微生物资源开发与利用实验指导(定)

微生物资源开发与利用
实验指导
适用于森林资源保护与游憩专业
北京林业大学森林保护学科
二零零二年8月
实验一培养基的配制及灭菌
培养基是人工配制的适于微生物生长、繁殖或保存的营养基质。

培养基的种类繁多，但一般应具备以下几个条件：1.含有适宜的碳源、氮源、无机盐类、生长因素等营养成分；2.含有适量的水分；3.适宜的酸碱度。

根据培养基的成分来源不同可分为合成培养基、天然培养基和半合成培养基。

环境微生物学中，常用废水或废水补加少量氮、磷等无机盐来培养微生物，可认为是天然培养基或半合成培养基。

根据培养基的物理性状可分为液体、固体和半固体培养基。

液体培养基中加一定量的凝固剂（常加琼脂1.5—2%）。

溶化冷凝后即成固体培养基。

半固体培养基含琼脂0.2—0.5%。

某些工农业生产废渣及生活废渣可视为天然的固体培养基。

根据培养基的特殊用途可分为选择培养基、鉴别培养基等。

选择培养基在环境微生物学中应用较广，它是根据待培养微生物的特殊营养要求或生物特征而设计的培养基，利用这种培养基可将所需要的微生物从环境混杂的微生物中分离出来。

如以石油作碳源的培养基可以分离到降解石油的微生物；以纤维素为唯一碳源的培养基可以分离到纤维素分离菌。

本实验介绍培养基配制及灭菌的一般原则和方法步骤。

一、培养基配制的方法和步骤
1.称量：先按配方计算培养基各成分的需要量，称量时用1/100粗天平即可。

在烧杯或搪瓷杯中先放少量水，依次加入培养基各组分，溶解后补足至所需的总水量。

对于肉膏之类粘、胶状物，可盛在小烧杯或表面皿内称量，以便用水移入培养基中。

蛋白胨等极易吸潮物质，在盛取时应动作迅速。

某些无机盐类如磷酸盐和镁盐相混合时易产生沉淀，必要时应分别灭菌后再混合。

此外，生长因素及微量元素等成分因用量极少，可预先配成较浓的储备液，使用时按要求取一定量加入培养液中即可。

2.溶化：各成分必须溶解在培养液中。

最好溶解一种组分后，再加第二种，有时需要加热使其溶解。

如果配方中有淀粉，则应先将其用少量冷水调成糊状，再兑入其他已溶解的成分中，边加热边搅拌，至完全融化即溶液由混浊转为清亮后，补水至所需总量。

溶化琼脂时，应注意控制火力使不至溢出或烧焦，并要不断搅拌。

因加热过程中水分损耗较多，最后应补足至原体积。

根据需要，有时需将溶化后的培养基用脱脂棉或纱布过滤，已使培养基清亮透明。

3.调pH值：以10% HCI或10% NaOH调节培养基至所需pH值。

一般用广泛pH 试纸矫正，必要时亦可用酸度计。

调时需注意逐步滴加，勿使过酸或过碱而破坏培养基中某些组分。

4.分装：将矫正pH后的培养基按需要趁热分装于三角瓶或试管内，以免琼脂冷凝。

分装时应注意勿使培养基粘附于管口与瓶口部位，以免沾染棉塞而滋生杂菌或影响接种操作。

可以通过下边套有橡皮管及管夹的普通漏斗进行分装。

分装量视需要而定。

一般分装入三角瓶以不超过其容积的一半为宜。

分装试管时，斜面培养基以试管高度的1/5左右为宜，半固体培养基以试管高度的1/3左右为宜。

5.加棉塞：试管和三角瓶口需用棉花堵塞，主要目的是过滤除菌，避免污染。

做棉塞所用的棉花应是普通长纤维棉花，不要用脱脂棉，因为脱脂棉易吸水变湿而滋长杂菌。

棉塞制作方法有多种，主要的要求是不宜过松或过紧，应宜塞拔方便而又不易脱落为准。

正确的棉塞其头部应较大，约有1/3在试管外，2/3在试管内（示范），试管以内部分不应有缝隙。

6.灭菌：在装培养基的三角瓶或试管的棉塞外面包一层牛皮纸，即可灭菌。

应用铅笔注明培养基名称、配制日期等。

如制斜面培养基时，灭菌后趁热将试管斜放（示范），注意勿使培养基沾染棉塞。

如制平板培养基时，灭菌后待培养基温度降至50℃左右时以无菌操作将培养基倒入无菌培养皿内，每皿约15-20ml，平放冷凝即成平板培养基，简称平板。

若制半固体深层培养基，灭菌后垂直放置，冷凝即成。

二、灭菌与消毒
灭菌指杀死或消灭所有微生物体。

消毒则是指破坏或消灭病原微生物，只能杀死微生物的营养细胞，而不能杀死全部芽孢。

灭菌与消毒的方法很多，可概分为物理和化学的两类。

