蛹虫草液体的深层发酵
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量５０ ｍＬ，调节初始ｐＨ至６．１０，２５℃培养５ ｄ，测 定菌丝体质量浓度和上层清液中甘露醇的浓度。
以菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度为分析指 标进行极差分析和方差分析口５｜。
由分析结果可知，碳源、氮源及无机离子的最
万方数据
时间／ｈ
１ ｐＨ；２一甘露醇质量浓度；３菌丝体质量浓度 图４不控制ｐＨ条件下发酵液ｐＨ、甘露醇浓度
收稿日期：２００６—０４一０７ 基金项目：国家自然基金创新研究群体科学基金资助项目（５０３２１４０２）；湖南省青年骨干教师基金资助项目（２００１年） 作者简介：周洪波（１９６９一），男，湖南湘潭人，博士，副教授，从事微生物工程研究 通讯作者：周洪波，男，博士；电话：０７３１－８８７７２１６（０）；Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｕｈｂ＠ｍａｉｌ．ＣＳＵ．ｅｄｕ．ＣＦＩ
蛹虫草又名北虫草、北冬虫夏草，属于子囊菌 亚ｆ－Ｉ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ），麦角菌科（Ｃ如机ｃｉ声ｉ抛ｃｅ口ｅ）， 虫草属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）的模式种，学名为Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ。蛹虫草在世界性分布天然资源数量很 少［１］。蛹虫草含有３０多种元素，主要活性物质包括 虫草素及甘露醇等，其含量与冬虫夏草含量类似。 大量研究结果表明：蛹虫草与冬虫夏草类似，具有
及菌丝体质量浓度随时间的变化 Ｆｉｇ．４ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＨ，ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｍａｎｎｉｔｏｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐＨ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ
由图４可得： ａ．菌丝体生长曲线和甘露醇质量浓度曲线呈正 相关关系，即随着菌丝体的生长，甘露醇质量浓度 随之增加；由此可以初步判断，甘露醇为生长偶联 型代谢产物。
采用自动流加２ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ或４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 控制ｐＨ值。 １．３．３ 茵丝体质量浓度的测定
取一定量的发酵液分装在离心管中，在转速为 ４ ０００ ｒ／ｍｉｎ条件下，离心２０～２５ ｍｉｎ。倾去上层清 液，用蒸馏水洗涤１次后，将沉淀置于７０℃烘箱中 烘至恒重再称量。 １．３．４甘露醇浓度的测定
图３培养时间对蛹虫草生长的影响 Ｆｉｇ．３ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ
ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ
２．１．４ 不同营养配方对蛹虫草生长的影响 通过不同碳源、氮源及无机离子配方，确定蛹
虫草的最适宜发酵培养基。 按表１配方配制９种培养基，２５０ ｍＬ摇瓶装液
关键词：蛹虫草；液体发酵；甘露醇；茵丝体
中图分类号：Ｑ９３９．５
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７２—７２０７（２００６）０６—１０９８—０５
Ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ
ＺＨＯＵ Ｈｏｎｇ—ｂｏ，ＸＩＡＯ Ｓｈｅｎｇ—ｍｕ，ＲＵＡＮ Ｃｈｅｎｇ—ｃｈａｏ，ＱＩＵ Ｇｕａｎ—ｚｈｏｕ
