8．T载体在160C连接4h，然后转化大肠杆菌DHl2S。

挑取单克隆，使用质粒抽提试剂盒小抽质粒。

菌体质粒经PCR以及酶切鉴定为重组质粒之后，测序。

含有质粒的大肠卡T菌用Amp(100 lag／m1)抗性筛选。

3.5 重组质粒的构建
用测序J下确的包含Ba—EGA完整开放阅读框的质粒作为模板，使用不同的引物组合扩增目的片段：pEGA-Nde I和pEGA-BamH I扩增编码rBa—EGA的基因片段，pEGA—NdI 和pCD-BamH I克隆rCD9的编码基因，pCBM-Nde I和pEGA-BamH l PCR得到编码rCBM3的基因片段。

pET一28a载体以及经胶回收试剂盒纯化之后的PCR片段，用BamH I和Nde I酶切消化；回收后的消化产物在160C连接16h，然后转化大肠杆菌DHl2S。

转化后菌体质粒经PCR以及酶切鉴定之后，测序。

测序正确的克隆的质粒转化B121(DE3)。

此过程中使用30I_tg／ml Kan进行抗性筛选。

3.6 完整基因序列的克隆和分析
考虑到完整基因序列和上述三个基因也可能会存在较高的同源蚀，以同源性最高的上下游基因序列较完整的来源于短小芽孢杆菌纤维素酶基霆(AF206716)作为参照，利用它的上下游非编码区域的基因序列引物Ba．EGA，克隆得到的完整基因序列。

测序后查找分析发现完整基因序列具有一个1980 bp的开放阅读框，我们将克隆到的基因命名为Ba．ega。

对比该基因与其他序列的同源性发现，它与来自来源于短小芽孢杆菌的纤维素酶基因
(AF20671、来自lBacillus sp．KSM一522的EG-IV和B pumilus的E91A的编码基因有价高的同源性，分别为98％、97％和85％。

在大肠杆菌中表达了His6标签融合的rBa—EGA、rCD9以及rCBM3，并用Ni柱亲和层析的方法纯化了重组蛋白。

用SDS—PAGE检测的重组蛋白的纯度如图2．6所示。

和分子量标准相比较，推测Ba—EGA、rCD9和rCBM3(SeqAidllv．3．81)分别为72．02、54．37和21．29 kDa。

这与氨基酸序列分析(Protparam)的蛋白分子量结果很接近：72．0、57．15和23．23 kDa。

使用CMC-Na作为底物，在50。

C条件下进行反应，rBa-EGA的比活力为57．84 U／mg，这一数据比相同条件下测得的}ABac illus sp．AC-l纯化出来的野生型酶的比活力39．4U ／mg还要高出一些。

4．实验分析及讨论
芽孢杆菌可以产生多种工业上有重要应用价值的多糖水解酶，如淀粉酶、纤维素酶、果胶酶和其它f481。

Bacillus sp．AC．1在以CMC．Na为唯一碳源的诱导条件下可以分泌得到Ba，EGA，然而野生型酶的获得不仅培养基成本高、诱导条件麻烦、生长周期长、纯化手段复杂而且产量低。

克隆得到表达Ba—EGA的基因并在大肠杆菌中进行表达可以解决上述问题，而且为工业化生产提供了方便的平台。

本实验表达得到的rBa．EGA的比活力与野生型酶相比略高一些，而且保留了野生型酶耐高温且碱稳定的优良特征，可以作为Ba—EGA 的替代品。

许多微生物纤维素酶都有一个与不溶性纤维素基质结合的不同于纤维素酶催化结构域的纤维素结合结够域(cellulose-binding domain，CBD)。

前面的工作己证明Ba，EGA含有一个獒型的纤维素结合结构域，这与我们推测豹Ba．EGA的氨基酸序列结采分析相符。

Ba—EGA是一个双结构域组件的纤维素酶，其有一个N端的CD9秘一个C端的CBM3，查找资料的过程中发现，其有相同结构构成(GH一9／CBM-3)的已有研究的纤维素酶具有一些相似的性质：在较广的PH范围内作用、较好的温度稳定性，还包括较高的最适反应温度：从65。

C到80C不等。

而这些性质在大多数芽孢杆菌和其它物种中得到的纤维素内切酶中是并不常见。

目前还没有更多的材料和研究可以说明，这究竟是普遍的规律还是个别的现象，亦即GH．9／CBM-3和高温反应性是不是有必然的联系，导致这一现象的深层机理是什么，还没有更广泛的研究。

弄清楚这个现象的机理梳理对指导分子改造将有萋十分重要的意义。