一个水稻多柱头突变体的形态特征和基因定位

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水稻叶尖早衰突变体lad的形态、生理分析与基因定位

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(1): 168-173 /zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家自然科学基金项目(31071072)和重庆市重大攻关项目(CSTC, 2010AA1013)资助。

*通讯作者(Corresponding author): 赵芳明, E-mail:zhaofangming2004@第一作者联系方式: E-mail: duqing2863@Received(收稿日期): 2011-05-19; Accepted(接受日期): 2011-09-18; Published online(网络出版日期): 2011-11-07. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20111107.1552.019.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00168水稻叶尖早衰突变体lad的形态、生理分析与基因定位杜青方立魁桑贤春凌英华李云峰杨正林何光华赵芳明*西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市市级重点实验室, 重庆400716摘要: 叶片作为植物的主要光合作用场所, 研究其早衰机制对提高作物的经济产量具有非常重要的意义。

本研究报道了一个来自EMS诱变优良恢复系缙恢10号的新水稻叶尖早衰突变体lad (leaf apex dead), 其叶尖在第5片叶抽出前呈正常状态, 当第5叶完全抽出之后前5叶的叶尖变黄并最终枯死; 随后的叶子在完全抽出后, 叶尖也逐渐变黄并枯死。

对该突变体的生理生化分析发现, 其叶绿素含量、可溶性蛋白含量明显下降, SOD酶活性异常。

其株高、叶长、粒数等也都显著降低。

经遗传分析, 该突变性状受1对隐性单基因控制, 利用分子标记将该基因定位于第11染色体SSR标记SWU11-19和SWU11-5之间, 遗传距离为13 cM, 并且与SSR标记SWU11-25和SWU11-27共分离。

一个水稻类树稻突变体(LEAFY HEAD 3)基因的精细定概要

５８８中国水稻科学（ｉｃｃ）第２ＣｈｎＪＲｉｅＳｉ３卷第６期（０９年ｕ月）２０２０００，２（）：１５１９２３７－７．１３．０２［１Ｎａａａ１］ｇｓｗａＮ，Ｍｉｏｈ，ＳｎｙｓｉＭａｏＹ，ｅａＤｅｕａｅｏｈｔ１Ｌｒｇｌｔｓｂｔ．ｌａｎｓｉｄｖｌｐｅｔｉｉｅＲｉｅＧｅｅｗｓ１９ｅｆａｄｐｉｔｌｅｅｏｍｎｎｒｃ．ｃｎｔＮｅｌ，９６，１３：１２１５００．［ｏｎＨ，ＹａｍｏｏＴ，Ｓｓｋ２］ＬｉＸｍａｔａａｉＴ，ｅ１Ｃｈｒｃｅｊａｉｎａｄｔａ．ａａｔｚｔｏｎｒｄｔｃｉｎｏｐｓａｉｉｔｒｃｉｎｆ３ＱＴｓｅｅｔｆｉｔｎｅａｔｓｏＬ，Ｈａ，Ｈｃｎｏｅｔｃｏｌｃａｄ２Ｈ幽，ｃｎｔｏｌｇｅｄｎｄｔｉｒｃｕｉｇｅｒｙｓｇｎｃｏｒｌｉｈａｉｇａｅｎｉｅｓｎｎａｌｉｏｅｉｎ［２罗伟，１］胡江，孙川ｉ，等．水稻抽穗期功能叶叶型相关性ｌｅ．ＴｈｏｉｓｎｅｒＡｐｐｌＧｅｅ，２０ｎｔ００，１：１２—０８．０１０１１２ｋｗａＴｋｔｍｉＳ，ｅ１ｔａ．Ｐｈｏｈｏｅｏｆｒｙｔｅｒｍｓｃｎｅ［１ｚｗａＴ，Ｏｉａ，Ｔｏｕｏ２］Ｉａｔｅｐｏｏｅｉｄｃｏｔｏｏｆｏｒｎｉｒｃ（ａｈｔｄｙｈｈｔｐｒｏｉｃｎｒｌｆｌｗｅｉｇｎｉｅｓｏｒ—ａ状遗传分析．分子植物育种，２０，６５：８３８００８（）５—６．［３ｕ—ｃｉ，Ａｔｕｈ１］ＪｎＩｈＩｓｓｉＨ，ＨｉｅｄｍｉＫ，ｅａ．Ａｒｃｓｉｅｈｔｒ—ｔ１ｅｅｓｅｅｏｖｃｒｎｃｍｕａｉｎ，ｐａｔｃｏｄ，ｓｏｔｎｓｔｅｐａｔｃｒｎａｄｈｏｉｔｔｏｌｓｏｈｒｒｈｒｅｈｌｓｏｈｏｎｅｏｇｔｓｔｅｖｇｔｔｖｈｓｎｒｃ．ＰｌｎｌｌｎａｅｈｅｅａｉｅｐａｅｉｉｅａｔＣｅｌ，１９９８，１０：１１５．５１１２１ｐａ）Ｐｌｎｌｎｔ．ａｔＪ，２０００，２５：３１３９．２（）９—９［２邬亚文，于永红，胡国成，等．一个新的水稻生育期延迟Ｔ—２］ＤＮＡ插入突变体．作物学报，２０，３（）１１１１．０６２８：１１－１６［４Ｌ１］ｉＫ，Ｐｎｏ，Ｓａｓｌ，ｅ１ｄｎｉｃｔｎｏｚｉｓｎＳＲＭｔｎｅＪＷｔａ．Ｉｅｔｉｉｆｆａｏｑａｉａｉｅｒｉｏｉ（ｕｎｔｔｖｔａｔｃｔｌＱＴＬｓ）ｆｒｅｄｎｄｔａｐａｏｈａｉｇａｅｎｄｌｎｔｈｉｈｎｃｌｉａｅｉｅ（ｙａｓｔｖ）ＴｈｅｒＡｐｎｅｇｔｉｕｔｖｔｄｒｃＯｒｚａｉａＬ．．ｏｐｌＧｅ—ｅ，１９ｔ９５，９１３４３．：７—８１［３杨瑶君，汪旭东，吴先军，等．水稻显性早熟材料Ｄ６Ｂ的发２］４现、传分析和分子标记定位．遗传学报，２０，３（）９—遗０５２５：４５５００．［４Ｓｔ，Ｈａａｈ２］ａｏＹＩｙｓｉＫ．Ｔｅｅｅｉｃｎｒｌｆｈａｉｖｇｔｈｎｔｏｔｏｏｅｂｓｃｅｅａｇｃｔｔｒｈａｅｉａｌａｕｉｇｎｔｖｉｅｖｒｅｉｓｉｅｐｓｎｅｒｙｍｔｒｎａｉｅｒｃａｉｔｅ．Ｊｐｅｄ—ｎＪＢｒｅｉｇ，１８ｎ９５，３５：１０ｌ６６一６．［５林鸿宣，钱惠荣，振民，等．几个水稻品种抽穗期主效基因１］熊与微效基因的定位研究．遗传学报，１９，３３：２５２３９６２（）０—１．［６罗林广，虎渠，万建民．水稻抽穗期的遗传学研究．江苏农１］翟业学报，２０，１（）１２．０１７２：１９１６［５邓晓建，周开达，仁端，等．水稻完全显性早熟基因的发现２］李和定位．中国农业科学，０１４３：２３２９２０，３（）３—３．［７李１］平，陆朝福，周开达，．利用ＲＬ等ＦＰ标记定位水稻重要［６郭龙彪，储成才，２］钱前．水稻突变体与功能基因组学．植物农艺性状的主效基因与微效基因．中国科学：辑，１９，２Ｃ９６６（）：２７２３３５－６．学通报，２０，３３０６２：１１．［７ＸｕＹ，ＸｉｇＹＺ，ｅｇＸＹ，ｅ１２］ｅＷｎＷｎｔ．ＮａｕａｖｒｔｎｉａｔｒｌａｉｉｎａｏＧｈｄｓａｍｐｒａｔｒｇｕａｏｆｈａｉｇｄｔｎｉｌｏｔｎ７ｉｎｉｏｔｎｅｌｔｒｏｅｄｎａｅａｄｙｅｄｐｅ—ｔａｎｒｃ．Ｎａｎｔ，２０ｉ１ｉｉｅｔＧｅｅ０８，４０：７６．６１７７［８ＹａｍｏｏＴ，ＬｎＨ，Ｓｓｋ１］ｍａｔｉａａｉＴ，ｅ１ｄｎｉｃｔｎｏｅｄｔ．ＩｅｔｉｉｆｈａａｆａｏｉｇｄｔｕｎｔａｉｅｔａｔｌｃｄｎｈｒｃｅｉａｉｎｏｔｎａｅｑａｉｔｖｒｉｏｕｓＨ６ａｄｃａａｔｒｚｔ０ｆｉｓｔｅｉｔｔｃｉｅａｔｏｓｐｓａｉｎｔｒｃｉｎｗｉｈｔＨｉｉｅｓｎｄａｃｄａｋｎｒｃｕｉｇａｖｎｅｂｃ—ＹｔｒｙｍａＫｔａ．ｅｅｆｃｓｏｈｕｍ［８ｉ，ＫａｏＨ，Ｍａｕａ，ｅ１Ｔｈｆｅｔｎｔｅｃｌ２］０ｇｌｎｔｎｈｉｇｏｏｃｃａａｔｒａｓｄｂｅｄｒｉｇｅｇｈａｄｔｅｒａｒｎｍｉｈｒｃｅｓｃｕｅｙｓｍｉｗａｆｎｃｏｓｐｒｇｎ．Ｇｅｅｉｓ００，１４：８８—９．ｒｓｏｅｙｎｔｃ，２０５５８１［９ｎ，ＨａｕｈｍａＹ，Ｎａａｒ１５ＹａｏＭｒｓｉｇｍｕａＹ，ｅａ．Ｉｅｔｉａｉｎｏｔ１ｄｎｉｃｔｆｆｏｑａｔｔｔｖｒｉｏｉｏｔｏｌｇｈａｉｇｄｔｎｒｃｕｉｇａｕｎｉｉｅｔａｔｃａｌｃｎｒｌｎｅｄｎａｅｉｉｅｓｎｉｈｇ—ｅｓｔｎａｅｍａ．ＴｈｏＡｐｐｌＧｅｅｉｈｄｎｉｙｌｋｇｐｉｅｒｎｔ，１９９７，９５：１２０５ｇｎｓａｔｅｓ－ｌｃｓｉｉｅＹｐｎＪｅｅｔｈｄ１ｏｕｎｒｃ．Ｂｒｅｎ，１９ｅｄｉｇ９３，４８：２７２５６７．欢迎订阅２１００年《子植物育种》分《子植物育种》一份为转基因育种、子标记辅助育种及常规育种服务的科学杂志，是中国唯一的一份以育种为名的分是分也科学杂志。

一份新的水稻斑点叶突变体spl32的鉴定和基因定位

ＺＨＯＮＧＺｈｅｎ．Ｑｕａｎ，ＬＵＯＷｅｎ．Ｌｏｎｇ，ＬＩＵＹｏｎｇ．Ｚｈｕ，ＷＡＮＧＨｕｉ，ＣＨＥＮＺｈｉ — Ｑｉａｎｇ，ａｎｄＧＵＯＴａｏ
ＮａｔｉｏｎａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｒｅｏｆＰｌａｎｔＳｐａｃｅＢｒｅｅｄｉｎｇ／ＳｏｕｔｈＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｎｇａｚｈｏｕ５１０６４２，Ｃｈｉｎａ
Ｅ — ｍａｉｌ：ｘｂｚｗ＠ｃｈｉｎａｊｏｕｍａ１．ｎｅｔ．ｃａ
ＤｏＩ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１００６．２０１５．００８６１
一
份新的水稻斑点叶突变体ｓｐｉ３２的鉴定和基因定位
罗文龙刘永柱王慧陈志强郭涛
ｔｏｗｈｏｌｅｌｅａｆａｎｄｓｈｅａｔｈ．Ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅｓｔａｉｎｉｎｇｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｓｐｏｔｓｗａｓｎｏｔｃａｕｓｅｄｂｙｃｅｌｌｄｅａｔｈ．Ｔａｋｅｎｎｏｒｍａｌ
自然光诱导，在幼穗分化期从叶尖逐渐扩散至叶鞘，台盼蓝染色表明斑点并非由细胞死亡引起。以从Ｆ５杂合个体分

水稻突变体介绍及鉴定(很详细)汇总教材

RMD水稻突变体信息及基因型鉴定1.背景介绍：突变体对于遗传学研究有着重要作用，随着拟南芥和水稻等物种全基因组测序的开展，人类积累了前所未有的基因序列信息，为了弄清这些基因序列的生物学信息，寻找该基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法。

植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。

为配合植物功能基因组研究高通量的策略，构建水稻等物种的大型突变体库已成为必然，借助水稻全基因组测序信息、通过反向遗传学的手段大规模地筛选突变体库，理论上可以获得基因组中任一基因的突变体，最终实现阐释基因功能的目的。

2.原理：2.1农杆菌介导的T-DNA 插入农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤和毛状根的发生。

1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。

Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。

研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。

T-DNA 的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。

我们将T-DNA 区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA 转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。

大量研究表明，农杆菌T-DNA 整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA 能稳定遗传。

由于插入到植物基因组中的T-DNA 区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。

我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。

2.2 水稻Tos17 反转录转座子创造水稻突变体的另一种方法是利用植物的反转录转座子，它们是以DNA→RNA→DNA 的方式进行转座，在水稻上已发现大约40 种长未端重复的反转录转座子，它们是Tos1-Tos32，RIRE1-RIRE8，其中5 类被证明是有转座活性的，分别是Tos10、Tos17、Tos19、Tos25 和Tos27。

一个水稻生殖发育突变体的遗传分析及基因定位的开题报告

一个水稻生殖发育突变体的遗传分析及基因定位的开题报告题目：一个水稻生殖发育突变体的遗传分析及基因定位研究背景：水稻是全球重要的粮食作物之一，其生殖发育过程对其产量和品质具有重要影响。

研究水稻生殖发育的突变体对于解析其相应调控机制，提高水稻产量和品质具有重要意义。

研究目的：本研究旨在通过遗传分析和基因定位，解析一个水稻生殖发育突变体的相应调节机制，为水稻产量和品质的提高提供理论支持。

研究内容：1. 突变体的鉴定和表型分析利用突变体与野生型品种进行比较分析，观察突变体在水稻生长发育过程中的表现和性状变化。

2. 遗传分析利用突变体和野生型进行杂交，分析突变体的遗传特性和遗传方式，确定突变体的基因型。

3. 基因定位通过SNP标记和基因组测序技术，对突变体的基因位置进行定位，筛选可能的候选基因，进一步确认突变体基因。

4. 基因功能分析通过基因克隆、表达、转基因等技术，对突变体基因进行功能分析，深入探究突变体基因对水稻生殖发育的影响。

研究意义：本研究可以为水稻生殖发育的相应调控机制提供新的线索，为水稻产量和品质的提高提供理论支持。

同时，本研究也为其他植物遗传分析和基因定位研究提供参考。

研究方法：本研究主要采用突变体、野生型品种杂交、表型和基因定位等分析方法，同时结合基因克隆、表达、转基因等技术对突变体基因进行功能分析。

预期结果：本研究预计能够最终确认突变体基因，并从基因水平上解析水稻生殖发育调控机制，为水稻产量和品质提高提供理论支持。

结论：本研究有望从遗传和基因水平上揭示水稻生殖发育调控机制，为水稻产量和品质提高提供理论基础，并为其他作物遗传分析和基因定位研究提供参考。

一个水稻株高突变体的遗传分析与基因定位的开题报告

一个水稻株高突变体的遗传分析与基因定位的开题报告尊敬的指导老师：我是一名本科生，在您的指导下将进行一个有关水稻亲本遗传分析与基因定位开题报告。

我的课题研究是针对水稻株高突变体的遗传特性进行分析和研究。

以下是我的开题报告。

1. 研究背景水稻是全球最重要的农作物之一，也是许多人口众多的发展中国家主要的口粮作物。

然而，由于人口不断增长以及气候变化的影响，保持水稻产量的稳定也越来越困难。

因此，在改良和提高水稻品质和产量方面进行研究和开发是至关重要的。

株高是一个重要的农艺性状，对水稻产量和品种筛选具有重要意义。

2. 研究目的通过遗传分析和基因定位的手段，深入了解水稻株高突变体的遗传特性，以确定影响株高的相关基因、基因座和QTL，为后续的育种研究提供更多有价值的信息。

3. 研究方法首先，将突变株材料与其亲本材料进行杂交，以获得F1代。

其次，通过后代的株高测量和统计分析，确定突变株和亲本株之间的株高差异。

然后，从突变株和亲本株中各选择若干个代表性个体，进行DNA取样和测序。

根据测序结果，以突变株为参照，分别对突变株和亲本株进行SNP等位基因分型，并进行遗传分析和统计评估。

最后，采用基因定位的分子标记辅助方法，进行株高QTL的定位和分析，鉴定株高相关基因或基因座。

4. 研究意义通过对水稻株高突变体的遗传分析和基因定位，可以更全面深入地了解水稻株高形成和调控机制，对相关遗传育种研究提供更多的理论支持和实践指导。

有助于促进水稻的品种改良和产量提高，同时也有助于补充和完善相关基因组和遗传图谱的信息。

5. 研究难点和挑战水稻具有复杂基因型、多基因控制和基因与环境互作影响等特点，因此在遗传分析和QTL定位的过程中，需要克服数据量大、分析复杂、分辨率低、错误率高等难点和挑战。

