生物分离工程02发酵液预处理

4、离心方法的选择


对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小 和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间， 就能达到分离效果。 超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度离心 和等密度梯度离心
（1）差速离心

第三节
固液分离工程
本节介绍细胞分离、目标产物释放以 及蛋白质复性的各种主要方法。
固液分离的目的和方法


包括两方面： 收集胞内产物的细胞或菌体，分离除去液相，或 者是收集含生化物质的液相，分离除去固体悬浮 物，如细胞、菌体、细胞碎片、蛋白质的沉淀物 和它们的絮凝体等。 常用的方法：过滤和离心分离等化工单元操作。
（2）变性法：




蛋白质从有规则的排列变成不规则结构的过程称为变性。 变性蛋白质溶解度较小。 最常用的使蛋白质变性的方法是加热。加热还能使液体粘 度降低，加快过滤速度。 柠檬酸发酵液，采用加热至80℃以上，使蛋白质变性凝 固和降低发酵液粘度，从而大大提高了过滤速度。 变性的其它方法：大幅度调节PH，加有机溶剂 链霉素生产中，采用调pH至酸性（pH3.0），加热至 70℃，维持半个小时的方法来去除蛋白质，能使过滤速 度增大10-100倍，滤液粘度可降低1/6。 注意：加热法只适合对热稳定的目的产物；极端PH会导 致某些目的产物失活，且消耗大量酸碱；而有机溶剂法通 常只适用于所处理的液体数量较少的场合。
一、降低液体粘度


常用方法： （1）加水稀释法：有效（稀释后过滤速率提高的 百分比必须大于加水比才能认为有效） （2）加热法：同时，在适当温度和受热时间下使 蛋白质凝聚，进一步改善了过滤特性。 严格控制加热温度与时间
二、调整PH


等电点法 对某一具体的单元操作的作用：改变大分子物质 的电荷特性，减少堵塞和污染，如膜过滤。 一些物质（如细胞、细胞碎片、胶休物质等）在 某个PH下也可能趋于絮凝，有利于过滤进行。
3、絮凝


大分子絮凝剂将胶体粒子交联成网状，形成絮凝 团的过程。 机理：架桥作用。絮凝剂通过静电引力、范德华 力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当 一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的 胶粒表面上，产生桥架联接时，就形成了较大的 絮团，这就是絮凝作用。
高分子絮凝剂的吸附架桥作用
常用的絮凝剂
五、加入反应剂


不影响目的产物 作用机理：加入反应剂和某些可溶性盐类发生反 应生成不溶性沉淀，生成的沉淀能防止菌丝体粘 结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤 剂，并且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过 滤性能。 正确选择反应剂和反应条件，能使过滤速率提高 3~10倍。
第二节
发酵液的相对纯化
（3）吸附法

利用吸附作用也可除去蛋白质。 四环类抗生素生产中，采用黄血盐和硫酸锌的 协同作用生成亚铁氰化锌钾K2Zn3[Fe(CN)5]2的 胶状沉淀来吸附蛋白质，利用此法除蛋白质已 取得很好的效果。 在枯草杆菌发酵液中，常加入氯化钙和磷酸氢 二钠，这两者本身生成庞大的凝胶，把蛋白质、 菌体及其它不溶性粒子吸附并包裹在其中而除 去，从而加快了过滤速度。
（3）、 超速离心机


2.5×104 r/min～8×104 r/min ，RCF 5×105g或更高 结构：离心管帽、冷冻装臵和温控系统、真空系统、安全 保护系统、制动系统、指示仪表等。 按用途分： 制备用超速离心机：分离纯化生物大分子、细胞器和病 毒等 分析用超速离心机：测定样品纯度（根据紫外吸收率或 折光率等判断）、沉降系数、相对分子量
1、沉降系数S


单位离心力作用下粒子的沉降速度，以 Svedberg表示，简称S。1S=1×10-13s 离心沉降速度 沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时 间内物质运动的距离。是离心设备的一个重 要技术指标，是其所能达到的离心力与重力 的比值。
2、离心力


