MTT法活性筛选步骤

MTT法活性筛选步骤
材料
试剂：
二甲亚砜（DMSO）分析纯
灭菌PBS, pH 7.4
MTT储存液（5mg/mL）：配制于灭菌PBS，-20摄氏度保存
工作液MTT：储存液用灭菌PBS稀释5倍使用。

MTT法筛选步骤
一、接种细胞
1.将培养在100mm培养皿的对数生长期细胞去掉培养基，用5ml灭菌PBS洗涤一次
2.去掉PBS，用胰酶消化制成单细胞悬液
3.用血球计数板计数细胞悬液浓度，根据需要接种细胞量，吸取相应体积细胞悬液，用
培养液稀释至相应体积，混匀，使细胞浓度为5×104/ml.
4.向96孔细胞培养板中每孔加入100ul细胞稀释悬液，空白组加入等量培养液，未加细
胞悬液的孔加入等量PBS缓冲液。

5.培养板放入37℃，5% CO2培养箱中培养24h。

接种前的细胞必须状态良好，且不能太密集。

否则不能接种。

接种时要不时摇晃细胞悬液，保证接种密度均匀。

接种密度不均匀是造成误差的主要原因。

二、药物准备、药物处理
实验前开紫外照射细胞间、超净台及配药用离心管。

1.待测样品用DMSO配成浓度为50mg/ml母液。

2.用培养液将配好的50mg/ml母液稀释至100ug/ml，再用100ug/ml药物稀释成不同浓
度（药物浓度梯度为0，6.25，12.5，25，50，75，100µg/ml）。

3.细胞培养24h后将平板中培养液吸去。

4.将各浓度药物混匀，加入到对应各个孔中，每孔加200ul。

每个浓度设置4个平行孔。

加药时不可直接打到孔底，应沿着孔壁加入。

5.将平板放入37℃，5% CO2培养箱中温育3d。

三、加MTT，
实验前开紫外照射细胞间、超净台
1.吸去平板孔中培养液，包括空白组
2.加入100ul 1mg/ml的MTT于每孔中。

3.放入37℃，5% CO2培养箱中孵育4~8小时。

孵育时间不得少于4小时，也不能大于8
小时。

四、OD值测定
1.酶标仪开机预热15min。

2.小心吸去平板孔中MTT。

3.每孔加入150ul DMSO。

4.振荡器上振荡10min。

5.492nm波长下测吸光值。

6.用SPSS计算IC50值
细胞增殖抑制率计算公式：
抑制率=[(A control-A test)/A control]×100%。

所有的吸光度值都必须减去空白组的吸光度值。

附：细胞及药物浓度分布图
初筛
白色：PBS；蓝色：培养液；其他颜色：细胞
B：空白；C：对照，橙色为阳性对照（CDDP5ug/ml），黑色为阴性对照。

1-9：待测样品。

IC50测定
白色：PBS；蓝色：培养液；红色：细胞；
B：空白；+：阳性对照（CDDP 5ug/ml）。