仪器分析高效液相色谱PPT课件
合集下载
仪器分析--高效液相色谱分析 PPT课件
分析酸（阴离子分离）：常采用烷基铵类，如：氢氧化
四丁基铵 分析碱（阳离子分离）：常采用烷基磺酸类，如：己烷 磺酸钠； 反相离子对色谱：
固定相：非极性的疏水键和相 (C-18柱)
流动相：含有对离子的甲醇-水或乙腈-水
2018/12/11
4、 离子交换色谱
固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 基本原理：组分在固定相上发生的离子交换反应；不同 组分与离子交换剂之间亲和力的大小不同。
第三章 高效液相色谱分析
High Performance Liquid Chromatography, HPLC
2018/12/11
§3-1 高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法： 一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 它在经典液相色谱的基础上，引入气相色 谱的理论，技术上采用了高压泵、高效分离柱、 高灵敏度检测器。
2018/12/11
2、HPLC与GC的区别
• 分析对象及范围：GC分析只限于气体和低沸点的稳定化合物， 而这些物质只点有机物总数的20%；HPLC可以分析高沸点、高 分子量、热稳定或不稳定化合物，这类物质占有机物总数的80%。 • 流动相的选择：GC采用的流动相中为有限的几种“惰性”气体， 只起运载作用，和组分之间没有相互的作用力；HPLC采用的流 动相为各种极性不同的液体或液体的混合，可供选择的机会多。 它除了起运载作用外，还可与组分作用，并与固定相对组分的作 用产生竞争，即流动相对分离的贡献很大，可通过溶剂来控制和 改进分离。 • 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
2018/12/11
2018/12/11
1. 高效液相色谱与经典液相色谱方法的比较
高压： HPLC采用高压输液设备, 150-350*105 Pa
高效液相色谱分析 教学PPT课件
四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。
仪器分析高效液相色谱法共48页PPT
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟பைடு நூலகம்的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
仪器分析高效液相色谱法
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
谢谢你的阅读
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟பைடு நூலகம்的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
仪器分析高效液相色谱法
31、园日涉以成趣，门虽设而常关。 32、鼓腹无所思。朝起暮归眠。 33、倾壶绝余沥，窥灶不见烟。
34、春秋满四泽，夏云多奇峰，秋月 扬明辉 ，冬岭 秀孤松 。 35、丈夫志四海，我愿不知老。
谢谢你的阅读
仪器分析― 高效液相色谱法PPT课件
填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，
流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，
但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
4
• 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识 到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减 小填充物的粒径（3~10 m ）！
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此 外 还 配 有 梯 度淋洗、自动进样 和数据处理装置。
其工作过程如图 8-2所示。
图8-2 HPLC仪器工作过程示意图
9
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
选择原则。
3
8.1 概 述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色 谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外， 还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
• 结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有
用、更具发展前途！
7
3. 应用 由于HPLC分离分析的高
灵敏度、定量的准确性、适 于非挥发性和热不稳定组分 的分析，因此，在工业、科 学研究，尤其是在生物学和
不溶于水 非极性