如湿热灭菌、间歇灭菌、煮沸消毒、干热灭菌、紫外线灭菌和化学灭菌与消毒等。

实验室常用的方法介绍如下。

高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌是一种湿热灭菌法。

在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时，湿热的穿透力强，而且当蒸汽与被灭菌物体接触冷凝成水时，又可放出热量，使温度迅速升高，从而增加灭菌效力；另一方面，随着压力增高，达到饱和蒸汽时所具有的温度也高。

这样，高压蒸汽灭菌时微生物体受热、湿及压力的作用而被杀死。

由于高压蒸汽灭菌具有灭菌效果好，适用面广的特点，因此，是实验室最常用的消毒灭菌方法。

适于消毒在高温高压下不易分解变压的培养基。

将配制好的培养基放入高压蒸汽灭菌锅中，使其压力增至15磅后/吋²(相当于121℃)。

维持半小时。

即可达到灭菌目的。

高压蒸汽灭菌器分为立式，卧式及手提式等几种。

但原理都是相同的，使用时必须注意以下几点：
1.使用前必须首先注意将器内加入足够的水。

2.将需要灭菌的器物放在灭菌器中，将盖密闭，打开气门。

3.加热，待器内冷空气完全排除后（蒸汽从气门有力地冲出），才可关闭气门，因为空气本身有压力，如不完全赶出，则压力表上所指示的压力便不准确，达不到灭菌要求。

4.当压力上升到所需要的指标后，开始计算时间，灭菌过程中保持压力不变。

5.达到需要灭菌时间后，停止加热，使器内压力自然下降，如欲使压力下将快些，可将气门稍稍打开，使蒸汽徐徐放出（愈慢愈好），切勿将气门立即全部打开放气，不然因器内压力骤然降低，引起瓶内和管内的培养基沸腾外溢，沾污棉塞，不但增加以后操作的困难，而且培养基也易污染。

6.当内外压力相等（压力表指针降到0时），才能打开高压蒸汽灭菌器的盖。

7.千万注意，加热时必须有专人看管，不可疏忽，勿使压力过大。

超出允许范围，以免发生危险。

三、几种常用培养基配方及制作法
1.牛肉膏蛋白胨培养基
牛肉膏 3g
蛋白胨 10g
NaCl 5g
蒸馏水 1000ml
pH7.2—7.4，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

2.高氏一号培养基
可溶性淀粉 20g
KNO
3
1g NaCl 0.5g
K
2HPO
4
0.5g
MgSO
4·7H
2
O 0.5g
FeSO
4
0.01g 琼脂 15—20g 蒸馏水 1000ml 自然pH7.2-7.4,121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

3.查氏培养基
NaNO
3
2g
K
2HPO
4
1g
KCL 0.5g
MgSO
4·7H
2
O 0.5g
FeSO
4
0.01g
蔗糖 30g 琼脂 15-20g 蒸馏水 1000ml 自然pH,121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

4.马丁氏培养基
葡萄糖 10g 蛋白胨 5g
KH
2PO
4
1g
MgSO
4·7H
2
O 0.5g
琼脂 15—20g
蒸馏水 1000ml
自然pH，115℃高压蒸汽灭菌20分钟。

5.马铃薯培养基
马铃薯 200g
蔗糖或葡萄糖 20g
琼脂 15-20g
蒸馏水 1000ml
新鲜马铃薯去皮，切成薄片，称200g,加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足因蒸发而减少的水量，即制成20%马铃薯汁.
在马铃薯汁中加入琼脂, 煮沸溶化，加糖搅匀，补足水分，115℃高压蒸汽灭菌20分钟。

自然pH,加入蔗糖，用于培养霉菌；加入葡萄糖，用于培养酵母菌。

将pH调至7.2-7.4，加入葡萄糖，用于培养放线菌及芽孢杆菌。

四、实验报告和思考题
1. 将琼脂培养基分装试管时应如何操作及其注意事项。

2. 高压蒸汽灭菌时应注意什么问题？为什么？
五、参考资料
王家玲环境微生物学实验高等教育出版社
实验二显微镜的使用、微生物的大小的测定
显微镜的种类很多，一般可分为光学显微镜与非光学显微镜两大类。

