DNA的粗提取与鉴定(精华版)东师1

3.DNA遇二苯胺(沸水浴)会染成( ) A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色 答：D 4.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液 中的上清液? 答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于 上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以 要除去上清液(含有蛋白质)。
5．DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同；DNA不 溶于酒精溶液，而细胞中的某些物质溶于酒精溶液。下图 为“DNA的粗提取”实验的相关操作步骤，其操作目的 错误的是（ A ）
DNA等大分子的理化性质
⑴ DNA的溶解性
DNA和蛋白质等成分在不同 浓度的NaCl溶液中溶解度不 同利用这一特点，选择适当 的盐浓度就能使DNA充分 ⑵ DNA不溶于酒精溶液 溶解，而使杂质沉淀；
用高浓度的盐溶液溶解 DNA，能除去在高盐中 不能溶解的杂质；用低 ⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 盐浓度使DNA析出，能 除去溶解在低盐溶液中 的杂质。
• 一是利用低温抑制核酸水解酶的活性，防止DNA的 降解； • 二是低温条件下降低分子运动，易于DNA沉淀析出 而形成白色丝状物； • 三是低温有利于增加DNA分子的柔韧性，减少丝状 物的断裂； • 四是利用DNA和蛋白质在酒精中的溶解度差异，将 DNA与杂质蛋白进一步分离，因为DNA不溶于酒精 而某些蛋白质则溶于酒精。 • 因此加入预冷的酒精后悬浮于溶液中的DNA相对杂 质较少而析出的DNA丝状物则较多。
请同学们解释提取DNA的实验操作中主要的 步骤的目的。
第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含 量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或 多或少的损失而造成检测的困难； 第二步是DNA的释放和溶解，这一步是实验成功与 否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解； 第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对 酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地 将DNA与杂质分开； 最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结 果的检测。
实验步骤 1、胀破细胞，得DNA溶液
（1） 鸡血细胞液5-10ml，加入蒸馏水20ml，使血细 胞加速破裂，过滤，取其滤液。 (2)溶解细胞核内的DNA
将物质的量浓度为2mol/l的氯化钠溶液40ml加入 到滤液中，搅拌使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈 溶解状态。
2、析出含DNA的黏稠物
沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时轻轻搅拌，这时 会有丝状物出现，随着蒸馏水的加入逐渐增多，一 直到氯化钠浓度约为0.14mol/l时，不再继续增加。
静置降沉的鸡 血细胞液
加入蒸馏水 玻棒搅拌
加入NaCl 过滤去除杂质 加入蒸馏水 使浓度为2mol/L 使浓度为0.14mol/L DNA为溶解状态 析出DNA
过滤,取纱布上 含DNA的粘稠物
2mol/L NaCl 再溶解DNA
往滤液中加入 等体积的冷酒精
预冷的酒精溶液（体积分数为95%）的作用主要有四：
(05广东32)．下表是关于DNA粗提取与鉴定实验中所使 用的材料、操作及其作用的表述错误的是 试剂 柠檬酸钠 A 溶液 操作 与鸡血混合 作用 防止血液凝固
B
C D
蒸馏水
蒸馏水 二苯胺
与鸡血细胞混合
保持细胞形状
加入到溶解有DNA 析出DNA丝状 的NaCl中 物 加入到过滤后DNA 产生特定的颜色 的NaCl中 反应
1213鸡血细胞破碎以后释放出的鸡血细胞破碎以后释放出的dnadna容易被玻璃容器吸附所以在提取容易被玻璃容器吸附所以在提取过程中为了减少过程中为了减少dnadna的损失最好的损失最好使用使用塑料塑料的容器盛放鸡血细胞液的容器盛放鸡血细胞液14血细胞液加入蒸馏水玻棒搅拌15加入nacl使浓度为2molldna为溶解状态过滤去除杂质加入蒸馏水使浓度为014moll析出dna16过滤取纱布上含dna的粘稠物2mollnacl再溶解dna往滤液中加入等体积的冷酒精1718预冷的酒精溶液体积分数为95的作用主要有四
2、植物细胞 讨论：加入洗涤剂和食盐的 ① 植 物细胞 需要先 作用分别是什么？ 用一 定 的 洗 涤 剂 和 食盐溶解细胞膜 答：洗涤剂是一些离子去 污剂，能溶解细胞膜，有 利于DNA的释放；食盐的 主要成分是NaCl，有利于 DNA的溶解
想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分， 会对实验结果产生怎样的影响？
3.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此， 二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。
二、实验设计
（一）实验材料的选取 （二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 （三）除去滤液中的杂质(纯化) （四） DNA的析出与鉴定
（一）实验材料的选取
1、材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血 、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠 菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。 2、原则：选用DNA含量相对较高、容易提取 的生物组织。 3、合适的材料： 鸡血
(1) 哺乳动物成熟的红细胞不适于作DNA提取的材料， 但却是提取血红蛋白和制备细胞膜的理想材料。 (2) 实验过程中两次用到蒸馏水
第一次目的：使鸡血细胞涨破释放出DNA
第二次目的：稀释NaCl溶液之0.14 mol/L ，析出DNA