极性增加 非离子极性
16
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，
但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
4
• 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识 到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减 小填充物的粒径（3~10 m ）！
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此 外 还 配 有 梯 度淋洗、自动进样 和数据处理装置。
其工作过程如图 8-2所示。
图8-2 HPLC仪器工作过程示意图
9
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
选择原则。
3
8.1 概 述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色 谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外， 还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
• 结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有
用、更具发展前途！
7
3. 应用 由于HPLC分离分析的高
灵敏度、定量的准确性、适 于非挥发性和热不稳定组分 的分析，因此，在工业、科 学研究，尤其是在生物学和
不溶于水 非极性
极性增加 非离子极性
16
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
高效液相色谱的特点与仪器PPT课件
输液系统通常采用高压泵，能够产生较高的压力，以满足色谱柱对流动 相的阻力和分离要求。
色谱柱
色谱柱是高效液相色谱仪器中用于分离 样品的关键部件，由固定相和流动相组
成。
根据不同分离需求，可以选择不同类型 色谱柱的填料粒径和柱长对分离效果和 的色谱柱，如正相、反相、离子交换等。 分离时间有重要影响，粒径越小、柱长
高效液相色谱仪器配备各种自动检测 和控制功能，如压力控制、流量控制、 温度控制等，确保实验结果的准确性 和可靠性。
03
高效液相色谱仪器介绍
输液系统
输液系统是高效液相色谱仪器的核心部分，负责将流动相泵入色谱柱进 行分离。
输液系统应具备高精度和高稳定性，以确保流动相的流量和压力稳定， 从而获得准确的分离结果。
检测和分析。
环境分析
生物分析
用于环境样品中有机污 染物、重金属等的检测 和分析，评估环境质量。
用于生物样品中蛋白质、 核酸、糖类等的分离和 分析，研究生物分子结
构和功能。
02
高效液相色谱的特点
高分离效能
高效液相色谱采用小颗粒填料， 减小了传质阻力，提高了柱效。
高效液相色谱的固定相和流动 相的极性、酸碱度等参数可根 据需要进行调整，提高了分离 的选择性。
高效液相色谱的固定相和流动相 的纯度较高，减少了杂质干扰，
提高了检测灵敏度。
高效液相色谱可采用柱后衍生技 术或在线富集技术等手段，进一
步提高检测灵敏度。
自动化程度高
高效液相色谱仪器自动化程度高，可 实现自动进样、自动清洗、自动控制 等操作。
高效液相色谱仪器可与计算机技术相 结合，实现数据采集、处理和报告的 自动化，提高工作效率。
越长，分离效果越好，但同时也会增加 分离时间和仪器压力。
色谱柱
色谱柱是高效液相色谱仪器中用于分离 样品的关键部件，由固定相和流动相组
成。
根据不同分离需求，可以选择不同类型 色谱柱的填料粒径和柱长对分离效果和 的色谱柱，如正相、反相、离子交换等。 分离时间有重要影响，粒径越小、柱长
高效液相色谱仪器配备各种自动检测 和控制功能，如压力控制、流量控制、 温度控制等，确保实验结果的准确性 和可靠性。
03
高效液相色谱仪器介绍
输液系统
输液系统是高效液相色谱仪器的核心部分，负责将流动相泵入色谱柱进 行分离。
输液系统应具备高精度和高稳定性，以确保流动相的流量和压力稳定， 从而获得准确的分离结果。
检测和分析。
环境分析
生物分析
用于环境样品中有机污 染物、重金属等的检测 和分析，评估环境质量。
用于生物样品中蛋白质、 核酸、糖类等的分离和 分析，研究生物分子结
构和功能。
02
高效液相色谱的特点
高分离效能
高效液相色谱采用小颗粒填料， 减小了传质阻力，提高了柱效。
高效液相色谱的固定相和流动 相的极性、酸碱度等参数可根 据需要进行调整，提高了分离 的选择性。
高效液相色谱的固定相和流动相 的纯度较高，减少了杂质干扰，
提高了检测灵敏度。
高效液相色谱可采用柱后衍生技 术或在线富集技术等手段，进一
步提高检测灵敏度。
自动化程度高
高效液相色谱仪器自动化程度高，可 实现自动进样、自动清洗、自动控制 等操作。
高效液相色谱仪器可与计算机技术相 结合，实现数据采集、处理和报告的 自动化，提高工作效率。
越长，分离效果越好，但同时也会增加 分离时间和仪器压力。
现代仪器分析第十一章高效液相色谱PPT课件
18
WHAT IS THE INTERACTION?