光学显微镜按其性能不同又可分为明视野显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、紫外光显微镜、偏光显微镜和荧光显微镜等。

非光学显微镜为电子显微镜。

本实验学习明视野显微镜的使用方法，重点介绍油镜物镜的基本原理与操作步骤。

一、显微镜的使用
1. 光学显微镜的一般构造
光学显微镜的结构分为光学和机械两大部分。

光学部分包括接物镜、接目镜、聚光器、虹彩光圈及反光镜；机械部分包括镜头转换器、粗调节器、细调节器、载物台（镜台）、镜筒、镜臂和镜座等。

接物镜：接物镜在成像中起最重要的作用。

普通光学显微镜的接物镜有高倍镜、低倍镜及油镜三种。

接物镜上刻有放大率如10×，45×，100×等符号。

油镜头上刻有“OI”“HI”等字样，并有黑圈或红圈标志。

接目镜：接目镜的作用是把接物镜的实像再放大一次，并把物象映入观察者的眼中。

一般有接目镜2—3个，其上刻有5×、6×、10×等符号以表示它的放大倍数，数字越大，放大率越高。

一般计算显微镜的放大倍数是：
接目镜的放大率×接物镜的放大率=显微镜的放大倍数
例如接目镜放大率为10，接物镜放大率为45，此时显微镜的放大倍数为450，其余类推。

反光镜：显微镜下方的圆镜，可向四面转动，用镜面收集光线，使光线射向聚光器，反射到接物镜中。

反光镜有平、凹两面，凹面镜聚光力强，适合于光线弱时或无聚光器的显微镜，以及收集通过窗纱的光线或光源为日光灯、物体放大低于100倍时用；平面镜聚光力较弱，适合于光线较弱，如光源为显微镜灯时用。

聚光器：在载物台下方，能聚集光线，增强视野的亮度。

聚光器有的可以升降，升高时增强反射光，下降时减弱反射光。

聚光器内部附有虹彩光圈（也称光圈或光阑），可开大或缩小，以调节进入镜头的光线。

光圈大小应适当，使物像能得到更清晰的效果。

2. 显微镜效能与油镜使用原理：
利用显微镜观察菌体时，总希望能看见最细小的部分，即分辨力（分辨本领）要高。

分辨力是指显微镜能够辨别两点之间最小距离的能力，主要是由接物镜来决定的。

分辨力与接物镜的数值口径成反比，与镜检光波长度成正比：
分辨力=（1/2光波长度）/数值口径
数值口径（亦称开口率，numerical aperture,简写为N.A.）愈大，光波愈短，则所能辨晰的物体愈小。

人们肉眼所能感受的光（即可见光）波长范围在400—700nm，平均光波长度为0.55µm 。

如果放大率为90倍的油镜（N.A. =1.25）和放大率为9倍的接目镜时，其总放大率虽为810倍，但分辨力为0.55/2×1.25=0.22µm。

即便用倍数更大的接目镜，使显微镜的总放大率增加，也仍然分辨不出小于0.22µm 的结构。

数值口径可由下式计算：
N.A. =n·sinɑ
ɑ为镜口角（最大入射角）的半数。

N为介质折射率。

镜口角(图2-1)的大小，决定于接物镜的透镜的直径和焦距，是显微镜光学质量的关键。

介质的折射率。

空气是1，水是1.33，香柏油是1.515。

油镜头焦距短，镜口较大，又滴加香柏油作介质，因而其N.A.最高。

使用油镜必须加油的另一原因是避免散光现象。

因为空气的折射率和玻璃的折射率（1.52）相差较大，当光线经载玻片，再经空气进入接物镜时，部分光线将因折射而散失，从而使视野得不到足够的照明；如果加香柏油，则因其折射率与玻璃折射率相近，可使视野光亮充足。

3. 显微镜的使用法
⑴打开镜箱，右手紧握镜臂，左手托住镜座，轻放桌上。

⑵检查各部件是否完好，镜身、镜头必须清洁。

⑶调解光线时不易用阳光，宜用散射光。

将低倍接物镜对正下方，接物镜头离载物台约1cm，开放光圈，升高聚光器，调节反光镜，一般在光线较强的天然光源下，宜用平面反光镜；光线较弱的天然光源或人工光源，宜用凹面镜。