以上是我初步的开题报告，请您审阅并指导，谢谢。

一份水稻花器官突变体的形态发生、性状遗传分析及相关基因的分子标记定位

一份水稻花器官突变体的形态发生、性状遗传分析及相关基因的分子标记定位水稻（Oryza sativa L.）属于单子叶植物，是发育分子生物学研究领域中常用的一种模式植物，同时也是世界上最重要的粮食作物之一，其花器官发育的结果直接影响稻谷产量和品质，因此对其花器官发育的研究有着深远的意义。

目前，由于在水稻中发现的花器官突变体很少，所以对水稻花发育的研究主要是利用双子叶植物MAS-box基因的保守序列设计引物，在水稻基因组或者cDNA文库中筛选与双子叶植物花器官发育相对应的MADS基因，因为同源异型基因的突变与花器官的变异是直接对应的关系，所以突变体的应用是当前功能基因组学的发展方向。

本文对一份从水稻双胚苗体系中自然分化出来的突变体进行了研究。

该突变体是了解水稻花发育特别是雌蕊中子房、柱头发育的良好材料。

作者进行了突变体的形态解剖研究、突变形状的遗传分析及相关基因的分子标记定位研究，获得了如下结果：1突变体形态结构特征：突变体的生殖发育受到明显的影响，主要表现在抽穗过程缓慢，有的甚至整个生殖周期内都无法抽出。

枝梗分枝稀疏，次级枝梗与主梗之间的角度明显，顶端有不同程度的卷曲，整个穗部由下至上着生小花的数目逐渐减少。

突变体花器官变异程度不一，内稃退化和外稃严重弯曲使得二者无法闭合，颖花内部结构外露，突变体颖花的浆片同源转化为类内稃的结构；雄蕊部分或全部转化为雌蕊，不完全转化雄蕊通常下部为类心皮组织上部则是类柱头的羽毛状结构。

颖花通常只含有一个发育完全的雌蕊结构，而同源异型转化的雌蕊发育是不完全的，不能形成完整的胚囊结构，通过调查证明该突变体不能结实。

2突变体形状的遗传分析：用突变体做父本，分别以93-11、蜀恢527、日本晴为母本配制杂交组合进行遗传分析。

所有杂交组合F1代株系均表现正常亲本的表性。

根据F2代表型及x2测验表明，正常植株与突变体的比例符合一对基因控制的分离比3：1，说明该突变性状是受一对隐性基因控制。

水稻突变体介绍及鉴定(很详细)

植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。

2.原理：2.1农杆菌介导的T-DNA 插入农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤和毛状根的发生。

1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。

Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。

研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。

T-DNA 的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。

我们将T-DNA 区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA 转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。

大量研究表明，农杆菌T-DNA 整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA 能稳定遗传。

由于插入到植物基因组中的T-DNA 区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。

我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。

水稻叶色突变体基因定位研究进展

低。近年来，有关叶色自然突变体的研究常有报道，张毅等ｌ１叩从籼稻Ｇ４６Ｂ与意大利粳稻Ｓｉｒｉｏ杂
交后代中发现了白化转绿突变体ｇｒａ。刘胜等 “ ］
从粳稻品种Ａｓｏｍｉｎｏｒｉ组培后代中获得一个稳定
人工诱变是指新种质创造的主要手段，主要
胞质基因调控的叶色突变体报道相对较少｛－。。
２．２叶色基因定位和克隆进展
是通过物理因素和化学因素诱导生物体遗传性状发生变异，其中物理诱变因素包括离子流、电子束以及粒子射线等；化学诱变由于所使用诱变剂的不同分为多种，目前应用较多且效果较好的化学
注：数据来源于ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ。
Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅｄａｔａｓｃｏｍｅｆｒｏｍｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｍｅｎｅ．ｏｒｇ
１３６
９期
冯章丽：水稻叶色突变体基因定位研究进展
遗传的黄绿相问叶色突变体（Ｚｅｂｒａｌｅａｆ，ｚ１２）。
李个
细胞质基因控制。对叶色突变体进行遗传分析，通常是利用突变体与野生型进行杂交（正交和反交），并对杂交后代的Ｆ和Ｆ表型进行鉴定，从而

水稻卷叶突变体rl76的表型和组织分析及基因定位

水稻卷叶突变体rl76的表型和组织分析及基因定位目录一、内容综述 (2)1. 研究背景及意义 (3)2. 研究目的和任务 (4)二、水稻卷叶突变体rl76的表型分析 (4)1. 突变体的形态特征 (5)1.1 叶片形态变化 (6)1.2 植株整体形态变化 (7)2. 突变体的生物学特性 (8)2.1 生长周期变化 (10)2.2 生物量变化 (11)三、水稻卷叶突变体rl76的组织分析 (12)1. 组织结构观察 (13)1.1 叶片结构变化 (14)1.2 茎秆及根系结构变化 (15)2. 组织化学分析 (16)2.1 生化成分分析 (17)2.2 细胞壁组分变化 (18)四、水稻卷叶突变体rl76的基因定位 (19)1. 遗传背景分析 (20)1.1 遗传图谱构建 (21)1.2 遗传标记选择及定位群体构建 (22)2. 基因定位方法与技术 (23)2.1 基于分子标记的基因定位技术 (24)2.2 基于高通量测序的基因定位方法 (24)五、基因定位结果及功能分析 (26)一、内容综述水稻卷叶突变体rl76作为一种重要的农艺性状变异，在植物生物学、遗传学和分子生物学领域引起了广泛关注。

该突变体的研究不仅有助于深入了解水稻叶片发育的分子机制，而且对于作物遗传改良和抗逆性育种具有潜在的应用价值。

本文将对水稻卷叶突变体rl76的表型特征、组织结构变化以及基因定位进行综述。

在表型特征方面，rl76突变体在水稻叶片发育过程中表现出明显的卷叶现象。

这种卷叶表型可能表现为叶片弯曲、扭曲或翻滚，与正常叶片相比，突变体叶片的形态和生长方向发生显著改变。

rl76突变体可能还伴有其他相关表型变化，如株高、穗形、粒型等，这些表型变化可能与卷叶表型存在某种程度的关联。

在组织结构分析方面，rl76突变体的叶片结构与正常叶片相比存在显著差异。

通过显微观察，可以发现突变体叶片的细胞形态、排列以及组织结构发生变化。

细胞大小、形状、排列方式以及叶绿体的发育可能受到影响，这些变化可能与卷叶表型直接相关。

一个水稻多柱头突变体的形态特征和遗传定位的开题报告

一个水稻多柱头突变体的形态特征和遗传定位的开题报告
一、研究背景
水稻是世界上最重要的粮食作物之一。

多柱头突变体是指某些水稻个体植株出现2个或2个以上的花柱，这种突变体与普通单一花柱的水稻相比具有诸如花器结构、
花粉中心粒形态等明显差异，是水稻生殖生物学研究的重要材料之一。

二、研究目的
本研究旨在通过对一个多柱头突变体进行形态特征分析和遗传定位，探究多柱头突变体的成因以及对水稻生殖发育的影响。

三、研究内容
1.分析多柱头突变体的形态特征：包括成株高度、叶片形态、花器结构、花粉中心粒形态等方面的观测和测量；
2.遗传定位：通过建立多柱头突变体与野生型的遗传图谱，利用分子标记技术进行连锁分析，确定其在水稻染色体上的位置；
3.确定多柱头突变体的成因：结合形态特征和遗传定位结果，探讨多柱头突变体的成因和遗传机制。

四、研究意义和预期结果
通过本研究可以加深对水稻生殖发育的理解，为育种提供新的思路和途径。

同时，研究多柱头突变体的成因和遗传机制，有助于揭示多柱头性状的形成和遗传规律，为
其他作物多柱头性状的研究提供参考。

预期结果：1.对多柱头突变体的形态特征会做出详细的描述和解释；2.通过遗传
定位，确定多柱头突变位点在水稻染色体上的位置；3.探讨多柱头突变体的成因和遗
传机制，为相关研究提供参考和借鉴。

一个水稻内颖退化突变体的形态特征及基因的精确定位_百度概要

HEREDI T AS (Be i j i n g 2012年 8月, 34(8: 1064― 1072ISSN 0253-9772 研究报告收稿日期: 2012−05−11; 修回日期: 2012−05−20基金项目 :福建省自然科学基金项目 (编号:2011J01110, 福建省农业科学院青年人才创新基金项目 (编号:2010QJ-A4 , 福建省农业科学院科技创新团队建设重点科研项目 (编号:CXTD2011-12 资助作者简介 :杨德卫 , 硕士 , 助理研究员 , 研究方向:水稻遗传育种。

E-mail: dewei-y@通讯作者 :叶新福 , 博士 , 研究员 , 研究方向:水稻遗传育种。

E-mail:yexinfu@网络出版时间 : 2012-7-16 10:34:50URL: /kcms/detail/11.1913.R.20120716.1034.003.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1005.2012.01064一个水稻内颖退化突变体的形态特征及基因的精确定位杨德卫 , 卢礼斌 , 程朝平 , 曾美娟 , 郑向华 , 叶宁 , 刘成德 , 叶新福福建省农业科学院水稻研究所 , 福州 350018摘要: 水稻产量和品质受花器官发育的直接影响 , 因此对水稻颖花发育机理的研究将有助于水稻产量提高和品质的改良。

文章利用60Co γ射线辐照亲本 8PW33 (籼稻背景获得一个性状能稳定遗传的内颖退化突变体 (编号:MU102, 并对其农艺性状和花器官进行了观察和分析。

结果显示 , 相对于野生型 , 该突变体的株高、每穗总粒数及剑叶宽均显著增加 , 而结实率则显著降低 , 差异均达显著水平。

解剖镜下观察表明 , 该突变体内颖退化 , 外颖弯曲呈现镰刀状 , 其余器官与野生型表型基本一致。

扫描电镜观察显示 , 突变体与野生型叶片维管束的结构组成以及外颖表皮细胞组成、排列均正常 , 没有明显差异 ; 与野生型相比 ,突变体内颖表皮细胞排列较为紧密 , 推测可能是内颖收缩退化导致的。

水稻花器官数目突变体mf2的鉴定和基因定位

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2018, 44(2): 169-176/ISSN 0496-3490; CN 11-1809/S; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@本研究由国家重点研发计划项目(2016YFD0102102), 国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-01-12)和广东省应用型研发项目(2015B020231011)资助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0102102), the China Agricultural Research System (CARS-01-12), and the Applied Research and Development Funds in Guangdong (2015B020231011).*通信作者(Corresponding authors): 陈志强, E-mail: zqchen@, Tel: 020-********; 郭涛, E-mail: guo.tao@, Tel: 020-**********同等贡献(Contributed equally to this work)第一作者联系方式: 严贤诚, E-mail: 186********@; 陈立凯, E-mail: leeking1113@Received(收稿日期): 2017-05-27; Accepted(接受日期): 2017-09-10; Published online(网络出版日期): 2017-10-27. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20171027.1727.002.htmlDOI: 10.3724/SP.J.1006.2018.00169水稻花器官数目突变体mf2的鉴定和基因定位严贤诚** 陈立凯** 罗玉花罗文龙王慧郭涛* 陈志强*华南农业大学国家植物航天育种工程技术研究中心, 广东广州 510642摘要: 水稻的花器官发育影响着水稻的产量与品质。

一个新的水稻D1基因等位突变体的遗传鉴定与基因功能分析

作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2016, 42(9): 1261 1272/ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@ DOI: 10.3724/SP.J.1006.2016.01261一个新的水稻D1基因等位突变体的遗传鉴定与基因功能分析王翠红马建王帅田鹏岂长燕赵志超王久林王洁程治军张欣郭秀平雷财林*中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081摘要: 株高是影响水稻产量的一个重要性状。

本研究从水稻稻瘟病普感品种丽江新团黑谷(LTH)经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变群体中分离出一个遗传稳定的小粒矮化突变体LTH-m3。

该突变体是赤霉素(GA)和油菜素内酯(BR)相关突变体, 它对外源GA (GA3)不敏感, 对外源BR (eBL)的敏感性较野生型显著降低。

遗传分析、基因克隆和转基因互补实验确认, 该突变体是一个新的d1基因等位突变体, 其D1基因在第6个外显子与内含子接合处发生单碱基突变(G2522 →A2522), 导致第6外显子被选择性剪切及Gα蛋白翻译提前终止, 从而造成LTH-m3小粒矮化突变表型。

进一步的研究表明, 该突变体D1基因突变引起SD1和SLR1等基因表达的显著改变, 因而影响植株细胞内GA和BR反馈调节功能和信号传递。

突变体LTH-m3弥补了LTH植株过高、茎秆软和极易倒伏等缺陷, 可作为LTH的改良系在今后水稻稻瘟病研究中加以利用, 其功能突变基因的鉴定为深入研究水稻Gα蛋白的功能及激素信号途径提供了新的材料。

关键词:水稻; 突变体; 矮秆基因; 基因克隆; 基因功能Genetic Identification of a New D1-allelic Mutant and Analysis of Its Gene Function in RiceWANG Cui-Hong, MA Jian, WANG Shuai, TIAN Peng, QI Chang-Yan, ZHAO Zhi-Chao, WANG Jiu-Lin, WANG Jie, CHENG Zhi-Jun, ZHANG Xin, GUO Xiu-Ping, and LEI Cai-Lin*National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, ChinaAbstract: Plant height is one of important traits for rice yield. One genetically stable rice mutant, LTH-m3, was isolated from the cv. Lijiangxintuanheigu (LTH)-derived mutant population by mutagenesis using ethylmethane sulfonate (EMS). LTH-m3 was involved in the pathways of gibberellic acid (GA) and brassinosteroid (BR), and showed no sensitiveness to exogenous GA (GA3) and significantly reduced sensitiveness to exogenous BR (eBL) compared with the wild type. The genetic analysis, gene cloning and transgenic complementary test confirmed that LTH-m3 was a new d1-allelic mutant with small grain and dwarf phenotypes, and a single base was mutated (G2522→A2522) in the functional dwarf gene D1 at the conjunction site of its sixth exon and intron, which caused excision of the sixth exon in mRNA and premature termination of the D1 encoded Gα protein, resulting in mutated phenotypes in the mutant. The further study showed that the D1 mutation caused obvious expression change of some dwarf genes such as SD1 and SLR1 in the mutant, and could affect the GA and BR pathways in their feedback regulations and signaling trans-ductions in plant cells. The mutant overcome the defects of the universally blast-susceptible cv. LTH, such as too tall plant, soft stem and easy lodging, and could be utilized as an improved substitute of LTH in the future rice blast researches. The mutated D1 gene identified from the LTH-m3 mutant may be useful for further study of Gα functions and signaling pathways of GA and BR. Keywords: Rice; Mutant; Dwarf gene; Gene cloning; Gene function本研究由国家公益性行业(农业)科研专项经费(201203014)和中国农业科学院科技创新团队项目“作物功能基因组”资助。

水稻突变体介绍及鉴定（很详细）汇总教材

水稻突变体介绍及鉴定（很详细）汇总教材RMD水稻突变体信息及基因型鉴定1.背景介绍：突变体对于遗传学研究有着重要作用，随着拟南芥和水稻等物种全基因组测序的开展，人类积累了前所未有的基因序列信息，为了弄清这些基因序列的生物学信息，寻找该基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法。

植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。

2.原理：2.1农杆菌介导的T-DNA 插入农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤和毛状根的发生。

