核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化

核盘菌交配型基因mat1-1敲除载体的构建及转化
安乐;赵文生;张世宏;刘金亮;彭友良;潘洪玉
【摘要】利用根癌农杆菌介导真菌遗传转化方法对核盘菌的交配型基因mat1-1进行基因同源重组的敲除对比实验, 获得了缺失mat1-1基因的转化菌株. 先利用PCR方法获得mat1-1基因的左右两侧片段, 将测序正确的两个侧翼片段分别重组到农杆菌转化载体PBI-G3C中, 并将新霉素抗性标记引入农杆菌转化载体PBI-
G3C中, 构建成农杆菌介导转化核盘菌的打靶载体ΔPBI-G3CN-mat1-1, 再将
ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转化至根癌农杆菌EHA105中. 利用核盘菌菌丝进行转化, 将得到的转化菌株, 利用PCR方法进行验证, 证实有敲除菌株存在. 通过对敲除菌株进行生理表型的测定发现, 缺失mat1-1基因的敲除菌株其生长速度与野生核盘菌菌株相比无明显差异, 但敲除菌株不能产生菌核与子囊盘.
【期刊名称】《吉林大学学报（理学版）》
【年(卷),期】2010(048)001
【总页数】6页(P140-145)
【关键词】核盘菌;mat1-1基因;敲除载体;遗传转化
【作者】安乐;赵文生;张世宏;刘金亮;彭友良;潘洪玉
【作者单位】吉林大学,植物科学学院,长春,130062;中国农业大学,农业部分子植物病理实验室,北京,100193;吉林大学,植物科学学院,长春,130062;吉林大学,植物科学学院,长春,130062;中国农业大学,农业部分子植物病理实验室,北京,100193;吉林大学,植物科学学院,长春,130062
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.95;S432.4
核盘菌(Sclerotinia sclerotirum(Lib)de Bary)是一种重要的植物病原真菌, 寄主范围广泛, 可侵染75科450多种植物或亚种[1], 包括一些重要的经济作物, 如大豆和油菜等. 根据核盘菌有性生殖机理及病害发生规律, 在有性生殖过程中所产生的子囊孢子是田间病害流行中的唯一病菌来源, 而子囊孢子完全由子囊盘诱导产生[2]. 核盘菌有性生殖主要由交配型基因控制[3], 其交配型基因mat1-1可能与核盘菌菌核以及子囊盘的产生有直接作用. 关于核盘菌交配型基因及其功能、有性生殖过程中的信号传导, 特别是核盘菌有性生殖过程中子实体形成与系统发育机理等研究目前尚未见文献报道[4-5].
根癌农杆菌介导的丝状真菌遗传转化目前得到了广泛应用[6-9], 通过同源重组根癌农杆菌能有效地将含目的基因的T-DNA整合到真菌基因组上的特定区域, 实现位点特异性转化, 敲除目的基因或同源序列. 本文建立了根癌农杆菌介导核盘菌的遗传转化体系, 确立了利用农杆菌介导核盘菌的转化研究进行基因敲除的方法；并对核盘菌的交配型基因mat1-1进行了基因同源重组的敲除对比实验, 获得了缺失mat1-1基因的转化菌株.
1 材料与方法
1.1 材料
大肠杆菌JM109、农杆菌EHA105、核盘菌野生菌株均由本实验室保存. pBlueScriptKN与农杆菌转化载体PBI-G3C由中国农业大学分子植物病理实验室提供. 克隆载体pMD18-T、限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、 Ex Taq DNA 聚合酶均购于日本TaKaRa公司. 小片段DNA片段凝胶回收试剂盒(Agarose Gel
DNA Extraction Kit)为北京Daopu公司产品. 由上海生工生物公司完成PCR引物合成. 由北京三博公司测序.
1.2 方法
1.2.1 核盘菌基因组的提取质粒的小量制备、酶切、连接、转化等方法参照文献[10].
1.2.2 mat1-1基因的PCR扩增及测序以提取的核盘菌基因组为模板, 分别以Left-F/Left-R和Right-F/Right-R为引物进行PCR扩增, 得到左右臂序列:
(下画线为KpnⅠ酶切位点);
(下画线为XhoⅠ酶切位点);
(下画线为ClaⅠ酶切位点);
(下画线为ClaⅠ酶切位点).