镜检为染色的标本时，宜用较弱光线。

⑷将标本置载物台上，使之处于接物镜头的正下方。

⑸低倍镜观察：转动粗调节器实低倍接物镜头向下移动至距标本玻片约
0.5cm处。

再由目镜观测，同时转动粗调节器使镜筒慢慢升起直至看到物象时停止。

再用细调节器微调至物象清晰。

将合适的目的物用推动器移至视野中央，以备高倍镜观察。

⑹高倍镜观察：推动转换器将高倍接物镜头转至镜筒正下方，转换时应从侧面用眼观察，以防止接物镜头与载玻片相碰。

然后从目镜中观察，调节光圈与聚光器使得到适宜照明，在转动细调节器（勿动粗调节器！）微调至物象清晰，再将需要放大观察的目的物移至视野正中央，以备油镜观察。

⑺油镜观察
用粗调节器将镜筒提起约1.5-2cm，将油镜头转至镜筒下方。

滴加一滴香柏油与载玻片要观察的部位上。

眼睛从侧面注视，用粗调节器缓缓降下镜筒，直至油镜头浸没于香柏油内，至几乎与载玻片相接触，但注意不能相碰，以免压迫载玻片并损伤油镜头。

然后从目镜中观察，首先调节光圈与聚光器，使光亮适当加大，用粗调节器极其缓慢地提起镜筒至出现物象为止。

再用细调节器微调至物象清晰。

如果镜头已提升出香柏油面而尚未见物象时，因按上述过程重复操作。

油镜使用完毕，将镜筒提起，取下载玻片，用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再取另一张纸沾取少量二甲苯擦镜头，然后用干净擦镜纸擦去镜头上残留的二甲苯。

注意二甲苯用量不宜过多，擦拭时间应短。

⑧. 显微镜使用完毕，将接物镜转成“八”字形，放平反光镜，降下聚光器再下旋镜筒，擦拭镜身灰尘后，归置镜箱中。

二. 微生物大小的测定
微生物大小可利用目镜测微尺来测量。

目镜测微尺是一块可以置放在接目镜中隔板上的圆形玻片，中央刻有等分为50或100小格的标尺。

目镜测微尺不是直接测量微生物，而是观测显微镜放大后的物象。

因目镜测微尺每小格所表示的长度由使用的接目镜和接物镜的放大倍数及镜筒的长度而定，所以在使用前，需用镜（载物）台测微尺进行校正，以求得在特定的显微镜光学系统下目镜测微尺每小格所实际代表的长度。

镜台测微尺为一中央刻有精确刻度的载玻片，一般为1mm等分为100格，每格为10µm,专门用来校正目镜测微尺。

1. 方法和步骤
⑴用镜台测微尺校定目镜测微尺的长度
将目镜测微尺刻度朝下装入接目镜两透镜间的隔板上，将镜台测微尺置于载物台上，使刻度朝上并对准聚光器。

⑵先用低倍镜观察，调焦距，看清镜台测微尺后，转动接目镜使目镜测微尺与镜台测微尺平行对正。

⑶移动推进器，使二尺的一端重合，然后找出另一端第二条重合的线。

如图中之AB与A’B’重合，另一端CD与C’D’重合。

⑷计算目镜测微尺每小格实际长度，记载。

以图所示为例：
镜台测微尺格数×10
目镜测微尺每小格长度=——————————
目镜测微尺格数
5×10
=————=8.33μm
6
⑸同法:在高倍接物镜下找出二尺的重合线，计算目镜测微尺每小格长度，记载。

⑹在镜台测微尺上加香柏油一滴，同法求出使用油镜头时目镜测微尺的每小格长度，记载。

2. 实测微生物的大小：
⑴取下镜台测微尺，换上待测标本片。

⑵按常规操作观察标本片，如细菌菌体大小，在高倍接物镜下不易测量，则用油镜。

不管用任何接物镜头其结果应为一致。

⑶先量出菌体的长和宽各占目镜测微尺的格数，然后换算成微米数。

一般测量细菌的大小，在同一标本片上，需测定10-20个菌体，求出其平均值及变化范围。

三. 实验报告和思考题
1.如何正确使用油镜？
2.为什么要使用目镜测微尺测量菌体？为什么在实测菌体之前要先校正目镜
测微尺？
四、参考资料
王家玲环境微生物学实验高等教育出版社
实验三细菌、放线菌、霉菌的菌落形态观察及常用细菌染色法
一、目的要求
1. 认识细菌、放线菌和霉菌的代表种类的菌落形态特征。