1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。

Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。

研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，分别称为左边界（LB）和右边界（RB）。

T-DNA 的转移只与边界序列相关，尤其是RB，而与T-DNA区段的其它基因或序列无关。

我们将T-DNA 区段上的致瘤基因和其它无关序列去掉，利用其转移的特性，实现农杆菌介导的T-DNA 转入水稻愈伤，从而构建水稻突变体库。

大量研究表明，农杆菌T-DNA 整合到植物基因组中的位置是随机的，并且整合到植物基因组中的T-DNA 能稳定遗传。

由于插入到植物基因组中的T-DNA 区段序列已知，这样随机插入到植物基因组中的T-DNA 类似于给植物基因“贴”了一个序列标签。

我们利用这个标签，通过各类PCR技术最终可以获取其插入的位点。

一个新的水稻黄绿叶突变体的遗传分析与基因定位

1 材料与方法
1.1 供试材料和田间试验 10079 是来自粳稻品种日本晴(Nipponbare)的一个迟
熟突变品系, 由中科院遗传与发育生物学研究所储成才研究员和方军博士提供。用化学诱变剂 EMS 处理 10079 获得一份黄绿叶突变体, 经多代自交, 其黄绿叶性状已稳定遗传, 暂定名为“D83”。将 D83 分别与正常绿色的野生型亲本 10079 及籼稻品种浙福 802、9311 等杂交, 在四川成都分别播种亲本、F1 及 F2 代, 从苗期开始观察叶色表现, 成熟期调查主要农艺性状。 1.2 光合色素含量的测定
叶绿素缺乏突变基因的定位、克隆以及作用机理等方面的研究具有重要的理论意义和应用价值。
水稻的叶绿素缺乏突变一般受隐性核基因控制, 而由显性基因或细胞质基因控制的报道相对较少 [10-11] 。水稻叶绿素缺乏突变类型丰富, 除第 12 染色体外, 在其他染色体上均发现了叶绿素缺乏突变基因 (/newsletters/rice-genetics/rgn12/v12p93.html) 。目前, 利用分子标记定位了 10 多个水稻叶绿素缺乏突变基因, 其中 6 个已被克隆, 它们参与叶绿素的生物合成[7,12-14]。
根据叶色调查与分析结果, 从 D83/浙福 802 的 F2 代
中选取 30 株显性正常绿苗和 158 株黄化苗构成定位群体, 分单株取叶片提取总 DNA。在此基础上随机选取正常绿苗和黄化苗各 10 株, 每单株取等量叶片, 将正常绿苗和黄化苗单株叶片分别混合, 提取总 DNA 作为绿苗和黄化苗近等基因池。参照 McCouch 等[16]的方法提取总 DNA。 1.4 分子标记分析和遗传图谱的构建