第３７卷第６期 ２００６年１２月
中南大学学报（自然科学版） Ｊ．ＣＥＮＴ．ＳＯＵＴＨ ＵＮＩＶ．（ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）
Ｖ０１．３７ ＮＯ．６ Ｄｅｃ． ２００６
蛹虫草液体的深层发酵
周洪波，肖升木，阮承超，邱冠周 （中南大学资源加工与生物工程学院，湖南长沙，４１００８３）
摘要：以茵丝体质量浓度（干重）和发酵液中甘露醇浓度为指标，研究温度、初始ｐＨ值、培养时间等因素对蛹虫草 液体培养的影响，得到蛹虫草摇瓶液体培养的最佳温度为２５．０。Ｃ，初始ｐＨ值为６．１０，培养时间为５ ｄ；蛹虫草液 体发酵最适培养基的组成为：２０ ｇ／Ｌ蔗糖＋５ ｇ／Ｌ蛋白胨＋１ ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ。·７ＨｚＯ。在此基础上进行小型分批式发 酵罐实验，研究有利于蛹虫草生长及活性物质生成的ｐＨ控制策略。研究结果表明，ｐＨ分段控制的液体深层发酵 对蛹虫草生长最为有利，茵丝体质量浓度为１７．３１ ｇ／Ｌ，甘露醇质量浓度达４３．４７ ｇ／Ｌ。
将培养基的初始ｐＨ值分别调至４．１０，４．９０， ５．３０，５．７０，６．１０，６．４０和６．８０，进行３组平行实 验。培养４ ｄ后测定菌丝体质量浓度，结果如图２所 示。
刘丽丽等［１５３的研究结果表明：菌体生长速度随 着初始ｐＨ值的升高而加快，在发酵起始ｐＨ值为中 性时生长最好。但本实验结果表明，当液体培养基的 初始ｐＨ值为６．１０时，菌丝体质量浓度最高（１０．６３ ｇ／Ｌ）；当ｐＨ值为中性时，不利于菌丝体生长。 ２．１．３ 培养时间的确定
在培养时间分别为１，２，３，４，５和６ ｄ，培养 温度为２５℃，ｐＨ一６．１０时进行３组平行实验，测
万方数据
中南大学学报（自然科学版）
第３７卷
定蛹虫草发酵液的菌丝体质量浓度，结果如图３所 示。可见，在前５ ｄ的培养过程中，菌丝体质量浓度 逐渐增加，尤其是第２～３ ｄ菌丝体质量浓度呈直线 上升。随后菌丝体质量浓度增长减慢，基本处于稳 定期，生长第５ ｄ即培养时间为１２０ ｈ达到最大 （１７．１３ ｇ／Ｌ）。继续培养，产生菌丝体自溶现象，且 菌丝体质量浓度开始下降，开始进入衰退期。
１．１ 菌种 蛹虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）菌种由中南大学
生物冶金教育部重点实验室提供。 １．２培养基
固体斜面ＰＤＡ培养基组成为２００ ｇ／Ｌ马铃薯（去 皮）＋２０ ｇ／Ｌ葡萄糖＋１５ ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ值不控制。
液体种子培养基组成为［１¨：２０ ｇ／Ｌ蔗糖＋ ２０ ｇ／Ｌ蛋白胨＋０．５ ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ。·７Ｈ：Ｏ，１ ｇ／Ｌ ＫＨｚＰＯ。，ｐＨ值不控制。
ｐＨ值出现这种变化，可能是随着菌丝体的生 长，分泌胞外活性物质如有机酸和甘露醇等，使得 发酵液的ｐＨ值下降；当菌丝体质量浓度和甘露醇 质量浓度达到最大后，由于培养基中养分耗尽，菌 丝体开始自溶，开始利用有机酸及甘露醇等作为碳 源，ｐＨ上升。 ２．２．２恒定ｐＨ发酵
由以上实验结果可知，初始ｐＨ为６．１０时最适 合菌丝体生长。运用自动流加酸碱的方法控制ｐＨ 恒定在６．１０，其他实验条件不变进行发酵实验。实 验结果如图５和图６所示。可见，将初始ｐＨ控制 为６．１０在发酵初期有利于菌丝体生长，但一直恒定 控制ｐＨ为６．１０并不利于菌丝体的生长和甘露醇 的生成。 ２．２．３分段控制ｐＨ发酵
这里考察的活性产物为甘露醇。分别取稀释至 一定浓度的样品１ ｍＬ及空白液１ ｍＬ，置于不同的 比色管中，用比色法ｍ１测定样品的吸光度，并计算 样品中甘露醇的质量浓度。
２结果
２．１摇瓶实验 ２．１．１ 最适宜温度的确定
分别选择２０，２２，２５，２７和３０℃５种不同的 温度进行３组平行实验。在５００ ｍＬ摇瓶中装入培 养基１００ ｍＬ，接种量为５％，摇床转速为１４０ ｒ／ｍｉｎ，培养４ ｄ，观察蛹虫草的生长情况。４ ｄ后， 测量菌丝体质量浓度，结果如图１所示。