2. 学习常用细菌染色法。

二、基本原理
菌落形态是指某种微生物在一定的培养基上由单个菌体形成的群体形态。

细菌、放线菌和霉菌，每一类微生物在一定培养条件下形成的菌落各具有某些相对的特征，利用观察这些特征，来区分各大类微生物及初步识别、鉴定微生物，方法简便快速，在科研和生产实践中常被采用。

三、实验材料
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）
细黄链霉菌（5406放线菌，Streptomyces microflavus）
青霉属(Penicillium)
曲霉属(Aspergillus)
根霉属(Rhizopus)
显微镜、载玻片、盖玻片、解剖针、镊子、酒精灯、纱布、接种环、吸水纸、香柏油、二甲苯、蒸馏水、齐氏石炭酸复红染色液、吕氏碱性美兰染液、草酸铵结晶紫染液、鲁哥氏碘液和番红染色液。

四、实验步骤
1.认真观察各种菌的菌落形状、大小、颜色、质地等特征并作描述纪录。

2.制临时玻片，用显微镜对细菌、放线菌和霉菌进行观察，试比较它们的形态
特征。

细菌、放线菌和霉菌的简介：
⑴细菌：菌落表面光滑，有粘稠性，颜色乳白色或浅黄色。

细菌是一类单细
胞微生物，个体小，一般需要放大1000倍才能看到，基本形态有球状、杆状和螺旋状三种。

球状的直径为0.5-2.0微米；杆菌和螺旋菌的宽度为
0.5-1.0微米，长度因种类的不同有较大差异，一般为1-5微米。

有些杆菌在细胞内能形成圆形或椭圆形的无性休眠体结构，称为芽孢。

芽孢的壁很厚，含水量少，化学物质不易渗透，对高温、光线、干燥和化学药品等有较强的抵抗力，因此，进行消毒灭菌时，湿热灭菌需提高到120℃以上，干热灭菌需140-160℃方能达到灭菌要求。

⑵放线菌：在琼脂培养基上，放线菌的菌落形态与细菌菌落有明显差异。

其菌落大小介于霉菌和细菌之间。

菌落表面多为紧密的绒状，坚实多皱，长孢子后呈粉末状。

放线菌的细胞细长，中间不分隔，称为菌丝，菌丝的宽度与细菌相近，在1微米左右，需放大1000倍才能看到。

它的菌丝有两种，一种长在培养基内部和紧贴在培养基表面，称为基内菌丝，起吸收营养的作用；一种在培养基表面，向空气中伸出，称为气生菌丝。

气生菌丝发育到一定阶段，顶端形成孢子丝，产生孢子。

孢子丝的形态不同，有的是直的，有的是波浪似的，有的螺旋状，是区分放线菌种类的重要特征。

⑶霉菌：霉菌的菌体成丝状，称为丝状真菌，但霉菌的菌丝要比放线菌粗十倍到数十倍。

霉菌的菌落比细菌、放线菌都大，呈绒状或疏松的棉絮状，并有各种颜色。

生物进化上比较低等的霉菌，菌丝体不分隔，整个菌体就是一个大细胞；较高等的霉菌，菌丝有许多分隔，成为多细胞微生物。

霉菌的菌丝也分为营养菌丝和气生菌丝，他们的作用也和放线菌一样，营养菌丝具吸收养料的功能，气生菌丝可分化出繁殖器官，产生孢子。

孢子随风飞散，漂浮在大气中，遇到适宜的条件就萌发成新的菌丝体。

他们对营养条件要求不严格，很容易在各种物质上生长，造成“发霉”的现象。

①青霉属（Penicillillum）青霉菌的菌丝体无色，有横隔，在琼脂培养基上形成的菌落密毡状或棉絮状，初期白色，后期呈蓝绿色，青霉菌的分生孢子梗呈扫帚状分支，顶端串生球形至椭圆形的分生孢子，菌落的蓝绿色即是分生孢子表现的颜色（显微镜示范片）。

②曲霉属（Aspergillus）曲霉的菌丝通常无色，有横隔，老熟时渐变浅黄至褐色。

接触培养基的菌丝分化出厚壁的足细胞，并由此向上生长直立的分生孢子梗，其顶端膨大成半球形或椭圆形的顶囊，顶囊表面以辐射状长出一层或双层瓶状小梗，小梗顶端串生分生孢子。