Hydrophobic interaction
polar solvent
Non-polar
-
19
RETENTION TIME AND HYDROPHOBICITY
OH
C18 (ODS)
Strong OH
Weak
-
20
反相色谱 REVERSE PHASE
C. 流动相离子色谱法MPIC分离是基于被分析物在分析柱 上的吸附作用分析柱的选择性主要取决于可动相的组 成和浓度流动相除了加入有机改进剂之外还需加入离 子对试剂这种分离方式可用于表面活性阴离子和阳离 子以及过渡金属络和物的分离。
-
14
离子色谱的优点
1 速度一般10min即可分别完成阴阳离子的剖面 2 灵敏度直接进样可达ppb级用浓缩柱可达ppt级
l Lambert-Beer's law
A= eCl = - log (Eout / Ein)
(A : absorbance)
-
28
UV--VIS Detector
Grating
l
Sample Cell
Ein
Eout
Photodiode
D2 / W lamp
Ein
Ein
Photodiode
Reference Cell
motor and cam
pump head
plunger plunger seal
check valve
10-100uL
-
8
PARTS OF A HPLC SYSTEM
C. DIAPHRAGM PUMP oil reserve
【完整】高效液相色谱仪课件资料PPT
1、 使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等； A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。 高效液相色谱仪的系统组成
由于HPL C具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用, 流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医 药研究、环境分析、无机分析等各种领域。
色谱图示例
硅胶层析后活性样品的液相分离图谱
操作过程中应注意的事项
• 流动相 1、 流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液 及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系 膜的使用范围； 2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长 菌变质； 3、 使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中 有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置 含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含 盐流动相；A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶， 用于存放水相流动相。
高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非 挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。
2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质； 2、 用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大； 高效——塔板数可达5000/米。 色谱柱：
高效液相色谱仪的应用
• 高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性 的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可 以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各 种分子量范围的物质。
• 由于HPL C具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可 反复利用, 流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物 化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种 领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发 展方向。 液相色谱- 质谱连用技术受到普遍重视, 如分析氨基甲酸 酯农药和多核芳烃等; 液相色谱- 红外光谱连用也发展很快, 如在环境污染分析测定水中的烃类, 海水中的不挥发烃类, 使环境污染分析得到新的发展。
由于HPL C具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用, 流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医 药研究、环境分析、无机分析等各种领域。
色谱图示例
硅胶层析后活性样品的液相分离图谱
操作过程中应注意的事项
• 流动相 1、 流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液 及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系 膜的使用范围； 2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长 菌变质； 3、 使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中 有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置 含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含 盐流动相；A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶， 用于存放水相流动相。
高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可以分离热不稳定和非 挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。
2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质； 2、 用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大； 高效——塔板数可达5000/米。 色谱柱：
高效液相色谱仪的应用
• 高效液相色谱法只要求样品能制成溶液, 不受样品挥发性 的限制,流动相可选择的范围宽,固定相的种类繁多,因而可 以分离热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各 种分子量范围的物质。
• 由于HPL C具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可 反复利用, 流出组分易收集等优点,因而被广泛应用到生物 化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等各种 领域。高效液相色谱仪与结构仪器的联用是一个重要的发 展方向。 液相色谱- 质谱连用技术受到普遍重视, 如分析氨基甲酸 酯农药和多核芳烃等; 液相色谱- 红外光谱连用也发展很快, 如在环境污染分析测定水中的烃类, 海水中的不挥发烃类, 使环境污染分析得到新的发展。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
广义地讲，除柱色谱外，薄层色谱（液—固色谱）和纸色谱（液—液 色谱）也属于LC。
狭义的LC指柱色谱。按分离机理，柱色谱法可分为液—固吸附色谱、 液—液分配色谱、键合相色谱、离子色谱等。
.
2020/4/22
4
6.1.1液—固吸附色谱法
液---固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多 孔的固体颗粒物质（如硅胶、氧化铝等），在它们的表面存在吸附中 心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离 的。 1．分离原理
.
2020/4/22
8
液液分配色谱
正相色谱法
1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物. 酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出
(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可 在室温条件下工作。P296
从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途
.
2020/4/22
2
3.HPLC的特点
1、样品不必气化 2、分离温度低 3、选择性好 4、样品回收容易 5、分离效果好 塔板数达到104 ~105/m 6、采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器 7、仪器设备费用昂贵，操作严格。
是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越 显著越好。
根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱 和反相分配色谱。
如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱， 它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大 的后流出。
如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱，它 适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。
荧光检测器——10-11g。
经典LC
HPLC
柱之内径
1~5cm
~0.4cm
长度
50~100cm
15~50cm
填充材料粒度 150µm~200µm
4µm~10µm
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
使用压力
1~10atm
50~200atm
2020/4/22
分离时间
0. .5h~天
~10min
1
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们 仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定 性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。
1.分离原理
液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互 不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱 的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差 速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。
2.固定相 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种
总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并 用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已 被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋 白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质 的分离和分析。
.