水稻类病斑突变体wy3的鉴定和基因定位

水稻类病斑突变体w y３的鉴定和基因定位张宏根＃㊀王茂宇＃㊀张丽佳㊀胡雅㊀马佳琦㊀张翼帆㊀汤述翥∗㊀梁国华㊀顾铭洪(扬州大学江苏省作物遗传生理重点实验室/教育部植物功能基因组学重点实验室,江苏扬州２２５００９;＃共同第一作者;∗通讯联系人,E Ｇm a i l :s z t a n g＠y z u ．e d u ．c n )C h a r a c t e r i z a t i o na n dG e n eM a p p i n g o fL e s i o n M i m i cM u t a n t w y３i nR i c e Z H A N G H o n g ＧG e n ＃,W A N G M a o Ｇy u ＃,Z H A N G L i Ｇj i a ,H U Y a ,M A J i a Ｇqi ,Z H A N G Y i Ｇf a n ,T A N G S h u Ｇz h u ∗,L I A N G G u o Ｇh u a ,G U M i n g Ｇh o n g(K e y L a b o r a t o r y o f C r o p G e n e t i c s a n dP h y s i o l o g y o f J i a n g s uP r o v i n c e /K e y L a b o r a t o r y o f P l a n t F u n c t i o n a l G e n o m i c s ,M i n i s t r y o fE d u c a t i o n ,Y a n g z h o u U n i v e r s i t y ,Y a n g z h o u ２２５００９,C h i n a ;＃T h e s ea u t h o r sc o n t r i b u t e d e q u a l l y tot h i s w o r k ;∗C o r r e s p o n d i n ga u t h o r ,E Ｇm a i l :s z t a n g ＠yz u ．e d u ．c n )Z HA N G H o n g g e n ,WA N G M a o y u ,Z HA N G L i j i a ,e t a l ．C h a r a c t e r i z a t i o na n d g e n e m a p p i n g of l e s i o n m i m i cm u t a n t w y３i n r i c e ．C h i n JR i c eS c i ,２０１６,３０(３):２３９Ｇ２４６．A b s t r a c t :Al e s i o n m i m i c m u t a n t w y ３w a so b t a i n e df r o mt h e p r o g e n y o fa j a po n i c a v a r i e t y W u y u j i n g ３b y n a t u r a l m u t a t i o n ．T h e l e s i o n sw e r e f i r s t o b s e r v e do n t h e l e a v e s a t t h e s e e d l i n g s t a g e ,t h e n s p r e a d g r a d u a l l yt o t h ew h o l e l e a f a t t h e i n i t i a l t i l l e r i n g s t a g e ．C o m p a r e dw i t h t h ew i l d t y p e (WT ),t h e p l a n th e i g h t ,t h en u m b e r o f e f f e c t i v e t i l l e r ,pa n i c l e l e n g t h ,g r a i nn u mb e r p e r p a n ic l ea n ds e e ds e t t i n g r a t eo f w y３w e r e r e d u c e ds i g n i f i c a n t l y ．T h es h a d i n g a s s a y s h o w e d t h a t t h e l e s i o n so nl e a v e so f w y３w e r e i n d u c e db y n a t u r a l l i g h t ．C o m p a r e d w i t ht h e w i l dt y p e ,t h e p h o t o s y n t h e t i c p i g m e n t a n d t h en e t p h o t o s y n t h e t i c r a t e o f w y３w e r e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d ,b u t t h eS O Da c t i v i t y ,P O Da c t i v i t y ,C A T a c t i v i t y a n dM D Ac o n t e n t o f w y ３w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e o fWT．T r y p a n b l u e s t a i n i n g e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t t h e r ew e r e a l a r g e n u m b e r o f d e a d c e l l s i n t h em u t a n t l e s i o n ．G e n e t i c a n a l y s i s s u g g e s t e d t h a t t h e p h e n o t y p e o f w y３w a s c o n t r o l l e db y a s i n g l e r e c e s s i v e n u c l e a r l o c u s ,a n d t h e t a r g e t g e n ew a sm a p pe db e t w e e nm a r k e r sW ２Ｇ１７a n dW ２Ｇ１８w i t h t h e p h y s i c a l d i s t a n c e of ２８k bo n c h r o m o s o m e ２．S e q u e n c ea n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h em u t a t e dg e n e i n w y３h a da s i n g l en u c l e o t i d e d e l e t i o na t t h e ３７５t h i nC D So f L O C _O s ０２g ０２０００,r e s u l t i n gi n a p r e m a t u r e t e r m i n a t i o n o f t r a n s l a t i o n o f t h e t a r ge t g e n e ,w h i c h i s a nn e wa l l e l e of O s HP L ３．K e y w o r d s :r i c e ;l e s i o nm i m i cm u t a n t ;g e n em a p p i n g 张宏根,王茂宇,张丽佳,等．水稻类病斑突变体w y３的鉴定和基因定位．中国水稻科学,２０１６,３０(３):２３９Ｇ２４６．摘㊀要:在粳稻品种武育粳３号栽培群体中获得一个类病斑突变体w y ３.该突变体类病斑出现于苗期,分蘖期扩散至整张叶片,属于扩散型类病斑突变体.相比野生型,突变体w y ３的株高明显降低,有效分蘖数减少,穗长㊁每穗粒数㊁结实率均显著降低.遮光处理表明,突变体w y ３类病斑的产生受自然光诱导.台盼蓝染色结果表明,类病斑部位有大量的死亡细胞.突变体w y３的光合色素含量和净光合速率较野生型显著降低,S O D ㊁P O D ㊁C A T 活性和M D A 含量均显著高于野生型.遗传分析表明突变体表型受单隐性核基因控制,采用B S A 将该基因初步定位在第２染色体短臂端粒附近.采用F ２群体中１０９９株类病斑单株将基因定位在标记W ２Ｇ１７和W ２Ｇ１８之间２８k b 的物理距离内.测序结果表明,突变体w y３中的L O C _O s ０２g０２０００编码区(C D S )第３７５位碱基C 缺失,导致翻译提前终止,突变体中该候选基因为O s H P L ３的一个新等位基因.关键词:水稻;类病斑突变体;基因定位中图分类号:Q ３４３５;Q ７５４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀文章编号:１００１Ｇ７２１６(２０１６)０３Ｇ０２３９Ｇ０８㊀㊀植物斑点叶(s po t t e d l e a f )突变体是指植物在没有遭受病原物侵染或明显逆境条件下在叶片或叶鞘上自发形成斑点的一类突变体,由于这些斑点与病原物侵染后产生的病斑非常相似,又被称为类病变突变体(l e s i o ns i m u l a t i n g di s e a s e m u t a n t ,l s d )或类病斑突变体(l e s i o n m i m i cm u t a n t ,l m m )[１].类病斑突变体广泛存在于水稻㊁拟南芥㊁玉米㊁大麦和大豆等植物中[２Ｇ７].根据突变体的表型,类病斑突收稿日期:２０１５Ｇ１１Ｇ３０;修改稿收到日期:２０１５Ｇ１２Ｇ２４.基金项目:国家自然科学基金资助项目(３１０７１３８４,３１０００５３３);江苏省科技支撑计划资助项目(B E ２０１３３０１);江苏高校优势学科建设工程资助项目.９３２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i ),２０１６,３０(３):２３９－２４６h t t p ://w w w．r i c e s c i ．c n D O I :１０．１６８１９/j．１００１Ｇ７２１６．２０１６．５１７６变体可分为起始型和扩散型[８Ｇ１０],起始型突变体的病斑有相对稳定的分布位置和大小,而扩散型突变体的病斑形成以后会很快扩散到叶片的其他部位,甚至包括叶鞘和茎秆.已有研究表明,植物类病斑的发生主要与过敏性反应(h y p e r s e n s i t i v er eＧs p o n s e,H R)导致的细胞程序性死亡以及细胞死亡途径中自由基非正常产生有关[１１Ｇ１３].此外,许多类病斑突变体对某些植物病原物表现出了一定的抗性[１４Ｇ１６],能激发病程相关蛋白的表达[１７Ｇ１８],可以提高植株的持久㊁广谱抗病性.因此,这类突变体对植物过敏反应激活机制和植物抗病反应机制的研究具有重要意义.目前,水稻中已经发现了８０多个类病斑突变[１９].其中,绝大部分呈单隐性核基因遗传规律,也有部分表现为双隐性核基因或显性核基因遗传规律.在这些类病斑基因中,s p l５[２０]㊁s p l７[２１]㊁s p l１１[２２]㊁s p l１８[２３]㊁s p l２８[１６]㊁T t m l[２４]等１８个基因已被克隆,这些基因编码许多不同类型的蛋白,如第一个被克隆的水稻类病变突变基因s p l７编码一个热激转录因子蛋白(h e a t s t r e s s t r a n s c r i p t i o n f a c t o r p r o t e i n,H S F)[２１],s p l１１编码一个UＧb o x/A r m aＧd i l l o重复蛋白[２２],s p l１８编码一个酰基转移酶[２３].类病斑基因的克隆与功能研究表明类病变过程非常复杂,这些基因的作用机制以及性状表现各不相同,涉及到许多生化代谢过程,但突变体性状大多与细胞程序性死亡相关[２２].本课题组在粳稻品种武育粳３号栽培群体中获得一个稳定遗传的类病斑突变体w y３,该类病斑突变是自然诱变产生.本研究中以w y３为材料,描述了该突变体的形态特征㊁生理学特性,并对该突变基因进行了精细定位与克隆,以期为该基因的功能研究及应用提供理论依据.１㊀材料与方法１．１㊀实验材料２０１３年扬州正季,在粳稻品种武育粳３号栽培群体中获得一个类病斑突变体w y３,经过多代连续种植,突变体类病斑表型稳定遗传.２０１４年正季扬州,以籼稻品种K a s a l a t h为父本与w y３杂交获得F１,２０１４年冬季在海南种植F１及相关亲本,成熟期收获F１植株自交种子.２０１５年正季,种植突变体w y３㊁野生型武育粳３号及组合w y３/K a s a l a t hF２群体.１．２㊀表型鉴定２０１５年正季,将突变体w y３和对照武育粳３号种植于扬州大学农学院实验基地,小区种植,３次重复,管理与一般大田相同.全生育期观察田间突变体的表型,包括突变体斑点出现的时期㊁颜色及分布情况等.成熟后随机从小区中央选取１０株考查株高㊁单株穗重㊁每株有效穗数㊁每穗粒数㊁每穗实粒数㊁结实率和千粒重等性状.１．３㊀光照处理实验通过遮光试验了解光照对斑点发生的影响.大田条件下,在苗期用宽度约为１c m的锡箔纸对突变体w y３叶片已有斑点和无斑点部位进行遮光处理,各重复３次.分别观察遮光１５d及恢复光照７d后斑点的发生及变化情况,并拍照.１．４㊀突变体死亡细胞鉴定苗期,分别取野生型正常叶片与突变体w y３发生类病斑的叶片,剪成１c mˑ１c m大小.加入台盼蓝染液(染液配方参照Y i n等[２５]的方法),真空抽滤使染液进入细胞间隙,沸水蒸沸５~８m i n.室温下静置６~８h后用２．５g/m L的水合氯醛溶液脱色,直到组织完全透明为止.脱色好的叶片在体视显微镜下观察㊁拍照.１．５㊀叶绿素含量测定分蘖期,分别取野生型正常叶片与突变体w y３发生类病斑的叶片,按L i c h t e n t h a l e r等[２６]修正的A r n o n法进行叶绿素和类胡萝卜素含量测定,具体操作如下:将鲜叶去掉叶脉,截取叶片中段(叶片最宽处),擦净组织表面污物,并吸干叶片表面附着水;准确剪成２mm条状并称取０．２g鲜样３份,分别置于３个２０m L带盖的玻璃管中;吸取１０m L提取液(９６％乙醇)置于玻璃管中,密封并置于３０ħ~５０ħ水浴锅中萃取３h,此过程中需轻摇几次.当叶片完全变白时即可比色.比色时,以提取液为空白,在波长６６３n m㊁６４６n m和４７０n m下测定吸光度.每样重复测定２次.１．６㊀光合作用相关指标的鉴定始穗期,使用L iＧ６４００型便携式光合测定仪于晴天上午９:００－１１:００分别测定w y３及其野生型剑叶叶片的净光合速率(n e t p h o t o s y n t h e t i c,P n)㊁气孔导度(l e a f c o n d u c t a n c e,G s)㊁蒸腾速率(t r a nＧs p i r a t i o nr a t e,T r)和胞间C O２浓度(i n t e r c e l l u l a r C O２c o n c e n t r a t i o n,C i),各测定３片具有代表性的剑叶.光合测定仪使用红蓝光源,光强恒定为１２０００４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第３０卷第３期(２０１６年５月)μm o l/(m２ s),温度为３０ħ,C O２浓度为空气中的浓度,湿度为大气中的湿度.取３次重复的平均值进行分析.１．７㊀抗氧化酶活性测定分蘖期,测定突变体w y３和对照相同部位叶片中超氧化物歧化酶(s u p e r o x i d ed i s m u t a s e,S O D)㊁过氧化物酶(p e r o x i d a s e,P O D)㊁过氧化氢酶(c a t aＧl a s e,C A T)活性和丙二醛(m a l o n a l d e h y d e,M D A)的含量.所有测定重复３次,取平均值进行分析. S O D活性采用S O D测试盒(南京建成生物工程研究所生产)测定,该试剂盒采用黄嘌呤氧化酶法; P O D活性采用愈创木酚法[２７]测定,以每１m i n内O D４７０变化０．０１为一个过氧化物酶活性单位(U);C A T活性采用高锰酸钾滴定法测定;MD A含量采用硫代巴比妥酸(t h i o b a r b i t u r i ca c i d,T B A)法测定.１．８㊀图谱构建与数据分析采用隐性分离群体进行遗传分析和基因定位.在F２群体中,根据分子标记检测的结果,具有w y３突变亲本带型的个体赋值１,具有K a s a l a t h带型的个体赋值３,具有双亲带型(杂合带)的个体赋值２,利用M a p M a k e r３．０作图软件进行基因位点与标记间连锁分析,用K o s a m b i函数将重组率转化为遗传距离(c e n t i M o r g a n,c M).其他数据在E x c e l２０１３中处理.１．９㊀候选基因分析根据基因精细定位结果,查阅在水稻基因组注释数据库(R i c eG e n o m eA n n o t a t i o nP r o j e c t)中相应区间内的所有开放阅读框(O R F),并分析可能的候选基因.根据候选基因全长基因组D N A序列,设计测序引物,分别对野生型和突变体的基因组进行扩增并测序.测序结果用C o n t i g E x p r e s s软件拼接完整再通过D N A S T A R软件进行比对,确定突变位点.２㊀结果与分析２．１㊀突变体表型鉴定在大田自然条件下,突变体w y３从苗期开始叶片表面出现类病斑,分蘖期比较明显.叶片上斑点出现的位置并无特殊规律,但最终都会扩散到整张叶片,表现为扩散型突变体.考查突变体与野生型的农艺性状,突变体的长势较差,株高㊁穗长㊁每穗粒数㊁结实率等农艺性状也显著低于对照(表１,图１).造成突变体株高等性状显著降低的原因可能是由于突变叶片过早枯死,光合作用能力减退.２．２㊀光照对突变体的影响对突变体w y３只出现少量类病斑的叶片未产生类病斑部位用锡箔纸遮光１５d后发现,整张叶片A－苗期植株表型;B－分蘖初期野生型(左)和突变体w y３(右)植株表型;C－成熟期野生型(左)和突变体w y３(右)植株表型;D－野生型(左)和突变体w y３(右)穗部表型;E－分蘖期野生型(左)和突变体w y３(右)叶片表型.A,P h e n o t y p e s o f w y３d u r i n g s e e d l i n g s t a g e;B,P h e n o t y p e s o fWT(l e f t)a n d w y３(r i g h t)d u r i n g t h e e a r l y t i l l e r i n g s t a g e;C,P h e n o t y p e s o f WT(l e f t)a n d w y３(r i g h t)d u r i n g t h em a t u r e s t a g e;D,P a n i c l e t r a i t s o fWT(l e f t)a n d w y３(r i g h t);E,L e a v e s o fWT(l e f t)a n d w y３(r i g h t) d u r i n g t h e e a r l y t i l l e r i n g s t a g e．图１㊀突变体w y３及其野生型表型F i g．１．P h e n o t y p e s o f w y３a n dw i l d t y p e(W T)．１４２张宏根等:水稻类病斑突变体w y３的鉴定和基因定位表１㊀突变体和野生型的农艺与产量性状T a b l e １．P e r f o r m a n c e o f a g r o n o m i c a n d y i e l d t r a i t s o f t h em u t a n t w y ３a n d t h ew i l d t y pe (W T )．材料M a t e r i a l株高P l a n t h e i g h t /c m分蘖数N o ．o ft i l l e r s 穗长P a n i c l e l e n g t h /c m结实率S e e d Ｇs e t t i n g r a t e/％每穗粒数G r a i nn u m b e r pe r p a n i c l e 粒长G r a i n l e n g t h /mm粒宽G r a i nw i d t h /mm千粒重１０００Ｇg r a i n w e i g h t /gw y３５６．９ʃ０．６∗∗３．５ʃ０．６∗∗１４．８ʃ１．２∗∗７９．０ʃ０．１∗∗８９．６ʃ６．８∗∗７．５ʃ２．２３．４ʃ１．４２６．５４ʃ０．５６WT８７．５ʃ０．５１０．０ʃ１．７１６．６ʃ０．８９８．３ʃ０．１１２３．６ʃ１１．０７．３ʃ２．８３．３ʃ０．９２６．８５ʃ０．６２㊀㊀∗∗表示在０．０１水平差异显著.下同.∗∗d e n o t e s i gn i f i c a n t d i f f e r e n c e a t ０．０１l e v e l ．T h e s a m e a s b e l o w．表２㊀突变体w y３和野生型叶片光合色素含量T a b l e ２．P i g m e n t c o n t e n t s i n l e a v e s o f w y ３a n dw i l d t y pe (W T )．材料M a t e r i a l叶绿素a 含量C h l o r o p h yl l a c o n t e n t /(m gg －１)叶绿素b 含量C h l o r o p h yl l b c o n t e n t /(m gg －１)叶绿素a /bC h l o r o p h y l l a /b 类胡萝卜素含量C a r o t e n o i d c o n t e n t /(m gg －１)w y３１．２８ʃ０．０９∗∗０．２７ʃ０．１１∗∗４．６８ʃ０．１３∗∗０．１５ʃ０．１１∗∗WT２．２８ʃ０．０３０．９９ʃ０．０８２．３１ʃ０．０７０．５９ʃ０．０４A－遮光前w y ３;B －未发生斑点部位遮光１５d 后;C －遮光部位恢复光照７d 后;D －野生型.A ,L e a f o f w y ３b e f o r e s h a d i n g ;B ,L e a fw i t h o u t l e s i o n a f t e r s h a d i n g f o r １５d a y s ;C ,L e a f s h a d e d f o r ７d a y s t h e nu n d e r n o r m a l l i g h t f o r ７d a y s ;D ,W i l d t y pe ．图２㊀遮光对突变体w y３叶片的影响F i g ．２．E f f e c t s o f s h a d i n g on w y ３l e a v e s ．其他部位都产生类病斑,但是遮光部位没有产生类病斑;恢复光照,跟踪观察原遮光部位变化,一周后,原本没有类病斑的遮光处产生了明显的类病斑(图２).该结果表明,类病斑的发生受自然光照的诱导,适当的遮光可以阻止或者减轻类病斑的发生或者扩散.２．３㊀叶绿素含量变化分蘖期,通过对突变体和野生型叶片叶绿素含量的测定结果可以看出,突变体的叶绿素a ㊁叶绿素b 和类胡萝卜素含量均显著低于野生型,但叶绿素a /b 比值显著高于其野生型,说明突变体w y ３是一个叶绿素缺陷突变体(表２).２．４㊀突变对光合作用的影响始穗期,测定突变体w y ３和野生型剑叶的光合参数,包括净光合速率(P n )㊁气孔导度(G s )㊁蒸腾速率(T r )和胞间C O ２浓度(C i ).由于在该时期突变体叶片类病斑明显,突变体w y３所测得的P n ㊁G s ㊁T r 和C i ４个参数均显著低于野生型(表３),说明类病斑的发生导致突变体光合能力的降低.２．５㊀突变体叶片细胞死亡鉴定利用台盼蓝染色方法对突变体及野生型叶片中死亡细胞进行检测.经台盼蓝染色后,野生型叶片整体呈淡蓝色,没有深蓝色染色,说明野生型叶片基本上没有细胞死亡.与野生型叶片不同的是,突变体类病斑发生处对应着严重的深蓝色小点,说明斑点部位有大量的死亡细胞,而在大块深蓝色染色间隙也出现了深蓝色的小点,说明类病斑正在扩散中(图３).２．６㊀抗氧化酶活性的变化㊀㊀植物细胞程序性死亡时常产生活性氧的沉积,２４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i )㊀第３０卷第３期(２０１６年５月)表３㊀突变体w y３和野生型武育粳３号分蘖期叶片光合特性T a b l e ３．P h o t o s y n t h e t i c p a r a m e t e r s o f w y ３a n dw i l d t y p e (W T )a t t h e i n i t i a l t i l l e r i n g s t a ge ．材料M a t e r i a l净光合速率P n /(m m o lm －２s －１)蒸腾速率T r /(mm o lm －２s －１)气孔导度G s/(m o lm －２s －１)胞间C O ２浓度C i/(m m o l m o l－１)w y３１４．１６ʃ０．２７∗∗１９３．２７ʃ１０．１０∗∗０．１３ʃ０．０２∗∗２．７６ʃ０．２３∗∗WT２２．４６ʃ０．２９２７６．９６ʃ６．３００．６６ʃ０．０８８．９３ʃ０．４３图３㊀武育粳３号和w y３叶片的台盼蓝染色检测F i g ．３．T r y p a nb l u e s t a i n i n g o f l e a v e s o f t h em u t a n t w y ３a n dw i l d t y pe (W T )．因此测定了突变体w y３和野生型相同部位叶片中一系列的活性氧代谢生理指标.结果显示,突变体w y３中C A T ㊁P O D ㊁T ＧS O D 以及M D A 含量均显著高于野生型(图４),说明在突变体叶片产生类病斑后,活性氧大量积累,活性氧的积累诱发了植物细胞合成大量的超氧化物歧化酶,超氧化物歧化酶将自由基状态的氧负离子以及单线态氧歧化为过氧化氢,过氧化氢在细胞中的积累诱发过氧化物酶(过氧化氢酶)的大量表达.同时,在突变的叶片中活性氧大量积累导致叶片细胞中的生物膜的磷脂分子的不饱和脂肪酸链大量过氧化,生成大量丙二醛.２．７㊀w y３的遗传控制与基因定位２０１４年海南,K a s a l a t h 与突变体w y３配置的F １植株叶片表型正常,２０１５年F ２群体中出现明显的分离,分别表现双亲性状,其中正常株３０００株,类病斑单株１０９９株.经卡方测验,正常株与突变株符合３ʒ１分离比(c ２＝０．７２９５＜c ２０．０５,１＝３．８４).表明突变体w y３类病斑性状受一对隐性核基因控制.为定位该类病斑基因,在均匀分布于水稻１２条染色体的３８０对S S R 标记中,筛选出１２０对在K a s a l a t h 双亲间显示多态性的标记.分别取１５株正常株和１５株突变株构建正常基因池和突变基因池,利用上述多态标记对这两个基因池进行检测.在所用检测的１２０对标记中,第２染色体的标记R M ３３４０和R M １２３６８在两个混池间表现出差异,初步推测这两个标记与基因连锁.进一步选取３０株正常株和３０株类病斑植株,利用R M３３４０㊁∗∗P ＜０．０１．图４㊀突变体w y３与野生型(W T )对照在分蘖期的生理学特性比较F i g ．４．P h y s i o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h ew i l d t y p e (W T )a n d t h e w y ３m u t a n t d u r i n g t h e t i l l e r i n g s t a ge ．３４２张宏根等:水稻类病斑突变体w y ３的鉴定和基因定位表４㊀本研究开发的多态性S T S 标记T a b l e ４．P o l y m o r p h i c S T Sm a r k e r s d e v e l o p e d i n t h i s s t u d y．标记M a r k e r反向引物F o r w a r d p r i m e r (５ᶄＧ３ᶄ)正向引物R e v e r s e p r i m e r (５ᶄＧ３ᶄ)W ２Ｇ１０G A G A T G C C A G G A G A A T G A T G T A G C T G A G G G T T T G A T A W ２Ｇ１７A A A T C T G G A C C T G A A A G TT T A G G G A A G A T T C T C A A A W ２Ｇ１８G C C A G C G A G A A G A A G A A G G A G G A T G T G G T C G G G T G TW ２Ｇ３G C A G C A C G G A C T A C A A G A C A A T T C T G C C A T G A C C A A W ２Ｇ１３T A G T G T C G C C C C T T T T A A C A T C A C A G C A A A C A A G CAA－基因的初步定位;B－基因的精细定位;C－覆盖基因物理图谱;D －基因内变异位点.A ,P r i m a r i l y m a p p i n g o ft a r g e t g e n e ;B ,F i n e m a p p i n g o ft a r g e t g e n e ;C ,P h y s i c a lm a p o f g e n e s ;D ,T h e m u t a t i o nl o c u so f t a r g e t ge n e ．