DNA粗提取注意问题： 1) 材料要选用DNA含量较高的生物组织; 2) 整个实验中两次用到2mol/L的NaCl溶液;
1.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯 中加入蒸馏水的作用是( )。 A.稀释血液、冲洗样品 B.使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出 C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA 答：B 2.实验中NaCl的物质的量浓度为2 mol／L和 0.14 mol／L对DNA有何影响? 答：前者是溶解DNA，后者是使DNA析出
A．①是洗涤红细胞、去除红细胞表面的杂质 B．②是稀释NaCl溶液至0.14mol/L，析出DNA C．③是选用2mol/LNaCl溶液，溶解粘稠物中的DNA D．④是纯化DNA，去除溶于95%酒精的杂质
6．向溶有DNA的2 mol/L的NaCl溶液中不断 加入蒸馏水，在这个过程中DNA和杂质蛋白 质的溶解度变化情况分别是( C ) A．减小；减小 B．增大；增大 C．先减小后增大；增大 D．减小；增大
破碎细胞，获取含DNA的滤液
1、动物细胞
动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞 液中加入一定量的蒸馏水 ，同时用玻璃 棒搅拌，过滤后收集滤液即可
讨论：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗溶液， 水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂， <再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞 的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，>从而释放出 DNA。
1. DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓 度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为 0.14 mol／L时,DNA的溶解度最低。利用这一 原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。
实验原理
2.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质 则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进 一步提取出含杂质较少的DNA。
3) 酒精最好用95%的冷酒精;
4) 二苯胺试剂最好现配现用,如果从冰箱取 出,用时要先摇匀; 5) 将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步 骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁 加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均 匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕.
讨论： 1.为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会 有什么变化？ 答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞 会吸水以至胀破 2.用玻璃棒搅拌有什么意义？ 答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的 破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能 太快太猛，防止打碎DNA 3.滤去的是什么物质？得到的是什么？ 答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质； 得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA
经研磨可破碎细胞壁，使细胞核内的DNA释放。若研磨不
充分，会使提取的DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物、
用二苯胺鉴定不显示蓝色等。
讨论：滤液/研磨液中可能含有哪些成分？
答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质
为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理
•鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，
容易被玻璃容器吸附，所以在提取 过程中为了减少DNA的损失，最好 使用塑料的容器盛放鸡血细胞液
实验操作小结： 制备鸡血细胞液…………加柠檬酸钠，静置或离心 ↓ 破碎细胞，释放DNA… 加蒸馏水，同一方向快速 通方向搅拌 ↓→Cl至2mol/L，同一 方向缓慢搅拌 ↓
DNA析出……………… 加蒸馏水至0.14mol/L， 过滤，再溶解到2mol/L溶液中 ↓→除去细胞质中的大部分物质。 DNA初步纯化………… 与等体积95％冷却酒 精混合，析出白色丝状物 ↓→除去核蛋白、RNA、多糖等。 DNA鉴定……………… 二苯胺，沸水浴，呈 现蓝色
⑵ DNA不溶于酒精溶液
DNA不溶于酒精溶液， 但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。 将DNA与蛋白质进一步分离。
⑶ DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 ① 蛋白酶——水解蛋白质， 对DNA没有影响 ② 高 温——大多数蛋白质不能忍受60～80℃ 而DNA在80℃以上才会变性
③ 洗涤剂——溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质 但对DNA没有影响
1
2
析出白色 DNA丝状物
能用甲基绿代替二苯胺对DNA进行鉴定吗？
不能
用二苯胺的目的是鉴定提取的物质是否是DNA，
而在观察DNA和RNA在细胞中的分布时，是用 甲基绿和吡咯红混合染液进行染色的，如果 单独染色会使两者都染上绿色或者红色（因 为二者都能与甲基绿亲和，只不过亲和力不 同），所以这个实验如果用甲基绿的话，就 不能确定最后得到的绿色物质是否就是DNA了。