左臂PCR反应条件为：94 ℃ 4 min预变性, 94 ℃ 30 s, 62 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 共5个循环, 94 ℃ 30 s, 68 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 共30个循环, 最后72 ℃延伸10 min. 右臂PCR反应条件为：94 ℃ 4 min预变性, 94 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 共5个循环, 94 ℃ 30 s, 65 ℃ 30 s, 72 ℃ 40 s, 共30个循环, 最后72 ℃延伸10 min. PCR产物回收后与pMD18-T载体连接, 16 ℃连接过夜, 然后热击转化大肠杆菌JM109感受态细胞, 在氨苄青霉素抗性(Amp+)LB平板上筛选阳性重组子. 经酶切鉴定后送北京三博公司测序.
1.2.3 敲除载体ΔPBI-G3CN-mat1-1的构建敲除载体ΔPBI-G3CN-mat1-1的构建如图1所示. 将农杆菌转化载体PBI-G3C经XbaⅠ单酶切后回收, 与从载体pBlueScriptKSN中用XbaⅠ切割回收Neo(新霉素)片段进行连接, 获得ΔPBI-
G3CN质粒, 将该质粒与带有mat1-1基因右臂的pMD18-T-l-R分别用ClaⅠ进行单酶切, 连接转化大肠杆菌, 以卡那霉素(Kan+)为选择标记, 经PCR和ClaⅠ酶切鉴定带有阳性克隆质粒(ΔPBI-G3CN-mat1-R), 选取3个送北京三博公司测序鉴定
连接方向. 将构建正确的载体ΔPBI-G3CN-mat1-R质粒与重组mat1-1基因左臂克隆质粒pMD18-T-l-L分别应用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后连接, 构建敲除载体ΔPBI-G3CN-mat1-1, 用相同方法进行鉴定并测序.
图1 敲除载体ΔPBI-G3CN-mat1-1的构建流程Fig.1 Construction protocol of knocking out ΔPBI-G3CN-mat1-1 vector
1.2.4 根癌农杆菌介导核盘菌遗传转化体系的建立将ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转入根癌农杆菌EHA105中, 与核盘菌菌丝碎片按体积比1 ∶4混合, 取400 μL混合液均匀涂于共培养平板(YEB培养基)上, 23 ℃避光共培养3 d. 将滤纸条揭下, 反铺到含潮霉素(hygB, 200 mg/L)和头孢霉素(Cef, 200 mg/L)的选择培养基(PDA培养基)上, 28 ℃培养2 d. 揭下滤纸条, 在28 ℃进行培养1～3 d, 每天检查是否有新的抗hygB的单菌落出现. 在日光灯下挑取选择培养基上能抗hygB的单菌落至二筛板(含hygB的PDA培养基)上进一步筛选验证, 每板作阴阳性对照以检测hygB 是否失效. 如稳定传代, 则继续验证Neo抗性, 将二筛培养基上的转化子挑到含Neo(200 mg/L)的选择培养基(PDA培养基)上, 28 ℃, 培养2 d. 选择抗hygB不抗Neo的转化子进行PCR验证.
1.2.5 敲除转化子的PCR验证经初步抗性验证, 得到了疑似的敲除转化子, 为进一步验证转化子的真实性, 采取PCR扩增方法验证mat1-1是否已通过根癌农杆菌介导核盘菌遗传转化的同源重组方式敲除掉. 验证的主要依据是按照同源重组的原理将hygB的序列与mat1-1基因所在位置替换, 并根据理论上的重组将基因组序列重新拼接, 引物设计分为两种：第一组(mat1600-F/mat1600-R)：引物从敲除转化子基因组中应扩增出从左臂前300 bp到hygB序列的前300 bp的总长度约为1 600 bp的片段, 而野生型菌株中则无法扩增出目的条带; 第二组(mat835-
F/mat835-R)：引物从野生核盘菌基因组中扩增mat1-1基因序列的一部分, 长度约为835 bp片段, 而敲除转化子中则无法扩增出目的条带.
mat1600-F: 5′>TGCGACGTGAAGCTTTCTTG>3′;
mat1600-R: 5′>AGGGAGGAAGGGCGAACTT>3′;
mat835-F: 5′>AGACAAATCGGGTGGGTTG>3′;
mat835-R: 5′>GGGAACAGGACAATGCCTC>3′.