图５㊀水稻类病斑突变体基因定位F i g ．５．M a p p i n g o f t h e t a r g e t ge n e i n w y ３．R M １２３６８进行检测,正常株表现为K a s a l a t h 或F １条带,类病斑植株表现为突变体w y ３条带,说明标记R M ３３４０㊁R M １２３６８与基因连锁(图５).结合本实验室已有的S S R 标记和G r a m e n e (h t t p://w w w．g r a m e n e ．o r g )网站上提供的S S R 信息,在标记R M ３３４０㊁R M １２３６８附近筛选了１４对S S R 标记,其中R M １２３１７㊁R M １２３３９和R M １２３４８在双亲之间具有多态.利用这些标记对F ２群体中１０９９株类病斑单株进行检测,结果在标记R M ３３４０处找到２８个交换株,在标记R M １２３３９处找到５３对交换株,根据交换株信息,初步将基因定位在R M ３３４０和R M １２３３９之间.为了进一步精细定位基因,结合已经公布的水稻品种９３１１和日本晴全基因组序列,利用P r i m e rP r e m i e r ５．０软件,在水稻第２染色体上发展了１３对新的S T S 标记,其中５对标记表现出多态性(部分引物序列如表４所示).利用５对多态标记和８１株交换株,最终把基因定位在W ２Ｇ１７和W ２Ｇ１８之间,两标记间物理距离约为２８k b .２．８㊀候选基因测序分析根据水稻基因组注释数据库(R i c e G e n o m e A n n o t a t i o nP r o j e c t )中的数据,在定位区间共有６个开放阅读框(L O C _O s ０２g ０１９６０－L O C _O s ０２g ０２０１０).对这６个O R F 进行基因组测序.结果发现,与野生型武育粳３号相比,突变体w y ３中的L O C _O s ０２g ０２０００编码区(C D S )第３７５位碱基C 缺失,编码序列在９２０b p 处出现终止子TG A ,使得翻译提前终止(图５),并且野生型武育粳３和日本晴在这个O R F 上的序列完全相同.３㊀讨论在植物中已经发现的大量斑点叶或类病斑突变体中,斑点或者类病斑的出现往往伴随着其他农艺性状的改变,但不同突变体表现并不一致.例如h m １９７[１９]㊁l m s １[２８]㊁l m m ４[２９]等植株株高降低,而突变体s p l ３２[３０]株高未有显著变化;在分蘖数上,h m １９７[２８]㊁g ３４０[３１]㊁s pl ３２[３０]等均未发生显著变化;在结实率上,l m m ４[２９]㊁s p l ３１[３２]㊁s p l ３２[３０]等突变体均显著下降,但g ３４０[３１]突变体结实率没有显著变化.本研究中,w y ３株高㊁分蘖数㊁结实率均显著低于其野生型,植株光合作用能力的下降是造成这些农艺㊁产量性状降低的主要原因.类病斑突变体叶绿素各组分含量显著低于野生型,叶绿素含量降低这一结果也与突变体植株叶片表型相符合,这也导致突变体中叶片光合作用能力的下降.已有研究发现,类病斑形成部位通常伴随自由基和活性氧的积累.在植物细胞中,无法及时清除的活性氧积累是诱导细胞进行程序性死亡的重要信４４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i )㊀第３０卷第３期(２０１６年５月)号因子.S a m u i l o v等[３３]研究表明活性氧的积累与植物细胞凋亡的起始与调节有重要关系.在水稻中已经被克隆的类病斑突变体基因中,O s L S D１[３４]㊁s p l１１[２２]㊁s p l２８[１６]等突变体基因与细胞的凋亡有关.本研究中,台盼蓝染色后发现类病斑叶片出现大量死亡细胞,进一步测得突变体w y３类病斑叶片中的S O D㊁P O D㊁C A T和M D A均极显著高于对照叶片,这一结果说明在突变体w y３叶片产生类病斑后,叶片细胞中存在大量的活性氧自由基,进而调控细胞非程序性死亡,造成了突变体叶片最终枯死.㊀㊀本研究中,利用组合K a s a l a t h/w y３衍生F２群体中的１０９９株隐性单株,将突变体中控制类病斑基因定位在第２染色体短臂标记W２Ｇ１７和W２Ｇ１８之间２８k b的物理区间内.根据已有的报道,在此区间内已经报到了３个类病斑基因s p l２[３５],c e a６２[３６]和O s HP L３[３７],其中s p l２未进行精细定位,c e a６２与O s HP L３已克隆.通过对定位区间内候选O R F 进行测序发现,与野生型相比,突变体w y３中的L O C_O s０２g０２０００编码区(C D S)第３７５位碱基C缺失,编码序列在９２０b p处出现终止子T G A,使得翻译提前终止.不同的是,突变体c e a６２是在L O C_ O s０２g０２０００编码区第１１４６b p处发生单碱基替换(T A CңT A G)从而使得翻译过程提前终止,O s HＧP L３突变体中的L O C_O s０２g０２０００编码区５１８b p 和５１９b p之间插入了一个大约７００b p大小的转座子,使得该基因功能丧失,从而发生类病斑突变.由此可以看出,本研究中定位到的类病斑基因和c e a６２㊁O s HP L３为变异位点不同的复等位基因.尽管s p l２没有被精细定位,但比较已有的定位结果及突变体表型,可以推断c e a６２㊁O s HP L３及本研究中克隆的基因与已报到的s p l２均为等位基因.从表型来看,突变体w y３与已报道的c e a６２和O s HP L３基本一致,但也有所差异.突变体w y３在发生突变时期㊁病斑扩散形式㊁病斑颜色以及植株株高和分蘖等性状上都与c e a６２㊁O s HP L３表现一致,但是w y３在千粒重上与野生型并没有发生显著变化,这与O s HP L３的千粒重较野生型显著下降有所不同[３６];突变体w y３在结实率上的表现与c e a６２有所不同,c e a６２结实率极显著低于野生型,这种极显著降低是由于花粉育性降低造成的[３７],而本研究中w y３花粉育性与野生型并无显著差异(数据未列出),突变体w y３结实率下降是由于植株后期叶片枯死,籽粒灌浆不充实而出现大量瘪粒造成的.另外,O s HP L３突变体来源于粳稻品种中花１１,c e a６２背景源于日本晴,结合性状上的差异,我们推测差异的原因可能是突变位点的不同或核背景不同.鉴于此,我们将该突变基因导入日本晴背景,以期在不同背景下研究该基因的差异.由于实验进度限制,结果仍在进一步研究中.参考文献:[１]㊀王忠华．植物类病变突变体的诱发与突变机制．细胞生物学杂志,２００６,２７(５):５３０Ｇ５３４．W a n g Z H．I n d u c t i o na n d m u t a t i o n m e c h a n i s m o f p l a n t l e s i o n m i m i cm u t a n t s．C h i nJC e l lB i o l,２００５,２７:５３０Ｇ５３４(i nC h iＧn e s ew i t hE n g l i s ha b s t r a c t)[２]㊀D i e t r i c h R A,D e l a n e y T P,U k n e sSJ,e ta l．A r a b i d o p s i s m u t a n t s s i m u l a t i n g d i s e a s e r e s i s t a n c e r e s p o n s e．C e l l,１９９４,７７(４):５６５Ｇ５７７．[３]㊀Büs c h g e sR,H o l l r i c h e rK,P a n s t r u g a R,e ta l．T h eb a r l e y M l o g e n e:A n o v e l c o n t r o l e l e m e n to f p l a n t p a t h o g e nr e s i s tＧa n c e．C e l l,１９９７,８８(５):６９５Ｇ７０５．[４]㊀G r a y J,C l o s e PS,B r i g g s SP,e t a l．An o v e l s u p p r e s s o r o f c e l ld e a t h i n p l a n t s e n c o d e d b y t h eL l s１g e n e o fm a i z e．C e l l,１９９７,８９(１):２５Ｇ３１．[５]㊀B a d i g a n n a v a rA M,K a l eD M,E a p e nS,e t a l．I n h e r i t a n c eo fd i se a s e l e s i o nm i m i c l e af t r a i t i ng r o u n d n u t．J H e r e d,２００２,９３(１):５０Ｇ５２．[６]㊀M a l a m y J,C a r r J P,K l e s s i g DF,e t a l．S a l i c y l i c a c i d:A l i k e l ye n d o g e n o u s s i g n a l i n t h e r e s i s t a n c e r e s p o n s e of t o b a c c o t o v i r a l i n f e c t i o n．S c i e n c e,１９９０,２５０(４９８３):１００２Ｇ１００４．[７]㊀T a k a h a s h iA,K a w a s a k iT,H e n m iK,e ta l．L e s i o n m i m i c m u t a n t s o f r i c ew i t h a l t e r a t i o n s i n e a r l y s ig n a l i n g e v e n t s o f d eＧf e n s e．P l a n t J,１９９９,１７(５):５３５Ｇ５４５．[８]㊀D a n g l JL,D i e t r i c hRA,R i c h b e r g M H．D e a t hd o n t h a v e n o m e r c y:C e l l d e a t h p r o g r a m si n p l a n tＧm i c r o b ei n t e r a c t i o n s．P l a n tC e l l,１９９６,８(１０):１７９３．[９]㊀N e u f f e rM G,C a l v e r tO H．D o m i n a n t d i s e a s e l e s i o nm i m i c s i n m a i z e．J H e r e d,１９７５,６６(５):２６５Ｇ２７０．[１０]S h i r a s uK,S c h u l z eＧL e f e r t P．R e g u l a t o r s o f c e l l d e a t h i n d i s e a s e r e s i s t a n c e．P l a n tM o lB i o l,２０００,４４(３):３７１Ｇ３８５．[１１]D i e t r i c hR A,R i c h b e r g M H,S c h m i d tR,e t a l．An o v e l z i n cf i ng e r p r o t e i n i se n c o d e db y th e A r a bi d o p s i sL S D１g e n ea n df u n c t i o n sa sa n eg a t i v er e g u l a t o ro f p l a n tc e l ld e a t h．C e l l,１９９７,８８(５):６８５Ｇ６９４．[１２]R y e r s o nDE,H e a t hM C．C l e a v a g e o f n u c l e a r D N A i n t o o l i g oＧn u c l e o s o m a l f r a g m e n t s d u r i n g c e l l d e a t h i n d u c e db y f u n g a l i nＧf e c t i o no r b y a b i o t i c t r e a t m e n t s．P l a n t C e l l,１９９６,８(３):３９３Ｇ４０２．[１３]L a m bC,D i x o nR A．T h eo x i d a t i v eb u r s t i n p l a n td i s e a s e r eＧs i s t a n c e．A n n uR e vP l a n tB i o l,１９９７,４８(１):２５１Ｇ２７５．[１４]王建军,朱旭东,王林友,等．水稻类病变突变体l r d４０的抗５４２张宏根等:水稻类病斑突变体w y３的鉴定和基因定位病性与细胞学分析．中国水稻科学,２００５,１９(２):１１１Ｇ１１６．W a n g J J,Z h uXD,W a n g L Y,e t a l．D i s e a s e r e s i s t a n c e a n dc y t o l o g i c a l a n a l y s e s o n l e s i o n r e s e m b l i n gd i se a s em u t a n t l r d４０i n O r y z a s a t i v a．C h i nJR i c e S c i,２００５,１９:１１１Ｇ１１６．(i nC h iＧn e s ew i t hE n g l i s ha b s t r a c t)[１５]陈析丰,金杨,马伯军．水稻类病变突变体及抗病性的研究进展．植物病理学报,２０１１,４１(１):１Ｇ９．C h e nXF,J i nY,M aB J．P r o g r e s s o n t h e s t u d i e s o f r i c e l e s i o nm i m i c s a n d t h e i r r e s i s t a n tm e c h a n i s mt ot h e p a t h o g e n s．A c t a P h y t o p a t h o l S i n,２０１１,４１:１Ｇ９．(i nC h i n e s ew i t hE n g l i s h a bＧs t r a c t)[１６]Q i a oY,J i a n g W,L e e JH,e t a l．S P L２８e n c o d e s ac l a t h r i nＧa s s o c i a t e da d a p t o r p r o t e i n c o m p l e x１,m e d i u m s ub u n i tμ１(A P１M１)a n d i s r e s p o n s i b l e f o r s p o t t e d l e a f a n de a r l y s e n e sＧc e n c e i nr i c e(O r y z as a t i v a)．N e w P h y t o l,２０１０,１８５(１):２５８Ｇ２７４．[１７]W uC,B o r d e o sA,M a d a m b aM RS,e t a l．R i c e l e s i o nm i m i c m u t a n t sw i t he n h a n c e d r e s i s t a n c e t od i s e a s e s．M o lG e n e tG e nＧo m,２００８,２７９(６):６０５Ｇ６１９．[１８]Y i nZ,C h e n J,Z e n g L,e t a l．C h a r a c t e r i z i n g r i c e l e s i o nm i m i c m u t a n t s a n d i d e n t i f y i n g am u t a n tw i t hb r o a dＧs p e c t r u mr e s i s tＧa n c e t o r i c eb l a s t a n d b ac t e r i a l b l i g h t．M o lP l a n tＧM i c r o b e I n t eＧr a c,２０００,１３(８):８６９Ｇ８７６．[１９]李小红,施勇烽,张晓波,等．水稻斑点叶突变体h m１９７的鉴定及其基因定位．中国水稻科学,２０１５,２９(５):４４７Ｇ４５６．L i X H,S h iY F,Z h a n g X B,e ta l．I d e n t i f i c a t i o na n d g e n e m a p p i n g o f as p o t t e dＧl e a fm u t a n t h m１９７i nr i c e．C h i nJR i c e S c i,２０１５,２９(５):４４７Ｇ４５６．(i n C h i n e s e w i t h E n g l i s ha bＧs t r a c t)[２０]C h e nX,H a oL,P a nJ,e t a l．s p l５,a c e l l d e a t ha n dd e f e n s eＧr e l a t e d g e n e,e n c o d e sa p u t a t i v es p l i c i n g f a c t o r３bs u b u n i t３(S F３b３)i n r i c e．M o lB r e e d i n g,２０１２,３０(２):９３９Ｇ９４９．[２１]Y a m a n o u c h iU,Y a n o M,L i n H,e ta l．Ar i c es p o t t e dl e a fg e n e,s p l７,e n c o d e s ah e a t s t r e s s t r a n s c r i p t i o n f a c t o r p r o t e i n．P N A S,２００２,９９(１１):７５３０Ｇ７５３５．[２２]Z e n g LR,Q uS,B o r d e o sA,e t a l．S p o t t e d l e a f１１,a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f p l a n t c e l l d e a t h a n dd e f e n s e,e n c o d e s aUＧb o x/a rＧm a d i l l o r e p e a t p r o t e i ne n d o w e dw i t hE３u b i q u i t i n l i g a s e a c t i v iＧt y．P l a n tC e l l,２００４,１６(１０):２７９５Ｇ２８０８．[２３]M o r iM,T o m i t aC,S u g i m o t oK,e t a l．I s o l a t i o na n dm o l e c uＧl a r c h a r a c t e r i z a t i o no f a s p o t t e d l e a f１８m u t a n t b y m o d i f i e d a cＧt i v a t i o nＧt a g g i n g i nr i c e．P l a n t M o lB i o l,２００７,６３(６):８４７Ｇ８６０．[２４]T a k a h a s h iA,A g r a w a lG K,Y a m a z a k iM,e ta l．R i c eP t i１a n e g a t i v e l y r e g u l a t e sR A R１Ｇd e p e n d e n t d e f e n s e r e s p o n s e s．P l a n tC e l l,２００７,１９(９):２９４０Ｇ２９５１．[２５]Y i nZ,C h e n J,Z e n g L,e t a l．C h a r a c t e r i z i n g r i c e l e s i o nm i m i c m u t a n t s a n d i d e n t i f y i n g am u t a n tw i t hb r o a dＧs p e c t r u mr e s i s tＧa n c e t o r i c eb l a s t a n d b ac t e r i a l b l i g h t．M o lP l a n tＧM i c r o b e I n t eＧr a c,２０００,１３(８):８６９Ｇ８７６．[２６]L i c h t e n t h a l e rH K．C h l o r o p h y l l s a nd c a r o te n o i d s:P i g m e n t s of p h o t o s y n t h e t i c b i o m e m b r a n e s．M e t h o d s E n z y m o l,１９８７(１４８C):３５０Ｇ３８２．[２７]张志良,瞿伟菁．植物生理学实验指导．北京:高等教育出版社,１９９０．Z h a n g ZL,Q u WJ．P l a n t P h y s i o l o g y E x p e r i m e n t a l G u i d a n c e．３r d e d n．B e i j i n g:H i g h e rE d u c a t i o nP r e s s,２００３．(i nC h i n e s e) [２８]王丹．水稻分蘖调控基因T E的功能分析和类病变突变体l m s１的图位克隆．北京:中国农业科学院,２０１２．W a n g D．F u n c t i o n a l a n a l y s i s o f a k e y t i l l e r i n g r e g u l a t o rT Ea n d m a pＧb a s e d c l o n i n g o f g e n e l m s１i n r i c e(O r z y a s a t i v a L．)．B e iＧj i n g:C A A S,２０１２．(i nC h i n e s ew i t hE n g l i s ha b s t r a c t) [２９]邱结华,马宁,蒋汉伟,等．水稻类病斑突变体l m m４的鉴定及其基因定位．中国水稻科学,２０１４,２８(４):３６７Ｇ３７６．Q i uJ H,M a N,J i a n g H W,e ta l．I d e n t i f i c a t i o na n d g e n e m a p p i n g o f a l e s i o n m i m i cm u t a n t l m m４i nr i c e．C h i nJR i c e S c i,２０１４,２８(４):３６７Ｇ３７６．(i nC h i n e s ew i t hE n g l i s h a b s t r a c t) [３０]钟振泉,罗文龙,刘永柱,等．一份新的水稻斑点叶突变体s p l３２的鉴定和基因定位．作物学报,２０１５,４１(６):８６１Ｇ８７１．Z h o n g ZQ,L u oW L,L i uYZ,e t a l．C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n oＧv e l s p o t t e d l e a fm u t a n t s p l３２a n dm a p p i n g o f s p l３２(t)g e n e i n r i c e(O r y z a s a t i v a)．A c t aA g r o nS i n,２０１５,４１(６):８６１Ｇ８７１．(i nC h i n e s ew i t hE n g l i s ha b s t r a c t)[３１]刘林．水稻类病变突变体g３４０的鉴定和基因定位．北京:中国农业科学院,２０１４．L i uL．I d e n t i f i c a t i o na n d g e n e m a p p i n g o f ar i c e l e s i o n m i m i c m u t a n t g３４０．B e i j i n g:C A A S,２０１４(i nC h i n e s ew i t hE n g l i s ha b s t r a c t)[３２]代高猛,朱小燕,李云峰,等．水稻类病斑突变体s p l３１的遗传分析与基因定位．作物学报,２０１３,３９(７):１２２３Ｇ１２３０．D a iG M,Z h uX Y,L iY F,e ta l．G e n e t i ca n a l y s i sa n df i n em a p p i n g o f a l e s i o n m i m i cm u t a n t s p l３１i nr i c e．A c t aA g r o n S i n,２０１３,３９(７):１２２３Ｇ１２３０．(i nC h i n e s ew i t hE n g l i s ha bＧs t r a c t)[３３]S a m u i l o vV D,K i s e l e v s k y DB,S i n i t s y nSV,e t a l．H２O２i nＧt e n s i f i e sC N－Ｇi n d u c e d a p o p t o s i s i n p e a l e a v e s．B i o c h e m(M o sＧc o w),２００６,７１(４):３８４Ｇ３９４．[３４]W a n g L,P e i ZY,H eC．O s L S D１,a r i c e z i n c f i n g e r p r o t e i n, r e g u l a t e s p r o g r a mm e d c e l ld e a t h a n d c a l l u s d i f f e r e n t i a t i o n．M o lP l a n tＧM i c r o b e I n t e r a c,２００５,１８(５):３７５Ｇ３８４．[３５]K o j oK,Y a e n oT,K u s u m iK,e t a l．R e g u l a t o r y m e c h a n i s m s o fR O I g e n e r a t i o na r ea f f e c t e db y r i c e s p l m u t a t i o n s．P l a n tC e l lP h y s i o l,２００６,４７(８):１０３５Ｇ１０４４．[３６]L i uX,L iF,T a n g J,e ta l．A c t i v a t i o no f t h e j a s m o n i ca c i d p a t h w a y b y d e p l e t i o no f t h e h y d r o p e r o x i d e l y a s e O s HP L３r eＧv e a l s c r o s s t a l kb e t w e e n t h eH P La n dA O Sb r a n c h e s o f t h e o xＧy l i p i n p a t h w a y i n r i c e．P L o SO N E,２０１２,７(１１):１Ｇ１４．[３７]T o n g X,Q i J,Z h uX,e t a l．T h e r i c e h y d r o p e r o x i d e l y a s e O sＧHP L３f u n c t i o n s i nd e f e n s er e s p o n s e sb y m o d u l a t i n g t h eo x yＧl i p i n p a t h w a y．P l a n t J,２０１２,７１(５):７６３Ｇ７７５．６４２中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第３０卷第３期(２０１６年５月)。