2020/4/22
3
§6.1 HPLC的主要类型及选择
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高 灵敏度、高自动化。
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加， 例:分离苯的羟基化合物，7个组分只
分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重 需1min就可完成。对氨基酸分离，用
力加料，完成一次分析需时数小时。
经 典 色 谱 法 ， 柱 长 约 170cm ， 柱 径
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均 0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需
匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分 用20多小时才能分离出20种氨基酸；
钟内完成数百种物质的分离。
而用高效液相色谱法，只需lh之内即
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 可完成。
不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂 渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相 色谱法的一个重大突破。最常用的强极性固定液β,β′---氧二丙睛，中等极性的聚乙 二醇，非极性的角鲨烷等。
.
2020/4/22
7
3．流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失，对流动相的一个基本要求
3.流动相
把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往 往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱 剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂 的极性越强。
.
2020/4/22
6
6.1.2液---液分配色谱法
在液---液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的 分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非 离子型的化合物。
当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要 吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要 它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动 相溶剂，于是，在固定相表面发生竞争吸附:
X + nSad 达平衡时,有
=
Xad
+
nS
Kad
[Xad][S]n [X][Sad]n
(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生 相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性 的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分 作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控 制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗 脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。
.
2020/4/22
5
2.固定相 液---固吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附
剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容 量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等， 因此，以硅胶用得最多。
狭义的LC指柱色谱。按分离机理，柱色谱法可分为液—固吸附色谱、 液—液分配色谱、键合相色谱、离子色谱等。
.
2020/4/22
4
6.1.1液—固吸附色谱法
液---固吸附色谱是以固体吸附剂作为固定相，吸附剂通常是些多 孔的固体颗粒物质（如硅胶、氧化铝等），在它们的表面存在吸附中 心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离 的。 1．分离原理
.
2020/4/22
8
液液分配色谱
正相色谱法
1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物. 酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出
(3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可 在室温条件下工作。P296
从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途
.
2020/4/22
2
3.HPLC的特点
1、样品不必气化 2、分离温度低 3、选择性好 4、样品回收容易 5、分离效果好 塔板数达到104 ~105/m 6、采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器 7、仪器设备费用昂贵，操作严格。
是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越 显著越好。
根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱 和反相分配色谱。
如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱， 它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大 的后流出。
如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱，它 适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。
荧光检测器——10-11g。
经典LC
HPLC
柱之内径
1~5cm
~0.4cm
长度
50~100cm
15~50cm
填充材料粒度 150µm~200µm
4µm~10µm
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
使用压力
1~10atm
50~200atm
2020/4/22
分离时间
0. .5h~天
~10min
1
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们 仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定 性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。
1.分离原理
液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互 不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱 的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差 速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。
2.固定相 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种
总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并 用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已 被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋 白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质 的分离和分析。
.
2020/4/22
3
§6.1 HPLC的主要类型及选择
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高 灵敏度、高自动化。
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加， 例:分离苯的羟基化合物，7个组分只
分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠重 需1min就可完成。对氨基酸分离，用
力加料，完成一次分析需时数小时。
经 典 色 谱 法 ， 柱 长 约 170cm ， 柱 径
高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍均 0.9cm，流动相速度为30cm3·h-1，需
匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在数分 用20多小时才能分离出20种氨基酸；
钟内完成数百种物质的分离。
而用高效液相色谱法，只需lh之内即
高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10-9g, 可完成。
不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机械涂 渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相 色谱法的一个重大突破。最常用的强极性固定液β,β′---氧二丙睛，中等极性的聚乙 二醇，非极性的角鲨烷等。
.
2020/4/22
7
3．流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失，对流动相的一个基本要求
3.流动相
把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往 往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。洗脱 剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗脱剂 的极性越强。
.
2020/4/22
6
6.1.2液---液分配色谱法
在液---液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型的 分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和非 离子型的化合物。
当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要 吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要 它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动 相溶剂，于是，在固定相表面发生竞争吸附:
X + nSad 达平衡时,有
=
Xad
+
nS
Kad
[Xad][S]n [X][Sad]n
(2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生 相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性 的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分 作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控 制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗 脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。
.
2020/4/22
5
2.固定相 液---固吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附
剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容 量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等， 因此，以硅胶用得最多。