离心力(Centrifugal force) ：离心力作为真实的力根本 就不存在，在非惯性系中为计算方便假想的一个力。 相对离心力（Relative centrifugal force ，RCF） ： 通常离心力常用地球引力的倍数来表示，指在离心场中， 作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重 力加速度“g”。
F（离心力） RCF ( 2 n) 2 r / g F（重力）

注：n(rpm)应折换成 转/秒 一般情况下，低速离心时常以转速“rpm”来表示，高 速离心时则以“g” 表示。
离心机的种类与用途



按转速分：常速（低速）、高速和超速 （1）、常速离心机 <8000r/min，RCF<1×104g 用途：分离细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等 较大颗粒 （2）、高速离心机 1×104g～2.5×104 r/min ，RCF 1×104g～105g 用途：分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等 高速冷冻离心机
2、 Mg2+，Fe3+ 的除去





草酸镁的溶解度较大，故加入草酸不能除尽镁离 子。要除去镁离子，可以加入三聚磷酸钠Na5P3O10， 它和镁离子形成可溶性络合物： Na5P3O10 ＋ Mg2+→ MgNa3P3O10 ＋ 2Na+ 用磷酸盐处理，也能大大降低钙离子和镁离子的 浓度。 要除去铁离子，可加入黄血盐，使形成普鲁士蓝 沉淀: 4Fe3+ +3K4Fe(CN)6 →Fe4[Fe(CN)6]3↓+12K+
胶 体 双 电 层 结 构
凝聚值或凝聚价
在发酵液中加入具有高价阳离子的电解质，由于 能降低双电层电位和脱除胶粒表面的水化膜，就 能导致胶粒间的凝聚作用。 电解质的凝聚能力可用凝聚值或凝聚价来表示， 使胶粒发生凝聚作用的最小电解质浓度 （mmol/L），称为凝聚值或凝聚价。


Schulze-Hardy法则——叔米-哈第法则
二、杂蛋白质的除去



前面介绍的方法，在改善发酵液过滤特性的同时， 也除去了一部分杂蛋白质。下面再介绍几种常用 的方法： （1）沉淀法：等电点沉淀法 蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中，胶体粒 子的稳定性和其所带电荷有关。和氨基酸等两性 物质一样，蛋白质在酸性溶液中带正电荷，在碱 性溶液中带负电荷，而在某一pH下，净电荷为零， 溶解度最小，可使其产生沉淀而除去，称为等电 点沉淀法。
三、凝聚与絮凝


凝聚与絮凝其处理过程就是将化学药剂预先投加 到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒 子的分散状态，破坏其稳定性，使它们聚集成可 分离的絮凝体，再进行分离。 1、概念上的差别 凝聚是指在电解质的作用下，由于胶粒之间双电 层排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳 定的现象。絮凝则是指在某些絮凝剂存在下，基 于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。
常用的絮凝剂


天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等 聚糖类，还有明胶、骨胶、海藻酸钠等。 微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝 剂，它是一类由微生物产生的具有絮凝细胞功 能的物质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维 素及核酸等高分子物质。微生物絮凝剂和天然 絮凝剂与化学合成的絮凝剂相比，最大的优点 是安全，无毒和不污染环境。
四、加入助滤剂


1、助滤剂及其作用：最常用的——硅藻土 2、使用方法：两种 （1）在过滤介质表面预涂助滤剂 （2）直接加入发酵液 也可两种方法同时兼用 3、选择及使用要点 （1）根据目的产物选择助滤剂品种 （2）根据过滤介质和过滤情况选择助滤剂品种 （3）粒度选择：必须与悬浮液中固体粒子的尺寸相适 应 （4）使用量的选择：合适
2、凝聚



胶体粒子(10-100nm)中性盐促进下脱稳相互聚集 成大粒子（1mm） 机理： （1）中和粒子表面电荷 （2）消除双电层结构 发酵液的带电现象 发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的 表面，一般都带有电荷，带电的原因很多，主 要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。
发酵液的带电现象——双电层结构

2、如何选择合适的预处理方法?