一个水稻双子房突变体的形态特征和遗传定位的开题报告

一个水稻双子房突变体的形态特征和遗传定位的开题报告题目：一个水稻双子房突变体的形态特征和遗传定位摘要：双子房是水稻雌性生殖器官的重要组成部分，控制水稻花粉的传输和胚胎发育。

本研究通过自然突变和基因克隆的方法，对一个水稻双子房突变体的形态特征和遗传定位进行了研究。

结果表明，该突变体双子房的大小和结构与野生型相比存在明显差异，且部分花器官的发育不足。

遗传定位结果显示，该突变体的基因定位在水稻第三号染色体上，这一基因编码了一个转录因子，可能参与水稻双子房的发育调节。

关键词：水稻，双子房，突变体，遗传定位，转录因子引言：水稻是世界上最重要的粮食作物之一，其生殖发育过程中的关键基因及其调控机理一直是研究的重点。

其中，双子房是水稻胚珠和胚囊的形成和发育的重要组成部分，在水稻产量和质量中具有重要的地位。

目前，还有一些未知的因素影响着水稻双子房的发育，因此，研究水稻双子房的形态特征和遗传机制，对于揭示水稻复杂的花器官发育网络和培育高产、优质水稻品种具有重要意义。

材料和方法：本研究选用一个自然突变的水稻双子房突变体和其野生型作为研究对象，通过组织切片、花器官形态学分析、基因克隆和遗传定位等方法，从形态和遗传角度对该突变体进行了详细研究。