1.2.6 所得转化子的生物学特征为了验证mat1-1基因的功能, 将已确定的该基因
敲除的菌株及野生型核盘菌进行人工培养, 观察其表性特征及菌丝生长速度.
2 结果与分析
M. DL2000 Marker; 1～3. PCR产物.图2 mat1-1基因右臂序列的PCR结果Fig.2 PCR identification of the right arm of mat1-1 gene
M. DL2000 Marker; 1. PCR产物.图3 mat1-1基因左臂序列的PCR结果Fig.3 PCR identification of the left arm of mat1-1 gene
2.1 mat1-1基因左右侧翼序列的PCR扩增
以提取的核盘菌基因组为模板, 用PCR扩增得到左右臂目的片段, 如图2和图3所示, 长度分别为828 bp和939 bp, 与理论值一致.
将目的基因与pMD18-T载体连接后, 转化大肠杆菌. 提取质粒, 双酶切鉴定重组质粒. 将酶切鉴定正确的重组质粒送北京三博公司进行序列测定, 测序结果在NCBI网站上进行BLAST分析, 左右臂片段的序列与GenBank核盘菌交配型基因(登录号：DQ159959; DQ159960)相应序列同源性均大于97%, 证明所得片段为核盘菌交配型基因的目的片段.
2.2 敲除载体ΔPBI-G3CN-mat1-1的鉴定
M. λHindⅢ Ma rker; 酶切产物：1. ClaⅠ;2. XhoⅠ和HindⅢ; 3. XhoⅠ和KpnⅠ;
4. XbaⅠ.图4 ΔPBI-G3CN-mat1-1酶切鉴定结果Fig.4 Digestion of the recombinant plasmid ΔPBI-G3CN-mat1-1
将构建的敲除载体ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转化至大肠杆菌中, 以Kan+为选择
标记, 挑取阳性克隆, 应用限制性内切酶对提取的ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒进行酶切鉴定, 如图4所示. (1) 应用ClaⅠ单酶切：目的带为两条, 828 bp片段长度与右臂相符, 1 400 bp条带为左臂902 bp处的ClaⅠ位点与右臂的ClaⅠ位点切割所得； (2) 应用XhoⅠ和HindⅢ双酶切：得到一条目的带, 为左臂XhoⅠ位点和右臂19 bp处HindⅢ位点切割所得； (3) 应用XhoⅠ和KpnⅠ双酶切：得到一条目的带, 为左臂XhoⅠ和KpnⅠ切割所得； (4) 应用XbaⅠ单酶切：得到两条目
的带, 2 000 bp条带为Neo片段, 3 100 bp由左臂17 bp处XbaⅠ位点与Neo XbaⅠ位点切割所得. 经酶切鉴定以成功构建敲除载体ΔPBI-G3CN-mat1-1.
2.3 敲除载体ΔPBI-G3CN-mat1-1转化农杆菌EHA105
M. λHindⅢ Marker; L,R. PCR产物.图5 ΔPBI-G3CN-mat1-1 PCR结构鉴定结果Fig.5 PCR identification of ΔPBI-G3CN-mat1-1
将构建成功的敲除载体ΔPBI-G3CN-mat1-1转入根癌农杆菌EHA105感受态细胞中, 以利福平(Rif+)和Kan+为抗性标记, 筛选阳性克隆, 进行PCR鉴定, 结果如
图5所示.
2.4 建立根癌农杆菌介导核盘菌遗传转化体系
通过对根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化方法[11-12]的改进, 成功地对核盘菌进行了遗传转化, 初步建立了根癌农杆菌介导核盘菌遗传转化体系, 为利用该遗传转化
体系开展核盘菌基因组的功能研究创造了可行性条件, 为交配型基因mat1-1的研究提供了新方法. 在进行数次条件优化后, 成功地获得了转化子, 其转化效率仅为0.86%, 远低于已报道的其他丝状真菌根癌农杆菌介导的转化效率.
2.5 敲除转化子的PCR鉴定
(A) mat1600-F/mat1600-R: M. λHindⅢ Marker; 1. 野生型; 2. 敲除转化子； (B) mat835-F/mat835-R: M. DL 2000 Marker; 1. 敲除转化子; 2. 野生型.图6 敲除
转化子的PCR鉴定结果Fig.6 PCR indentification of the knockout
transformant
将ΔPBI-G3CN-mat1-1质粒转入根癌农杆菌EHA105中获得的转化子, 经hygB 和Neo筛选后, 将抗hygB不抗Neo的转化子进行PCR验证, 结果如图6所示. 利用引物mat1600-F/mat1600-R从敲除转化子基因组中扩增出总长度约为1 600 bp的片段, 而野生型菌株中没有扩增出目的条带；利用引物mat835-
F/mat835-R从野生核盘菌基因组中扩增mat1-1基因的约835 bp片段, 而敲除转化子中没有扩增出目的条带.