分生孢子呈球状或柱状（显微镜示范片）。

③根霉属（Rhizopus）菌丝不分隔，为多核的单细胞微生物。

在培养基上生长时，由营养菌丝体产生匍匐枝向四周蔓延，匍匐枝的末端产生一丛假根，伸入培养基中吸收养料。

从假根的相反方向长出直的孢子囊梗、端生膨大的孢子囊、囊内充满着球形的孢囊孢子。

孢子囊成熟后破裂，释放出褐色的孢子（显微镜示范片）。

五、常用细菌染色法
细菌个体小,菌体透明,必须通过染色使其着色后,才能较好地在光学显微镜下观察其个体形态与部分结构.几种常用染色法介绍如下.
1.简单染色法
采用一种单色染料对细菌进行染色，适用于菌体一般形态的观察。

简单染色法操作步骤如下：
⑴涂片：取干净载玻片一块，滴一小滴蒸馏水或生理盐水（菌悬液可不加水），用接种环以无菌操作挑取少许菌落（或菌液），与载玻片上水调匀涂成极薄菌膜。

⑵风干：使载玻片上的菌液在空气中自然干燥。

⑶固定：涂片面向上，用大拇指与食指夹住载玻片一端的侧面，使载玻片在酒精灯火焰上通过3-4次加热以固定细菌。

注意不是用火烤。

⑷染色：在已固定的涂片上，滴加适当染色液，染色时间随不同染色液而异。

如用齐氏石炭酸复红染色液，染色1-2分钟；如用吕氏碱性美兰染液，则染-3分钟。

⑸水洗：用细水流将涂片上染料洗去，水流勿过急过猛，应由玻片上端倾
斜流洗至无多余燃料时止，将涂片自然干燥或吹风至干。

⑹镜检。

2.格兰氏染色法
是细菌学中一个重要的鉴别染色法。

根据细菌对此种染色法的反应不同，可将细菌区分为两大类，菌体呈紫色者为格兰氏阳性细菌，呈红色者为格兰仕阴性细菌。

格兰氏染色法是一种复染色法，应用结晶紫与番红两种不同性质的染料进行染色。

染色成败的关键在于严格掌握酒精脱色程度，和应使用新鲜幼龄的菌体进行涂片。

其操作步骤如下：
⑴涂片：将待检细菌按上述简单染色法涂片、风干、固定。

固定时通过火焰2次即可。

⑵初染：加草酸铵结晶紫染液染色1分钟，水洗。

⑶碘液固定：滴加鲁哥氏碘液冲去残水，覆盖涂片1分钟，水洗。

⑷酒精脱色：用95%酒精滴洗涂片处，至流洗出的酒精不呈现紫色时，立即用水冲洗酒精。

脱色时间约20秒钟，或视涂片厚薄而略有差异。

⑸复染：用番红（或称沙黄）染色液染色1-2分钟，水洗。

风干后镜检。

六、实验报告与思考题
1.系统描述所观察的各种菌落的形态特征。

2.格兰氏染色的关键何在？为什么？
七、参考资料
王家玲环境微生物学实验高等教育出版社
附：常用染色剂的配制
1.齐氏（Ziehl）石炭酸复红染色液
溶液A 碱性复红（basic fuchsin） 0.3g
95%酒精 10ml 溶液B 石炭酸 5.0g
蒸馏水 95ml 将碱性复红在研钵中研磨后，逐渐加入95%酒精，继续研磨使之溶解，配成溶液A.
将石炭酸溶解在蒸馏水中，配成溶液B
将溶液A与溶液B混合即成.通常将此混合液稀释5-10倍使用。

因稀释液易变质失效，故一次不宜多配。

2.吕氏(Loeffler)碱性美兰染液
溶液A 美蓝（methylene blue，亦称亚甲蓝） 0.6g 95%酒精 30ml 溶液B KOH 0.01g
蒸馏水 100ml 分别配制溶液A和溶液B,配好后混合即可。

3.草酸铵结晶紫染液
溶液A 结晶紫（crystal violet） 2.0g
95%酒精 20ml 溶液B 草酸铵 [（NH4）C2O4•H2O] 0.8ml
蒸馏水 80ml 将A及B二溶液混合，静置48小时后使用。

4.鲁哥氏（Lugol）碘液
I2 1.0g
KI 2.0g
蒸馏水 300ml 先将KI溶解在少量蒸馏水中，再将I2溶解KI溶液中，然后加水至300ml 即成。

5.番红染色液
番红（safranine O，亦名沙黄） 2.5g
95%酒精100ml
蒸馏水90ml 将上述配好的番红酒精溶液10ml与90ml蒸馏水混合即成。