结果：通过对突变体和野生型的比较分析，我们发现该突变体双子房的大小和结构都发生了明显变化，且部分花器官的发育不足。

遗传定位结果表明，该突变体的基因定位在水稻第三号染色体上，这一基因编码了一个转录因子，可能参与水稻双子房的发育调节。

结论：本研究发现一个新的水稻双子房突变体，分析了其形态特征和遗传机制，结果表明该突变体的双子房发育不完全与一种新的基因突变有关。

这对揭示水稻花器官的发育网络和培育高产、优质水稻品种具有重要意义。

水稻类病变突变体g303的鉴定和基因定位

水稻类病变突变体g３０３的鉴定和基因定位刘林１,＃㊀张迎信１,＃㊀李枝１,２㊀刘群恩１㊀余宁１㊀孙滨１㊀杨正福１㊀周全１㊀程式华１㊀曹立勇１,∗(１中国水稻研究所/国家水稻改良中心/浙江省超级稻研究重点实验室,杭州３１０００６;２杭州师范大学生命与环境科学学院,杭州３１００３６;＃共同第一作者;∗通讯联系人,EＧm a i l:c a o l y c g f＠m a i l．h z．z j．c n)C h a r a c t e r i z a t i o na n dG e n eM a p p i n g o f aL e s i o n M i m i cM u t a n t g３０３i nR i c eL I U L i n１,＃,Z H A N G Y i n gＧx i n１,＃,L I Z h i１,２,L I U Q u nＧe n１,Y U N i n g１,S U N B i n１,Y A N G Z h e n gＧf u１,Z HO U Q u a n１,C H E N G S h iＧh u a１,C A O L iＧy o n g１,∗(１Z h e j i a n g K e y L a b o r a t o r y o f S u p e r R i c e/N a t i o n a l C e n t e r f o r R i c eI m p r o v e m e n t/C h i n a N a t i o n a l R i c e R e s e a r c h I n s t i t u t e, H a n g z h o u３１０００６,C h i n a;２C o l l e g eo f L i f ea n d E n v i r o n m e n t a lS c i e n c e s,H a n g z h o u N o r m a l U n i v e r s i t y,H a n g z h o u３１００３６, C h i n a;＃T h e s e a u t h o r s c o n t r i b u t e de q u a l l y t o t h i s p a p e r;∗C o r r e s p o n d i n g a u t h o r,EＧm a i l:c a o l y c g f＠m a i l．h z．z j．c n)L I U L i n,Z HA N G Y i n g x i n,L I Z h i,e t a l．C h a r a c t e r i z a t i o na n d g e n em a p p i n g o f a l e s i o n m i m i cm u t a n t g３０３i nr i c e．C h i n JR i c eS c i,２０１４,２８(５):４６５Ｇ４７２．A b s t r a c t:T h e l e s i o n m i m i c m u t a n t g３０３a n d g３４２w e r e i s o l a t e db y t r e a t i n g t h es e e d so f i n d i c av a r i e t i e s９３１１a n dR８０１５w i t hγＧr a y r a d i a t i o n,r e s p e c t i v e l y．T h e y e l l o ws p o t s i n i t i a l l y a p p e a ro n g３０３l e a v e sa t４Ｇl e a f s t a g e．W i t ht h e g r o w t ha n dd e v e l o p m e n t o f t h e p l a n t,t h e l e s i o n sa l m o s to c c u p i e dt h ew h o l e p l a n t t i l l t h e m a t u r i t y s t a g e．C o m p a r e dw i t h t h e w i l dt y p e,t h e p l a n th e i g h t,s e e ds e t t i n g r a t ea n d１０００Ｇg r a i n w e i g h to f g３０３s i g n i f i c a n t l y d r o p p e d,t h e c h l o r o p h y l la n d p h o t o s y n t h e t i cr a t eo b v i o u s l y d e c r e a s e d．G e n e t i ca n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e m u t a n t p h e n o t y p e w a s c o n t r o l l e db y a s i n g l e r e c e s s i v e g e n e．U s i n g F２m a p p i n gp o p u l a t i o no f g３０３/N i p p o n b a r e,t h e g３０３m u t a n t g e n ew a sm a p p e db e t w e e nm a r k e r I n D１０a n dI n D１２o nr i c ec h r o m o s o m e１２,w i t h g e n e t i cd i s t a n c e so f０．１９c M a n d０．７６c M, r e s p e c t i v e l y．S e q u e n c e a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h em u t a t e d g e n ew a sa l l e l i c t o S L,g３０３a n d g３４２m u t a t e d g e n eh a da s i n g l en u c l e o t i d e d e l e t i o n(T５７２a n dG１２０６,r e s p e c t i v e l y),l e a d i n g t oa p r e m a t u r e t e r m i n a t i o nc o d o n．R e a lＧt i m eP C Ra n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f d e f e n s eＧr e l a t e d g e n e s u p r e g u l a t e d s i g n i f i c a n t l y,t h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e dt h a t t h em u t a t i o nm a y a c t i v a t e t h e d e f e n s e r e s p o n s e．K e y w o r d s:r i c e;l e s i o nm i m i cm u t a n t;g e n em a p p i n g;d e f e n s e r e s p o n s e刘林,张迎信,李枝,等．水稻类病变突变体g３０３的鉴定和基因定位．中国水稻科学,２０１４,２８(５):４６５Ｇ４７２．摘㊀要:通过γ射线辐射诱变籼稻９３１１和中恢８０１５分别获得了２个类病变突变体g３０３和g３４２.g３０３播种４~５周叶片开始出现黄褐色斑点.随着植株的生长发育,至成熟期病斑几乎布满整个植株.与野生型相比,突变体g３０３株高㊁结实率㊁千粒重显著下降,叶绿素含量㊁光合速率显著降低.遗传分析表明,g３０３类病变性状由一对隐性基因控制.利用g３０３/日本晴F２群体进行定位,将突变基因定位于第１２染色体标记I n D１０和I n D１２之间,遗传距离分别为０．１９c M和０．７６c M.测序分析发现,该基因与S L基因等位,其中g３０３和g３４２分别在编码区第５７２位和第１２０６位发生单碱基缺失,导致翻译提前终止.实时R TＧP C R结果显示抗病相关基因在突变体g３０３中表达量显著上升,说明该基因突变很可能激活了防卫反应.关键词:水稻;类病变突变体;基因定位;防卫反应中图分类号:Q３４３５;Q７５４㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀文章编号:１００１Ｇ７２１６(２０１４)０５Ｇ０４６５Ｇ０８㊀㊀类病变突变体是指植物在没有明显的逆境㊁损伤或病原物侵害时,在叶片上自发形成类似病原物侵害后出现坏死斑的一类突变体[１].类病变突变体在植物中普遍存在,拟南芥[２]㊁玉米[３]㊁大麦[４]及水稻[５]等植物中均已发现了该类突变体.由于类病变表型与病原菌侵染后的超敏反应(H R)症状类似,因此,类病变突变体成为了研究植物细胞程序性死亡和防卫反应的理想材料.许多类病变突变体都伴收稿日期:２０１４Ｇ０１Ｇ１６;修改稿收到日期:２０１４Ｇ０２Ｇ１７.基金项目:国家转基因重大专项(２０１１Z X０８００１Ｇ００２);国家自然科学基金资助项目(３１０７１３９８,３１１０１２０３).５６４中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i),２０１４,２８(５):４６５－４７２h t t p://w w w．r i c e s c i．c nD O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００１Ｇ７２１６．２０１４．０５．００３随抗病性提高及抗病反应相关物质的组成性表达,如胼胝质的积累㊁防卫反应相关基因的激活㊁水杨酸含量升高[６].T a k a h a s h i等[７]报道c d r１㊁c d r２㊁C d r３三个类病变突变体抗性相关基因P R１㊁P B Z１大量表达且对稻瘟病生理小种００７抗性增强. M i z o b u c h i等[８]从１４个水稻类病变突变体中筛选到９个对稻瘟病和白叶枯病抗性增强的突变体,其中５个具有广谱抗性的突变体病程相关基因P B Z１㊁P R１和C h t３大量表达.目前,部分控制水稻类病变性状的基因已被克隆.S p l７是第一个被克隆的类病变基因,它编码一个热激转录因子,与玉米的H S F b㊁番茄H S F８和拟南芥H S F２１㊁H S F１高度同源.H S F在热胁迫下会被热激因子活化,并进入细胞核与热激蛋白基因的启动子结合,启动热激蛋白表达[５].Z e n g等[９]分离鉴定了一个对稻瘟病和白叶枯病具有广谱抗性的类病变突变体s p l１１,其编码一个UＧb o x/A r m a d i l l o重复蛋白,该蛋白具有E３泛素连接酶活性,这表明泛素化系统在调控细胞死亡和防卫反应中具有重要作用.M o r i等[１０]通过TＧD N A插入获得一个显性类病变突变体S p l１８(O s A T１),O s A T１编码一个酰基转移酶,突变体叶片上斑点数目越多,O s A T１和防卫反应相关基因P R１和P B Z１表达量也越高.水稻S L基因编码细胞色素P４５０单加氧酶家族的C Y P７１P１蛋白,其催化色胺转变成５Ｇ羟色胺,在s l突变体中大量积累的色胺诱导细胞死亡[１１].S u n等[１２]首次报道水稻类病变形成与四吡咯合成代谢途径中的关键酶粪卟啉原氧化酶(c o p r o p o r p h y r i n o g e no x i d a s e, C P O X)相关.类病变基因S P L５编码剪接因子３b 的亚基３(s p l i c i n g f a c t o r３bs u b u n i t３,S F３b３),其可能通过R N A剪接来调控细胞死亡和防卫反应[１３].最近克隆了一个水稻类病变兼早衰的突变体基因O s L M S(l e s i o n m i m i ca n ds e n e s c e n c e),其蛋白质产物含有两个双链R N A结合域(d s R B M)[１４].由此可见,类病变形成机制相当复杂,涉及多种蛋白和多种代谢途径.与拟南芥相比,水稻类病变的研究相对滞后,相关基因克隆的数量还不多,需要进一步挖掘和克隆更多不同类型的突变体基因.本研究利用γ射线辐射诱变获得了一份水稻类病变突变体g３０３,从表型㊁生理㊁遗传等方面对其进行鉴定,明确遗传特性并对目标基因进行基因定位,采用实时定量R TＧP C R分析抗病相关基因在野生型和突变体中的表达差异,以期为进一步研究该基因对类病变形成的分子机制提供依据.１㊀材料与方法１．１㊀供试材料和农艺性状调查籼稻品种９３１１和中恢８０１５经６０C oＧγ射线辐射诱变分别产生了类病变突变体g３０３和g３４２,等位试验表明g３０３与g３４２等位.供试材料包括g３０３㊁g３４２及其分别对应的野生型以及粳稻品种日本晴(N i p p o n b a r e)和０２４２８.所有材料均正季种植于中国水稻研究所富阳试验基地,种植与管理方法同大田生产.在肥力水平均匀一致的田块种植９３１１及突变体g３０３,在成熟期随机各取１０株,测量和统计其株高㊁每穗粒数㊁穗长㊁千粒重㊁结实率等农艺性状,用M i c r o s o f tE x c e l进行各性状t测验.１．２㊀叶绿素含量测定开花期,在上午８:３０－９:００分别取突变体和野生型剑叶,采用９５％乙醇提取叶绿素,分光光度计测其４７０㊁６４６和６６３n m处的光吸收值.参照W e l l b u r n[１５]的方法换算成叶绿体各色素含量.１．３㊀光合速率测定开花期,在晴天上午９:３０－１１:００,取长势相对一致的单株各１０株,利用L IＧ６４００型便携式光合作用测定仪分别测定野生型和突变型的光合速率.每处理测定３~５片具有代表性的剑叶,每叶重复测定３次(取其平均值作为一次重复).测量时,使用红㊁蓝光源,光强恒定为１２００μm o l/(m２ s),温度为３０ħ,C O２浓度为空气中的浓度,湿度为大气中的湿度.１．４㊀叶肉细胞和叶绿体超微结构观测分别取自然条件下突变体和野生型剑叶叶片,在叶片中部主脉旁取突变体病斑部位和野生型正常部位,样品在２．５％的戊二醛溶液中４ħ下固定２４h,抽真空直到切块下沉为止,用０．１mm o l/L磷酸缓冲液(p H７．０)冲洗３次,每次１５m i n,用１％锇酸４ħ下固定２h,磷酸缓冲液再次冲洗３次;常规梯度乙醇脱水,树脂包埋样品,用R e i c h e r t型切片机超薄切片,经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色后,利用H i t a c h iHＧ７６５０型透射电镜观察并拍照.１．５㊀遗传分析与定位群体的构建２０１２年３月在海南将突变体g３０３与粳稻日本晴㊁０２４２８分别杂交,分别收获杂种F１.同年５月在杭州种植F１,于１０月收获F２种子.２０１２年１１月６６４中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２８卷第５期(２０１４年９月)在海南陵水种植F２群体.成熟期调查F２群体野生型与突变型植株的分离比例,并用χ２检验.基因定位利用g３０３日本晴衍生的F２群体.１．６㊀突变体基因定位亲本和F２定位群体的基因组D N A均采用C T A B法[１６]提取.利用本实验室均匀分布于１２条染色体的３６３对公共引物对亲本进行多态性筛选.基因的初定位采用B S A法.首先根据F２分离群体植株表型,随机等量取１０株类病变植株的D N A和１０株正常植株的D N A分别构建突变体D N A池和正常D N A池.利用上述分子标记对突变体D N A 池和正常D N A池进行扩增,寻找在突变体D N A池中有偏态扩增的分子标记.再用突变单株进一步验证有偏态扩增的分子标记,确定突变位点与分子标记之间的连锁关系和遗传距离.根据基因初定位结果,利用P r i m e r P r e m i e r５．０软件在初定位区段及附近区域设计新的I n D e L标记.引物由上海英骏生物技术有限公司合成.P C R 体系如下:D N A１μL,正反向引物(１０μm o l/L)各０．５μL,d N T P s(１０μm o l/L)０．１μL,１０ˑP C R缓冲液１μL,T a q酶０．２μL,加d d H２O补足１０μL. P C R程序如下:９４ħ下预变性４m i n;９５ħ下３０s,５５ħ下３０s,７２ħ下３０s,３５个循环.P C R产物在６％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳,电泳结束后银染显色并读胶.１．７㊀候选基因分析从水稻基因组注释数据库(r i c e g e n o m ea n n oＧt a t i o n p r o j e c t)查阅位于定位区间内的所有开放阅读框(O R F),并分析可能的候选基因.根据候选基因全长基因组D N A序列,设计测序引物,分别对野生型和突变体的基因组进行扩增并测序.采用高保真D N A聚合酶K O DＧP l u sＧV e r．２扩增候选基因的基因组D N A片段,将P C R产物直接测序.测序结果用C o n t i g E x p r e s s软件拼接完整再通过D N A SＧT A R软件进行比对,确定突变位点.１．８㊀实时定量P C R分别取野生型正常叶和突变体病斑叶经液氮研磨后,采用Q I A G E N R N e a s y P l a n tM i n i试剂盒提取总R N A,用Q I A G E N R N a s eＧF r e eD N a s eS e t去除污染的基因组D N A.第一链c D N A s合成采用T O Y O B O R e v e r T r aA c e q P C RR T M a s t e rM i x,具体操作步骤参照说明书.实时定量P C R实验采用T O Y O B O公司T HU N D E R B I R D S Y B R q P C R M i x试剂盒,定量P C R仪为R o c h e L i g h t C yＧc l e r４８０.水稻A c t i n内参基因㊁防卫反应相关基因P R１a(酸性P R蛋白,A J２７８４３６)㊁C A T(过氧化氢酶,A Y３３９３７２)㊁T P X(硫氧还蛋白过氧化氢酶, AM０３９８８９)㊁P D I(蛋白质二硫键异构酶, A Y９８７３９１)㊁G S T２(谷胱甘肽SＧ转移酶, A J４８６９７６)㊁P B Z１(烯丙异噻唑诱导蛋白, D３８１７０)㊁P OＧC１(过氧化物酶,A F２４７７００)㊁A O S２(丙二烯氧化物合成酶２,C Y P７４A２)㊁I C S１(异分支酸合成酶,A K１２０６８９)㊁N P R１(病程相关基因非表达子,HM９９１１６６)及L O X１(脂肪氧合酶１, F J６６０６１７)引物序列详见表１.实时定量P C R程序如下:９５ħ下预变性３０s;９５ħ下变性５s,６０ħ下３０s,７２ħ下１５s,４０个循环.２㊀结果与分析２．１㊀突变体表型及农艺性状突变体g３０３生长４~５周后,叶片上开始出现橘黄色坏死小斑点,病斑首先出现在下部几张叶片,刚抽出的新叶无病斑表型,而g３０３的等位突变体g３４２表型在分蘖盛期才开始出现.病斑出现后逐渐向四周扩散并最终形成中心枯黄边缘黄褐色的不规则斑块(图１ＧC~D).随着植株的生长,病斑由下部几张叶片向上部叶片蔓延(图１ＧA~B),病斑面积也随之扩大,开花后几乎所有叶片都出现了黄褐色病斑,至成熟期g３０３坏死斑连接成片并覆盖整张叶片,而g３４２突变体坏死斑只在叶片上零星分布.类病变突变体还伴随着其他农艺性状的改变.与野生型相比,突变体g３０３株高㊁结实率㊁千粒重均显著下降,其株高降低了１２．１％,结实率下降了４１．８％,千粒重减少了９．０％(表２).２．２㊀叶绿素含量和光合速率变化为了解突变体叶片光合色素含量的变化,对开花期叶片的色素含量进行了测定.由图２ＧA可知,与野生型相比,突变体g３０３剑叶叶绿素a下降了４８７％,差异达极显著水平,叶绿素b和类胡萝卜素含量虽有所下降但差异不显著.水稻剑叶是光合产物输向穗部的主要供应者,它的光合速率对产量有重要影响.突变体g３０３剑叶光合速率显著低于野生型(图２ＧB),这可能是因为坏死斑减少了叶片的光合作用面积.２．３㊀突变体显微结构利用透射电子显微镜观察野生型及g３０３突变７６４刘林等:水稻类病变突变体g３０３的鉴定和基因定位表１㊀本研究所用的引物T a b l e１．P r i m e r s u s e d i n t h i s s t u d y．标记㊀M a r k e r㊀正向引物㊀F o r w a r d p r i m e r(５ᶄＧ３ᶄ)㊀反向引物㊀R e v e r s e p r i m e r(５ᶄＧ３ᶄ)㊀C１２Ｇ３C G T T C T C T G C A C A C G C T A A G C C G T A G G T C A G T T G G T T T C CC１２Ｇ６C A A C T A A A A C C A A C A C A A A A T C C A T G T C T A G T T G C A T G T C T G A G T G T C I n D１０T T C G G C C T C C T T A T T A C A T T C T T T C C G A A A G T A G G T C A G C T TI n D１２T G G G C A A C T G A A T C T A A C C A G G A G A T G A T G A T G C G G T G A TI n D１５T G C G C T A T T G A A G T G C A T C T T C T C T A T T C A T A C G T T A T T G G A A A A c t i n C A G G C C G T C C T C T C T C T G T A A A G G A T A G C A T G G G G G A G A GP R１a T T C A T C A C C T G C A A C T A C T C G T G C A T A A A C A C G T A G C A T A G C A T C A T A G G T G G T G A T T G C C A A G G A G G A G G C G A G G G T C A G A G A G T GT P X G C C G C T G G T C G G G A A C A A G C G G T C G G G C A G A C G A A G G TP D I C T G T A C T T C G T C A C C C C C A G T G C C C T C T C C T A C T C A C T T GG S T２T A C C C T G A G C A C C C T C T T T T C T C T C C C C T G T A C C A A C C T TP B Z１G G T G T G G G A A G C A C A T A C A A G T C T C C G T C G A G T G T G A C T T GP OＧC１G C T C T G T T T C T T G T T C C A T C T G A G T A T A A T C C T C C G T G C C T T T GA O S２T G G T C G A A T G G G C G A G A G A T A C G A T T G A C G G C G G A G G TI C S１A T G A T T C A C T T T C T T G G A T T T A G T A T G G T T G T T T G CN P R１C C T A A G C C T C G G A T T A A T T G T C C T T C A G T G A G C A G C A TL O X１G C A C A G G A C G A T G A A G C A G T T G G A G T G G A C C C A G G A G T体植株叶绿体超微结构,结果显示(图３),野生型叶绿体呈纺锤形,基粒丰富,基粒堆叠致密,类囊体片层堆垛整齐,叶绿体结构完整.而突变体g３０３叶绿体类囊体降解,基粒片层减少,基粒垛叠排列松散,叶绿体结构异常.２．４㊀突变体遗传分析将g３０３突变体与日本晴㊁０２４２８分别杂交,其F１植株未出现病斑,为正常表型,表明该性状受隐性基因控制.分别统计这两个F２分离群体正常植株和有病斑植株数量,经卡方(χ２)测验,符合３ʒ１的分离比(表３).这表明g３０３类病变性状由单隐性基因控制.２．５㊀突变基因定位选用g３０３ˑ日本晴杂交的F２群体作为定位群体,共获得２６２株突变单株用于基因定位.选用１５５对均匀分布在水稻１２条染色体且在g３０３和日A－开花期野生型９３１１和突变体g３０３植株;B－开花期野生型中恢８０１５和突变体g３４２植株;C－野生型９３１１和突变体g３０３剑叶;D－野生型中恢８０１５和突变体g３４２剑叶.A,P l a n t o f t h ew i l d t y p e９３１１a n d t h e g３０３m u t a n t a t a n t h e s i s;B,P l a n t o f t h ew i l d t y p e Z h o n g h u i８０１５a n d t h e g３４２m u t a n t a t a n t h e s i s;C, T h e f l a g l e a f o f t h ew i l d t y p e９３１１a n d g３０３m u t a n t;D,T h e f l a g l e a f o f t h ew i l d t y p eR８０１５a n d g３４２m u t a n t．图１㊀水稻类病突变体在开花期的植株及类病斑形态F i g．１．P l a n t a n d l e s i o nm i m i c p h e n o t y p e o fw i l d t y p e a n dm u t a n t a t a n t h e s i s．８６４中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２８卷第５期(２０１４年９月)表２㊀野生型９３１１㊁突变体g ３０３的主要农艺性状比较T a b l e ２．C o m p a r i s o no f a g r o n o m i c t r a i t s b e t w e e nw i l d t y pe ９３１１a n dm u t a n t g ３０３．性状T r a i tWT g３０３株高P l a n t h e i gh t /c m １２９．３ʃ１．５１１３．７ʃ１．５∗单株有效穗N o ．o f p r o d u c t i v e p a n i c l e s p e r p l a n t ８．３３ʃ０．５８㊀７．６７ʃ１．５３穗长P a n i c l e l e n gt h /c m ２４．９１ʃ１．２２２３．０１ʃ０．６０每穗总粒数N o ．o f s p i k e l e t s p e r p a n i c l e １９２．６７ʃ５．５６２００．６７ʃ４．４１结实率S e e d s e t t i n g r a t e /％８１．１９ʃ１．８９４７．２８ʃ３．０１∗∗千粒重１０００Ｇg r a i nw e i g h t /g３０．７３ʃ０．２７２７．９８ʃ０．０７∗∗㊀㊀∗和∗∗分别表示在P ＜０．０５和P ＜０．０１水平上差异显著.WT－野生型.∗a n d ∗∗,S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t P ＜０．０５a n d P ＜０．０１,r e s p e c t i v e l y ．WT ,W i l d t y pe．A－野生型９３１１和突变体g ３０３剑叶色素含量;B －野生型９３１１和突变体g ３０３剑叶光合速率.∗和∗∗分别表示在P ＜０．０５和P ＜０．０１水平上差异显著.A ,C h l o r o p h y l l c o n t e n t o f t h ew i l d t y p e ９３１１a n d g ３０３m u t a n t f l a g l e a v e s ;B ,P h o t o s y n t h e t i c r a t e o f t h ew i l d t y p e ９３１１a n d g ３０３m u t a n t f l a gl e a v e s ．∗a n d ∗∗,S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t P ＜０．０５a n d P ＜０．０１,r e s p e c t i v e l y．图２㊀野生型９３１１和突变体g ３０３剑叶生理指标F i g ．２．P h y s i o l o g i c a l p a r a m e t e r s o f t h e f l a g l e a f i nw i l d t y pe ９３１１a n dm u t a n t g ３０３．图３㊀野生型９３１１(A )和g ３０３突变体(B)叶绿体的超微结构F i g ．３．C h l o r o p l a s t s u l t r a s t r u c t u r e o b s e r v a t i o no f t h ew i l d t y pe ９３１１(A )a n d g ３０３m u t a n t (B )．９６４刘林等:水稻类病变突变体g ３０３的鉴定和基因定位表３㊀突变体基因g ３０３的遗传分析T a b l e ３．G e n e t i c a n a l ys i s o f t h e g ３０３．组合C o m b i n a t i o nF １表型P h e n o t y p e F ２野生型植株数N o ．o fw i l d Ｇt y pe p l a n t s 类病变植株数N o ．o fm u t a n t Ｇt y pe p l a n t s χ２(３:１)χ２０．０５g３０３/N i p p o n b a r e 正常２２６６９０．３３３．８４g３０３/０２４２８正常２２３６６０．６１本晴间表现多态性的S S R 或I n D e l 标记分析正常基因池和突变基因池.结果发现位于第１２染色体的I n D e l 标记C １２Ｇ３和C １２Ｇ６在正常基因池和突变基因池间存在差异.利用C １２Ｇ３和C １２Ｇ６对２６２株突变单株进行连锁分析,结果表明C １２Ｇ３和C １２Ｇ６均与目标基因连锁,遗传距离分别为０．９５c M 和１．９０c M .进一步在C １２Ｇ３和C １２Ｇ６之间设计I n D e l标记.其中I n D １０和I n D １２分别有１个和４个交换单株,两侧的交换单株不同,而I n D １５与目标基因共分离.因此,最终把g ３０３基因定位在第１２染色体标记I n D １０和I n D １２之间,遗传距离分别为０．１９c M 和０．７６c M (图４),物理距离为１２９６k b .通过R A P ＧD B 数据库发现在该区段内曾报道了一个水稻类病变基因S L (L O C _O s １２g １６７２０),它编码细胞色素P ４５０单加氧酶,该蛋白催化色胺转变成血清素[１１].因此推断g ３０３可能是S L 的等位基因.２．６㊀候选基因测序分析为明确g ３０３的类病变表型是否由于S L 基因突变造成,对g ３０３和g ３４２以及其分别对应的野生型S L 基因进行测序.S L 基因基因组D N A 全长２２６８b p,包括２个外显子和１个内含子.测序结果(图５)显示,g３０３的S L 基因从A T G 开始计数第５７２位碱基T 缺失,该缺失发生在第１外显子上,导致转录在２０４个氨基酸处提前终止.g ３４２的S L 基因第１２０６位碱基G 缺失,该突变发生在第２外显子上,突变后发生移码突变,并提前出现终止密码子.图４㊀G ３０３基因在第１２染色体上的连锁图谱F i g ．４．L i n k a g em a p of G ３０３o n c h r o m o s o m e １２o f r i c e．图５㊀S L 基因结构以及突变位点(黑框代表外显子,黑线代表内含子)F i g ．５．S t r u c t u r e a n dm u t a t i o n s i t e s o f t h e S L g e n e (B l a c kb o x a n d l i n e r e p r e s e n t e x o na n d i n t r o n ,r e s p e c t i v e l y)．０７４中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i )㊀第２８卷第５期(２０１４年９月)图６㊀实时定量P C R分析突变体g３０３中防卫反应相关基因表达F i g．６．E x p r e s s i o n l e v e l o f g e n e s a s s o c i a t e dw i t hd e f e n s e r e s p o n s e b y r e a lＧt i m eP C R i n g３０３m u t a n t．２．７㊀基因表达分析利用实时定量P C R比较g３０３及其野生型防卫反应相关基因的表达.这些基因包括２个P R基因(P R１a㊁P B Z１)和９个依赖于水杨酸或茉莉酸防卫反应信号途径相关基因.与野生型相比,突变体中P R１a㊁P B Z１基因表达水平分别是野生型的１８３和３．５倍.抗氧化相关基因C A T㊁T P X㊁P D I㊁G S T２㊁P OＧC１和S A或J A合成途径相关基因A O S２㊁I C S１在突变体g３０３中表达量显著上升,而N P R１㊁L O X１表达水平无显著变化(图６).３㊀讨论类病变突变体是研究植物细胞程序性死亡和防卫反应的理想材料.根据类病变产生的特点,可将其划分为起始型和扩散型[１７].本研究报道的g３０３突变体斑点出现后能向四周扩散,至成熟期坏死斑连接成片并覆盖整张叶片,说明g３０３属于扩散型突变体.目前为止,除第９染色体以外的其他１１条染色体都有定位到水稻类病变相关基因.在第１２染色体上定位了s p l１[１１]㊁s p l１１[９]㊁s p l２９(t)[１８]㊁s p l３０(t)[１９]㊁s y l１[２０]㊁s p l t[２１]６个类病变相关基因,其中位于第１２染色体上的s l[１１]和s p l１１[９]基因已被克隆.s l位于第１２染色体着丝粒附近,该突变体３~４叶期在叶片和叶鞘上出现数个１~２mm的灰色水渍状斑点,随后迅速扩大成橘褐色带状斑纹区域,并逐渐连接成片,最后遍布整个植株[１１].表型比较发现,本研究中g３０３突变体与s l突变体相似度很高.在实验中发现g３４２虽然是g３０３的等位突变体,但其病斑在分蘖盛期才开始出现,且其病斑面积和病斑密度都比g３０３小.尽管g３４２病斑形成后也向外扩散,但成熟时坏死病斑不连接成片.这种等位基因表型间的差异可能是由遗传背景或不同的等位突变引起的,这种现象在玉米类病变突变体中也有报道[２２].测序显示,g３０３S L基因第５７２位碱基缺失,导致转录在第２０４位氨基酸处提前终止,而g３４２S L基因在第１２０６位发生单碱基缺失,导致转录在第３７８氨基酸处提前终止.S L基因编码的C Y P７１P１蛋白含有３个保守的结构域,不同位点突变产生的效应也不相同.g３４２S L产物缺失了一个血红素结合域,而g３０３缺失了E X X R结构域和血红素结合域,所引起的突变更加严重,其病斑起始时间更早,病斑面积更大,病斑更严重.实时定量P C R结果显示g３０３突变体中P R１a㊁P B Z１基因表达上调,这表明类病变可能激活了防卫反应相关基因的表达.许多类病变突变体抗病性都不同程度地提高了.Y i n等[２３]报道s l突变体对稻瘟病抗性增强,而有证据显示与野生型相比s l更易感染胡麻斑病(B i p o l a r i s o r y z a e)[２４].目前为止,发现几类信号分子如活性氧中间产物(r eＧa c t i v eo x y g e n i n t e r m e d i a t e s,R O I s)㊁水杨酸(s a l iＧc y l i c a c i d,S A)㊁茉莉酸(j a s m o n i c a c i d,J A)和乙烯(e t h y l e n e,E T)在植物防卫反应中发挥关键作用[２５].本研究中参与S A合成的I C S１基因和J A 合成的A O S２基因在突变体g３０３中大量表达,说明S A㊁J A可能参与了防卫反应信号转导途径.植物防卫反应信号传导途径相当复杂,涉及多个信号分子多个信号途径的交互作用,分离鉴定不同的类病变突变体并克隆相关基因对揭示植物防卫反应的１７４刘林等:水稻类病变突变体g３０３的鉴定和基因定位分子机制㊁合理利用抗病基因资源进行作物遗传改良具有重要意义.参考文献:[１]㊀H o i s i n g t o n D A,N e u f f e r M G,W a l b o t V．D i s e a s el e s i o n m i m i c s i nm a i z e:Ⅰ．E f f e c t o f g e n e t i cb a c k g r o u n d,t e m p e r aＧt u r e,d e v e l o p m e n t a l a g e,a n dw o u n d i n g o nn e c r o t i c s p o t f o rＧm a t i o nw i t h L e s１．D e vB i o l,１９８２,９３(２):３８１Ｇ３８８．[２]㊀D i e t r i c hR A,R i c h b e r g M H,S c h m i d tR,e t a l．An o v e l z i n cf i ng e r p r o t e i n i s e n c o d e db y th e A r a bi d o p s i sL S D１g e n e a n df u n c t i o n sa san eg a t i v er e g u l a t o ro f p l a n tc e l ld e a t h．C e l l,１９９７,８８:６８５Ｇ６９４．[３]㊀G r a y J,C l o s ePS,B r i g g s SP,J o h a lGS．An o v e l s u p p r e s s o r o f c e l l d e a t h i n p l a n t s e n c o d e d b y t h e l l s１g e n e o fm a i z e．C e l l,１９９７,８９:２５Ｇ３l．[４]㊀B u s c h g e sR,H o l l r i c h e rK,P a n s t r u g aR,e t a l．T h e b a r l e y m l og e n e:A n o v e l c o n t r o l e l e m e n to f p l a n t p a t h o g e nr e s i s t a n c e．C e l l,１９９７,８８:６９５Ｇ７０５．[５]㊀Y a m a n o u c h iU,Y a n o M,L i n H X,e t a l．Ar i c es p o t t e d l e a fg e n e,S p l７,e n c o d e s a h e a t s t r e s s t r a n s c r i p t i o n f a c t o r p r o t e i n．P r o cN a t lA c a dS c i,２００２,９９:７５３０Ｇ７５３５．[６]㊀D i e t r i c h R A,D e l a n e y T P,U k n e sSJ,e ta l．A r a b i d o p s i s m u t a n t s s i m u l a t i n g d i s e a s er e s i s t a n c er e s p o n s e．C e l l,１９９４,７７(４):５６５Ｇ５７７．[７]㊀T a k a h a s h iA,K a w a s a k iT,H e n m iK,e ta l．L e s i o n m i m i c m u t a n t s o f r i c ew i t h a l t e r a t i o n s i n e a r l y s i g n a l i n g e v e n t s o f d eＧf e n s e．P l a n t J,１９９９,１７(５):５３５Ｇ５４５．[８]㊀M i z o b u c h iR,H i r a b a y a s h iH,K a j iR,e ta l．D i f f e r e n t i a le xＧp r e s s i o no fd i s e a s er e s i s t a n c ei nr i c el e s i o nＧm i m i c m u t a n t s．P l a n tC e l lR e p,２００２,２１:３９０Ｇ３９６．[９]㊀Z e n g LR,Q uSH,B o r d e o sA,e t a l．S p o t t e d l e a f１１,a n e g aＧt i v er e g u l a t o ro f p l a n tc e l ld e a t ha n dd e f e n s e,e n c o d e sauＧb o x/a r m a d i l l o r e p e a t p r o t e i n e n d o w e dw i t hE３u b i q u i t i n l i g a s ea c t i v i t y．P l a n tC e l l,２００４,１６:２７９５Ｇ２８０８．[１０]M o r iM,T o m i t aC,S u g i m o t oK,e t a l．I s o l a t i o na n dm o l e c uＧl a r c h a r a c t e r i z a t i o no f a S p o t t e dl e a f１８m u t a n tb y m o d i f i e da c t i v a t i o nＧt a g g i n g i nr i c e．P l a n t M o lB i o l,２００７,６３:８４７Ｇ８６０．[１１]F u j i w a r aT,M a i s o n n e u v e S,I s s h i k iM,e t a l．S e k i g u c h i l e s i o ng e n e e n c o d e s a c y t o c h r o m eP４５０m o n o o x y g e n a s e t h a t c a t a l yＧz e sc o n v e r s i o n o ft r y p t a m i n et o s e r o t o n i ni n r i c e．J B i o lC h e m,２０１０,２８５:１１３０８Ｇ１１３１３．[１２]S u nC,L i uL,T a n g J,e t a l．R L I N１,e n c o d i n g a p u t a t i v e c o pＧr o p o r p h y r i n o g e n I I I o x i d a s e,i s i n v o l v e d i n l e s i o n i n i t i a t i o n i nr i c e．JG e n e tG e n o m,２００８,３８:２９Ｇ３７．[１３]C h e nX,H a oL,P a n J,e t a l．S P L５,a c e l l d e a t h a n dd e f e n s eＧr e l a t e d g e n e,e n c o d e sa p u t a t i v es p l i c i n g f a c t o r３bs u b u n i t３(S F３b３)i n r i c e．M o l e c u lB r e e d i n g,２０１２,３０(２):９３９Ｇ９４９．[１４]U n d a n JR,T a m i r u M,A b eA,e t a l．M u t a t i o n i n O s L M S,ag e n e e n c o d i n g a p r o t e i nw i t h t w od o u b l eＧs t r a n d e dR N Ab i n dＧi n g m o t i f s,c a u s e s l e s i o n m i m i c p h e n o t y p ea n de a r l y s e n e sＧc e n c e i n r i c e(O r y z a s a t i v a L．)．G e n e sG e n e tS y s t,２０１２,８７(３):１６９Ｇ１７９．[１５]W e l l b u r nA R．T h e s p e c t r a l d e t e r m i n a t i o n o f c h l o r o p h y l l a a n d b,a sw e l la st o t a l c a r o t e n o i d s,u s i n g v a r i o u ss o l v e n t sw i t hs p e c t r o p h o t o m e t e r so f d i f f e r e n t r e s o l u t i o n．JP l a n tP h y s i o l,１９９４,１４４:３０７Ｇ３１３．[１６]R o g e r s SO,B e n d i c hAJ．E x t r a c t i o no fD N Af r o m m i l l i g r a ma m o u n t so f f r e s h,h e rb a r i u m a n d m u mm i f i e d p l a n tt i s s u e s．P l a n tM o lB i o l,１９８５,５:６９Ｇ７６．[１７]L o r r a i nS,V a i l l e a u F,B a l a g u e R o b y D．L e s i o n m i m i c m uＧt a n t s:K e y s f o r d e c i p h e r i n g c e l l d e a t h a n d d e f e n s e p a t h w a y s i np l a n t s?T r e n d sP l a n t S c i,２００３,８:２６２Ｇ２７１．[１８]李秀兰,王平荣,曲志才,等．水稻类病变突变体C２３的遗传分析与基因的精细定位．中国农业科学,２０１０,４３(１８):３６９１Ｇ３６９７．[１９]杨绍华,刘华清,王锋．水稻斑点叶突变体W１７６４的遗传分析及初步定位．福建农业学报,２０１１,２６(４):５１９Ｇ５２２．[２０]吴超,付亚萍,胡国成,等．一个水稻类病变黄叶突变体的鉴定和精细定位．中国水稻科学,２０１１,２５(３):２５６Ｇ２６０．[２１]陈萍萍,叶胜海,赵宁春,等．浙粳２２类病斑突变体s p l(t)特征及其基因定位．核农学报,２０１０,２４(１):０００１Ｇ０００６．[２２]P e n n i n g B W,J o h a l GS,M c M u l l e nM D．A m a j o r s u p p r e s s o r o f c e l ld e a t h,s l m１,m o d i f i e st h ee x p r e s s i o no ft h e m a i z e( Z e am a y s L．)l e s i o n m i m i cm u t a t i o n l e s２３．G e n o m e,２００４,４７:９６１Ｇ９６９．[２３]Y i nZC,C h e nJ,Z e n g L R,e t a l．C h a r a c t e r i z i n g r i c e l e s i o n m i m i cm u t a n t s a n d i d e n t i f y i n g am u t a n tw i t hb r o a dＧs p e c t r u mr e s i s t a n c e t o r i c e b l a s t a n d b a c t e r i a l b l i g h t．M o lP l a n tM i c r o b eI n,２０００,１３(８):８６９Ｇ８７６．[２４]I s h i h a r aA,H a s h i m o t oY,T a n a k aC,e t a l．T h e t r y p t o p h a n p a t h w a y i s i n v o l v e di nt h ed e f e n s er e s p o n s e so fr i c ea g a i n s tp a t h o g e n i c i n f e c t i o nv i a s e r o t o n i n p r o d u c t i o n．P l a n t J,２００８,５４:４８１Ｇ４９５．[２５]T h o mm a BP,P e n n i n c k x IA,B r o e k a e r tW F,e t a l．T h e c o mＧp l e x i t y o f d i s e a s e s i g n a l i n g i n A r a b i d o p s i s．C u rO p i I mm u n,２００１,１３:６３Ｇ６８．２７４中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i)㊀第２８卷第５期(２０１４年９月)。