2.6 敲除转化子的生物学特征
通过对mat1-1基因的敲除菌株及野生型核盘菌进行人工培养发现, 本文所得转化子的突变表型如图7所示. 由图7可见: 转化子a：颜色与菌丝性状发生变化且不产生菌核；转化子b：敲除菌株, 气生菌丝生长发达, 不产生菌核；转化子c：菌丝不发达, 产生菌核. 对其菌丝的生长情况进行观察发现, 培养1 d时, 缺失mat1-1基因的敲除菌株b生长速度大于野生核盘菌菌株(约2倍), 但到第4天时, 菌丝的生长速度没有明显差异, 见图8.
SS-野生型核盘菌. a. 转化子; b. 敲除转化子; c. 转化子.图7 转化子培养性状Fig.7 Cultural characteristics of transformant
图8 核盘菌转化菌株的生长速度测定Fig.8 Detection of growth velocity of transformant of Sclerotini sclerotiorum
3 讨论
本研究提取了野生型核盘菌的全基因组DNA, 克隆了两段目的序列并构建了核盘菌交配型基因mat1-1的打靶载体. 通过优化实验条件及改进方法成功地建立了根癌农杆菌介导核盘菌的遗传转化体系, 敲除了野生核盘菌的mat1-1基因, 获得了缺失该基因的转化菌株. 该菌株生长速度与野生型菌株相比无明显差异, 但无法产生子囊盘.
许多真菌的大规模测序工作为人们提供了大量的基因组、 EST序列信息, 而大部分基因仍然是功能未知基因, 通过GenBank数据库进行比对分析也只能预测出其假设的功能, 而利用基因敲除方法却可为研究基因功能提供最直接有利的证据. 目前, 已有一些真菌运用农杆菌介导转化方法成功实现了T-DNA的同源重组[12-14]. Zeilinger[15]利用传统的PEG介导方法对深绿木霉(Trichoderma atroviride)进行转化, 同源重组的频率很低, 而利用农杆菌介导转化法获得了60%的同源重组转化子, 成功实现了对tmkl和tga3基因非编码区的基因破坏. 本研究利用核盘菌的菌丝与农杆菌共培养, 而已往的报道多数是利用核盘菌的子囊孢子与农杆菌共培养获得转化子, 因此影响其转化效率. 转化效率低可能还与其他因素有关, 包括乙酰丁香酮(acetos-yingone, AS)[16]、共培养时间、质粒的结构等[17].
在利用hygB为筛选标记建立核盘菌转化体系时, T-DNA区非定向的随机插入核盘菌基因组中, 其插入位点的随意性给构建突变体库提供了有利条件. 而本文所研究的目的是使T-DNA区按照研究的需要以特定的位置进入核盘菌基因组中, 并根据同源重组原理按预期目的以抗性标记置换靶基因, 从而获得缺失靶基因的转化菌株. 在遗传转化过程中, 并不是所有的T-DNA区片断都能按照同源重组的方式插入核盘菌基因组中, 相当数量的T-DNA区片断可能随机插入基因组中, 并没有在定向的位置插入. 从中引出的问题就是当仅以hyB作为抗性筛选标记时, 通过对转化菌株的抗性筛选无法初步判断所获得的转化子是定向替换插入基因组中还是随机插入基因组中, 只有通过提取所有转化子的基因组DNA进行PCR验证, 才能判断其中是否含有所需的敲除菌株. 为了提高实验效率, 本研究对双元载体PBI-G3C做了优化改造. 在其T-DNA区RB侧与氯霉素之间的XbaⅠ位点处添加另一抗性筛选标记Neo序列, 长度为2 046 bp, 命名为PBI-G3CN. 通过双抗性的加入, 在抗性筛选阶段即可初步排除部分非定向插入的转化子, 减少后续提取转化子基因组DNA的繁琐工作量, 加快了实验进度.