第一节
发酵液过滤特性的改变
发酵液的特性


特性： ⑴发酵产物浓度较低，大多为1~10%，悬浮液 中大部分是水； ⑵悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； ⑶固体粒子可压缩性大； ⑷液相粘度大，大多为非牛顿型流体； ⑸性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、 微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。 这些特性，使得发酵液的过滤与分离相当困难。 物理化学方法


聚丙烯酰胺（po1yacry1amide）类和聚乙烯亚胺 （polyethyleneimine）衍生物，根据活性基团在 水中解离情况不同，可分为非离子型、阴离子型 （含有羧基）和阳离子型（含有胺基）三类。由 于聚丙烯酰胺类絮凝剂具有用量少，一般以ppm 计量，絮凝体粗大，分离效果好，絮凝速度快以 及种类多等优点，所以适用范围广。 聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。 无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚 合铝盐和聚合铁盐等。
絮凝剂应用优化




用量控制：最佳用量为粒子表面积约有一半被聚合物 覆盖时所用的絮凝剂量。 pH 控制 固体浓度与粒子尺寸分布 电解质含量 后续工艺要求
凝聚和絮凝在发酵液预处理中的应用

凝聚和絮凝技术能有效的改变细胞菌体和蛋白质 等胶体粒子的分散状态，使其聚集起来，增大体 积以便固液分离，常用于菌体细小而且黏度大的 发酵液的预处理中。
一、重力沉降

虽然简便易行，但速度很慢。 可先用凝聚或絮凝技术使颗粒变大，再使用。 使用场合有限
二、离心分离



借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和 不同密度的物质分离的技术。 最广泛使用的非均相分离手段，细胞的收集、细 胞碎片和沉淀的分离等常用离心分离。 超速离心技术已成为分离、纯化、鉴别和各种生 物大分子的重要手段之一


为什么要纯化？ 对于不同的杂质，要选择不同的方法。
一、高价无机离子的除去


发酵液中主要的无机离子有Ca2+，Mg2+，Fe3+ 1、 Ca2+ 的除去 为了去除钙离子，宜加入草酸。但草酸溶解度 较小，故用量大时，可用其可溶性盐，如草酸 钠。反应生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固， 提高滤液（也称为原液）质量。但草酸价格较 贵，应注意回收。如四环类抗生素废液中，加 入硫酸铅，在60℃下反应生成草酸铅。后者在 90~95℃下用硫酸分解，经过滤、冷却、结晶 后可以回收草酸。
板和框的结构板框过滤机真空转鼓过滤大规模工业生产常用的过滤设备之一1工作过程过滤转鼓下部浸没于待过滤的悬浮区中过滤区滤液在大气压的作用下透过滤布进入转鼓内腔有一定真空度滤渣留在转鼓表面的过滤介质上形成滤饼
第二章 发酵液预处理
两个问题

1、为什么要进行发酵液的预处理?

不仅在于分离菌体和其他悬浮颗粒，还着眼于除去部分 可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于提取和精制后继 各工序的顺利进行。 各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预 处理方法的选择也有不同。大多数发酵产物存在于发酵 液中，也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中 都含有。 对于胞内产物，经预处理应尽可能使目的产物转移到液 相，然后经固液分离除去固相；对于胞内产物，则应首 先收集菌体或细胞，经细胞破碎后，目的产物进入液相， 随后再将细胞碎片分离。


反离子的价数越高，该值就越小，即凝聚能力越 强。 阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为A13＋ ＞Fe3+ ＞H＋＞Ca2十＞Mg2+＞K+＞Na+＞Li+，常 用的凝聚剂电解质有： Al2(SO4)3· 20（明矾）； 18H AlC13· 2O；FeC13；ZnSO4；MgCO3等。 6H


通常发酵液中细胞或菌体带有负电荷，由于静电 引力的作用使溶液中带相反电荷的粒于（即正离 子）被吸附在其周围，在界面上形成了双电层。 但是这些正离子还受到使它们均匀分布开去的热 运动的影响，具有离开胶粒表面的趋势，在这两 种相反作用的影响下，双电层就分裂成两部分， 在相距胶核表面约一个离子半径的平面以内，正 离子被紧密束缚在胶核表面，称为吸附层或stern 层；在stern平面以外，剩余的正离子则在溶液中 扩散开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体 溶液的平均浓度，称为扩散层。这样就形成了扩 散双电层的结构模型。