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第 10 期
周明镜等: 一个水稻多柱头突变体的形态特征和基因定位
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图 1 突变体小花的形态观察 Fig. 1 Anatomical observation of the mutant flower A 为野生型颖花; B~H 为花器官突变体: B、C、D 分别为 3、4、 5 个柱头的突变体颖花; E、F、G 为不同程度的雄蕊雌蕊化及雄
Abstract: Floral organ development directly affects rice yield and quality. Here we report a rice floral mutant with increased stigmas, which was isolated from the progenies of the combination of C2/2480. Compared with the wild type rice, the mutant showed dwarf plant, small panicle and grain, curled flag leaf, narrow and opening spikelet, and later flowering. Most of florets were made up of normal lodicule, increased stigmas, more pistils, and fewer stamens. Segregation of wild type plants to mutant plants in three F2 population were accorded with the ratio of 3:1, which indicated that the mutant is controlled by a single recessive gene. With SSR (Simple Sequence Repeat) markers screening in a total of 92 F2 mutant individuals derived from the cross of ism/T116, the mutant gene was located between the molecular markers RM3183 and RM3827, at the distances of 2.2 cM and 12.0 cM, respectively, on chromosome 6, and co-segregated with RM11951, RM19953, and RM19961. ISM(t) is a new floral-organ identity gene located on chromosome 6 in rice. This result provided a foundation of map-based cloning and function analysis of ISM(t) gene. Keywords: Rice; Floral organ; Mutant; Genetic analysis; Genetic mapping
花粉碘染镜检结果表明, 突变体花粉育性因花药畸形程度而异, 畸形严重的几乎 100%不育, 呈现典败状; 而育性最高的花药的花粉可育率约为 20%, 均远远低于对照花粉 90%左右的可育率, 表明突变体的花粉育性受到严重影响(图 2)。 2.2 花器官发育过程
扫描电镜观察表明, 突变体与野生型对照相比, 在颖花原基分化期, 两者并没有明显差异。此后, 在野生型雌雄蕊分化期, 颖花原基均衡分裂, 靠近外稃位于浆片旁的第 6 枚雄蕊略迟发育, 靠近内稃的雄蕊原基较先发育, 最终形成 6 枚均等的雄蕊以同心圆方式排列在雌蕊周围; 而突变体雌、雄蕊原基的分化较迟, 突变体外稃与内稃相交处的 2 枚雄蕊原基位点分化较早, 并迅速发育变大超过其他雄蕊原基, 这些过大原基多数表现雌蕊化的发育趋势, 并向外稃和内稃相交的两侧挤压。突变体内、外稃相
2 结果与分析
2.1 突变体形态突变体与野生型水稻相比, 大部分植株矮化,
穗变短变小, 几乎不育, 多数剑叶卷曲包裹稻穗, 谷粒比野生型小, 颖壳变窄, 部分内外颖壳不闭合, 花期明显晚于野生型水稻。
解剖观察显示, 与野生型相比, 突变体颖花浆片正常, 柱头数量明显增加, 并且伴随明显的畸形; 雌蕊存在明显的多柱头现象, 大部分为 3~5 个; 大部分雄蕊花药数量减少, 一般为 3~4 枚, 且大多退化畸形, 呈白色透明状, 育性不正常。部分突变体子房呈现膨大、表面不光滑、凹陷等畸形, 并伴随双子房和融合双子房现象。同时, 在突变体中还观察到大量不同程度的雄蕊雌蕊化现象(图 1)。
一个水稻多柱头突变体的形态特征和基因定位
周明镜 1,2 王玲霞 1,2
文勇 2 李双成 1,2 李平 1,2,*
李成波 2
张曼华 2
高烽焱 2
1 四川农业大学水稻研究所, 四川温江 611130; 2 四川农业大学 / 作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室, 四川雅安 625014
摘要: 水稻产量和品质受花器官发育的直接影响, 因此对水稻颖花发育机理的研究有助于水稻产量和品质的遗传改良。在籼稻 C2 与 2480 的杂交后代中发现了一个多柱头突变体, 与野生型相比, 该突变体植株矮化、穗变小、开花延迟和育性降低。颖花解剖发现, 其浆片正常, 柱头和雌蕊数量增加, 雄蕊数目明显减少, 并伴随不同程度的雌雄蕊畸形。以突变体作母本, 构建群体进行遗传分析, 结果显示所有 F1 均表现正常, F2 群体出现 3∶1 性状分离, 证实该突变性状受 1 对隐性基因控制。利用微卫星标记进行连锁分析, 将该基因定位于水稻第 6 染色体上标记 RM3183 和 RM3827 之间, 遗传距离分别为 2.2 cM 和 12.0 cM, 且与 RM11951、RM19953 和 RM19961 共分离。ISM(t)是一个新的水稻花器官发育控制基因。关键词: 水稻; 花器官; 突变体; 遗传分析; 基因定位
采用碘化钾染色法, 在突变体材料中上部枝梗中选取当天将开花的颖花, 用 1% I2-KI 染液染色, 于显微镜(OLYMPUS, CX21, Japan)下观察染色深度和花粉粒外形, 判断花粉育性, 并统计可育比例, 以正常植株作为对照。
1.5 遗传分析以花器官突变体材料为母本, 分别以 9311、明
Phenotypic Characterization and Genetic Mapping of an Increased Stigma Mutant in Rice (Oryza sativa L.)
ZHOU Ming-Jing1,2, WEN Yong2, LI Shuang-Cheng1,2, LI Cheng-Bo2, ZHANG Man-Hua2, GAO Feng-Yan2, WANG Ling-Xia1,2, and LI Ping1,2,*
1 Rice Research Institute, Sichuan Agricultural University, Wenjiang 611130, China; 2 Key Laboratory of Crop Genetic Resources and Improvement, Ministry of Education / Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China
从突变体材料中随机选取成熟颖花在解剖镜下观察, 考察其颖花构造、雌蕊、雄蕊、柱头、子房及浆片形态及数目特征。 1.3 扫描电镜观察花器官发育
取刚刚形成生长锥 l cm 左右的幼穗, 按 Feng 等[16] 和 Mizukami 等[17]的方法处理突变小花, 略有改动。用 3%戊二醛固定 5 h, 然后用生理盐水(0.7%)洗涤 3 次, 每次 5 min; 随后用 30%、50%、70%、80%和 90% 乙醇分别脱水 10~15 min, 再用 100%乙醇分别脱水 20 min 和 25 min; 将脱水后样品置乙酸异戊醋中处理 15~30 min, 于 CO2 临界点干燥; 最后真空镀膜。在扫描电镜(JSM-35CF, JEOL, Japan)下观察、照相并记录结果。 1.4 育性检测
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(10): 1779−1784 ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
/zwxb/ E-mail: xbzw@
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.01779
恢 63 和 T116 为父本配制杂交组合, 分别形成相应的 F1 和 F2 群体。次年种植分离群体, 抽穗后调查突变性状分离情况, 记录群体总株数、突变单株数, 计算分离比例, 并进行卡方检验。 1.6 基因定位
用本实验室保存的均匀分布于水稻染色体上的 520 对微卫星引物(由上海博亚生物技术有限公司合成)筛选亲本, 分别再用亲本、4 株正常株、6 锁验证, 然后初步定位。
URL: /kcms/detail/11.1809.S.20110728.1004.022.html
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作物学报
第 37 卷
型被扩展成 ABCD 模型[7-9]。该模型对于单子叶植物的花器官发育研究具有重要的借鉴作用。但单子叶植物的花器官结构与双子叶模式植物有着显著的区别, 其花器官发育是否遵循相似的调控机制还缺乏足够的证据[10-12]。作为单子叶的代表植物和禾本科的模式作物, 水稻花器官发育的研究对于阐明单子叶植物的花器官发育模式、明晰单双子叶植物花器官发育的异同都有非常重要的意义[13]。同时, 水稻产量和品质的形成受到花器官发育的直接影响, 研究其基因调控机制将有助于水稻分子育种的发展[14-15]。