参考文献
【相关文献】
[1] Boland G J, Hall R. Index of Plant Hosts of Sclerotinia sclerotiorum [J]. Canadian Journal of Plant Pathology, 1994, 16(2): 93-108.
[2] Abawi G S, Grogan R G. Epidemiology of Diseases Caused by Sclerotinia species [J]. Phytopathology, 1979, 69(8): 899-904.
[3] Coppin E, Debuchy R, Arnaise S, et al. Mating Types and Sexual Development in Filamentous Ascomycetes [J]. Microbiol Mol Biol Rev, 1997, 61(4): 411-428.
[4] Mayrhofer S, Poggeler S. Functional Characterization of an α-Factor-Like Sordaria macrospora Peptide Pheromone and Analysis of Its Interaction with Its Cognate Receptor in Saccharomyces cerevisiae [J]. Eukaryot Cell, 2005, 4(4): 661-672.
[5] LIU Yan, YANG Qian. Cloning and Heterologous Expression of SS10, a Subtilisin-Like Protease Displaying Antifungal Activity from Trichoderma harzianum [J]. FEMS Microbiol Lett, 2009, 290(1): 54-61.
[6] CHI Yan, ZHOU Dong-po, PING Wen-xiang, et al. Genetic Transformation in Fungi Mediated by Agrobacterium tumefaciens and Its Application [J]. Mycosystema, 2005, 24(4): 612-619. (迟彦, 周东坡, 平文祥, 等. 根癌农杆菌介导的真菌遗传转化及其应用 [J]. 菌物学报, 2005, 24(4): 612-619.)
[7] FANG Wei-guo, ZHANG Yong-jun, YANG Xing-yong, et al. Transformation in Fungi Mediated by Agrobacterium tumefaciens [J]. Journal of Chinese Biotechnology, 2002,
22(5): 40-44. (方卫国, 张永军, 杨星勇, 等. 根癌农杆菌介导真菌遗传转化的研究进展 [J]. 中国生物工程杂志, 2002, 22(5): 40-44.)
[8] Mishra N C. Characterization of the New Osmotic Mutant(OS) Which Orginated during Genetic Transformation in Neurospora crassa [J]. Genet Res Camb, 1977, 29: 9-19.
[9] Mishra N C. DNA-Mediated Genetic Changes in Neurospora crassa [J]. J Gen Microbiol, 1979, 113(2): 255-259.
[10] 奥斯伯 F, 布伦特 R, 金斯顿 R E, 等. 精编分子生物学实验指南 [M]. 5版. 金由章，包慧中，
赵丽云，译. 北京：科学出版社, 1998.
[11] Michielse C B, Salim K, Ragas P, et al. Development of a System for Integrative and Stable Transformation of the Zygomycete rhizopus oryzae by Agrobacterium-Mediated DNA Transfer [J]. Mol Genet Genomics, 2004, 271(4): 499-510.
[12] Zwiers L H, De Waard M A. Efficient Agrobacterium tumefaciens-Mediated Gene
Disruption in the Phytopathogen Mycosphae-rella graminicola [J]. Current Genetic, 2001, 39(5/6): 388-393.
[13] Gouka R J, Gerk C, Hooykaas P J, et al. Transformation of Aspergillus awamori by Agrobacterium tumefaciens-Mediated Homologous Recombination [J]. Nat Biotech, 1999, 17(6): 598-601.
[14] Zhang A, Lu P, Dahl-Roshak A M, et al. Efficient Disruption of a Polyketide Synthase Gene (pks1) Required for Melanin Synthesis Through Agrobacterium-Mediated Transformation of Glarea lozoyensis [J]. Mol Genet Genomics, 2003, 268(5): 645-655. [15] Zeilinger S. Gene Disruption in Trichoderma atroviride via Agrobacterium-Mediated Transformation [J]. Curr Genet, 2004, 45(1): 54-60.
[16] Takahara H, Tsuji G, Kubo Y, et al. Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation as a Tool for Random Mutagenesis of Colletotrichum trifolii [J]. J Gen Plant Pathol, 2004, 70(2): 93-96.
[17] Campoy S, Pérez F, Martín J F, et al. Stable Transformants of the Azaphilone Pigment-Producing Monascus purpureus Obtained by Protoplast Transformation and Agrobacterium-Mediated DNA Transfer [J]. Curr Genet, 2003, 43(6): 447-452.。