引物设计原则及PP5.0设计软件

引发效率（引物唯一性）
选用的引物序列就应当是唯一的，即在模板中没有重
复序列
好的设计工具会提供一个引物异位引发的评价指标， 如Oligo 6.0 的false priming efficiency ，即异位引发 效率，这个值是由程序根据引物自身二级结构的能量、错 配的类型、错配离3'末端的距离等因素综合计算而得出，
• 选择两个引物3’端与同一非目的基因不同源
的序列作为引物
Primer premier 5.0使用介绍
•默认引物长度 - 默认值为25
•引物对搜索最大值 - 默认值为100 •核酸浓度 -默认值为250 pM
参数设置
•单价离子浓度 - 默认值为50 mM
•游离Mg2+离子浓度 - 默认值为1.5 mM
引物二级结构
引物二聚体（引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性 ）
• 尽可能避免两个引物分子之间3’端有较多碱基互补
发夹结构（引物自身连续互补碱基不能大于3bp ）
• 尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重
影响DNA聚合酶的延伸。
（两项结构的能值以不超过4.5为好，引物中间或5’端可适当放 宽）
引物设计界面 First you can design the primer
manually
Sense strand or anti-sense strand
Useful information of the primer
引物类型 搜索模式
引物搜索选项设定
引物长度
5’引物位置 范围
3’引物位置 范围
3、同源序列比较
NCBI的BLAST; ExPASy的Alignment GeneDoc 3.2 Clustal X Vector NTI Omiga，Bioxm ，LaserGene，pcgene等
引物同源性分析
用Blast软件进行同源性比较 • 尽可能选择与非目的基因同源性小的序列作 为引物 • 选择3’端与非目的基因不同源的序列作为引 物
（18bp的序列在人类基因组中只会出现一次）。
决定引物退火温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度
Tm =（g + C）* 4 +（a + T）* 2
碱基分布的均衡性
同一碱基连续出现不应超过5个
GC含量一般40-60%，以45-55％为宜
• GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不
3’端的连续3个G 或C ，如GGG或CCC，会导致引物在G+C富集序列区错误 引发
引物5’端
引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基（对PCR 影响不 大），常在5’端引入修饰位点或标记物。
• 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上 适当数量的保护碱基）。
• 5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点 的点突变以作研究。
产物大小范 围
引物手动搜索选项设定
28对引物
搜索结果
每对引物的信 息
引物分值 100分为满分
双击选中一对 引物
回到主窗口
引物信息
引物及产物信息
是否出现 hairpin,dimer,false priming and cross dimer
引物编辑
引物设计原则及设计 软件
引物（primers)
引物是人工合成的两段
寡核苷酸序列，一个引 物与感兴趣区域一端的 一条DNA模板链互补， 另一个引物与感兴趣区 域另一端的另一条DNA 模板链互补。
5’ 3’ Sense primer 5’
→
Antisense primer
←
3’
PCR引物设计及相关软件使用
若模板不很清楚，引物3’端最后一个碱基最好为T，其次是G或C，而 不选A，国外资料表明，当末位为T时，即使在错配的情况下也能引发链 的合成，而末位为A时，错配时引发大大降低，G或C居中，可见，模板很 清楚时选A可以提高特异性。
自由能分布
∆G 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的 相对稳定性（结合的强弱程度）。 一般情况下，引物的Δ G值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间Δ G值较高， 而3’端Δ G值相对较低，且不要超过9 （绝对值，一般考虑末端5个碱基的 ΔG。此值的大小对扩增有较大的影响，负值大，则3’末端稳定性高，扩增 效率更高，同时也更易于异位引发。因此在复杂模板的扩增体系中，3’末 端5聚体的ΔG应大于-9.0kcal/mol） ，如此则有利于正确引发反应而可防止 错误引发。引物的3’端的∆G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引 发DNA 聚合反应。（能值越高越容易结合） 3′末端双链的Δ G是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随 着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%、到－8时少于20%、而 －10时接近于0。
利于提高PCR的特异性
• GC含量太高也易于引发非特异扩增。
有一些模板本身的GC 含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能在上述范围 内，这时应尽量使上下游引物的GC 含量以及Tm 值保持接近（上下游引物的 GC含量不能相差பைடு நூலகம்大），以有利于退火温度的选择。
引物Tm值
一般要求：55℃-65℃。 应尽可能保证上下游引物Tm值一致，一般差异控 制在2 ℃以内。 （引物的退火温度相差小于5℃一般不会影响
Sense primer
→
Antisense primer
选择模板序列保守区域
←
1、引物设计原则
引物长度
碱基分布的均衡性
Tm值 引物二级结构 引物3’端 引物5’端
引物的内部稳定性
自由能分布
引物长度
一般引物的长度为15-30 bp，常用的长度为18-21bp。过 长或过短都不合适，为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适 于Taq DNA聚合酶进行反应，长度大于24 核苷的引物并不意味 着更高的特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。引 物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的
•评分参数
•Rating parameters 评分参数窗口是用来设定二级结构在引物评 分中的权重系数二级结构越稳定引物评分就会越低相对于在引 物中间形成的二级结构来说3 末端的二级结构对PCR扩增的影响 会更大为了将这一效应计算在内软件将3 末端的二级结构的自 由能数值G减去1 这一修正会使3 末端的二级结构显得更加稳定
当此值大于200时便很有可能引发扩增。如所用工具无量
化指标，则可依据经验，当引物与模板在非预期位置退火， 超过70%的碱基能互补配对，或引物3’末端连续8个或以
上碱基配对，则认为有引发的可能。
2、引物设计软件
Oligo 6 （引物评价）* Primer Premier （自动搜索）* Vector NTI Suit （综合分析） Primer Express(实时定量PCR引物和探针设计) Omiga Dnastar Primer3 （在线服务）*
• 5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛 等）。
双酶切位点，有利于定向克隆， 2-3个保护碱基，一般加CG。计 算引物Tm 值时并不包括这些序 列，但是应该对其进行互补性和 内部二级结构的检测。
引物的内部稳定性
过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才 能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。 现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定 结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低 稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T（有说 不适宜用A），少用G或C。
PCR的产率，理想情况下一对引物的退火温度是一样的，可以在 55℃～80℃间变化，有说接近72℃为最佳）
上下游引物Tm值与产物Tm值一般应控制在20 ℃ 以内。 一般采用较低引物Tm值-5℃作为PCR退火温度。
一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以 在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。若G+C含量太低，可在5'端加上一些G或C， 若G＋C含量太高，可在5'端加上一些A或T。
两引物之间不应该存在互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一 般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。
引物3’端
引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基
与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，
否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完
全失败。
引物3’端的碱基一般不用A（3’端碱基序列最好 是G、C、CG、GC）。另外引物间3’端的互补、 二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。
参数设置
载入序列
Load sequence
Preimer Premier 启动界面
粘贴序列窗口 这一窗口使得一段核酸序列通过选择以四种不同 的方式粘贴上去（CTRL-V）
基本信息
Sequence name Original sequence
Choose a function
Use these two button to translate the DNA seq to a protein seq or a protein seq to a DAN seq 8种密码子偏好