多种功能，对人体具有明显的保护作用，可以作为 冬虫夏草的替代品［２曲］。
目前，蛹虫草生产仍以固体栽培为主，液体深 层发酵研究的时问不长，许多培养条件如培养周期 等的研究还不成熟［７］，但是，液体发酵具有许多如 培养周期短、活性物质易于提取的优点，很多药用 真菌液体发酵的活性物含量虫草液体的深层发酵
真菌的活性物含量，所提取的活性物含量约为人工 栽培活性物含量的１０倍多［１ ０｜。为此，本文作者研 究蛹虫草的液体深层发酵条件。在单因素优化实验 的基础上，进行小型分批式发酵罐实验，研究有利 于蛹虫草生长及活性物质（甘露醇）生产的ｐＨ控制 策略。
１材料与方法
发酵培养基组成为：２０ ｇ／Ｌ蔗糖３－－１０ ｇ／Ｌ蛋白 胨＋０．５ ｇ／Ｌ ＭｇＳ０４·７Ｈ２０＋１ ｇ／Ｌ ＫＨ２Ｐ０４，ｐＨ 值根据不同实验要求进行调节。 １．３实验方法 １．３．１培养条件及方法
摇瓶培养基本条件：摇床转速为１４０ ｒ／ｍｉｎ，温 度为２５℃，培养时间为５ ｄ。
发酵罐培养基本条件：在容积为１０Ｌ的微生物 发酵罐中装入６ Ｌ液体培养基，液体接种量为５％ （体积分数），摇床转速为１５０ ｒ／ｍｉｎ，通气量为２５０ ～３００ Ｌ／ｈ，温度为２５℃，培养时问为５ ｄ。每隔８ ｈ取样１次，每次取样１００ ｍＬ，测定菌丝体质量浓 度和上层清液中甘露醇的质量浓度。 １．３．２ ｐＨ控制
第６期
周洪波，等：蛹虫草液体的深层发酵
ｂ．接种约８０ ｈ后，甘露醇质量浓度和菌丝体 质量浓度均达到最大值，比陈晋安等口６３报道的菌丝 体质量浓度达到最大值时间（１４４ ｈ）大大缩短。
Ｃ．在不控制ｐＨ发酵条件下，发酵液的ｐＨ先 下降而后上升；当ｐＨ约为５．５时，菌丝体质量浓 度和甘露醇质量浓度均达到最大。
佳配方为：２０ ｇ／Ｌ蔗糖＋５ ｇ／Ｌ蛋白胨＋１ ｇ／Ｌ ＭｇＳ０４·７Ｈ２０。
Ｔａｂｌｅ １
表１ 蛹虫草培养基配方
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ
Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ
ｐ／（ｇ·Ｌ－１）
， ■
钿
≤ 蝗 划 波 苦
图２初始ｐＨ对蛹虫草生长的影响 Ｆｉｇ．２ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ
Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ
，
Ｌ 钿 ≤ 醺 划 坦 ≮
２．２小型发酵罐分批发酵实验 发酵液ｐＨ对微生物的生长和代谢具有重要影
响。因此，在摇瓶发酵实验结果的基础上，考察蛹 虫草在小型发酵罐中发酵的ｐＨ控制策略。 ２．２．１不控制ｐＨ发酵
在实验中不控制ｐＨ，每隔８ ｈ取样１次，每次 取样１００ ｍＩ。，测定菌丝体质量浓度和上层清液中甘 露醇的浓度，结果如图４所示。
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａｌｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎ百ｎｅｅ“ｎｇ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００８３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａ— ｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：２５．０℃，ｐＨ ６．１０ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ５ ｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎ ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｗａｓ ａｌｓｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：２０ ｇ／Ｌ ｓｕｃｒｏｓｅ＋５ ｇ／Ｌ ｐｅｐｔｏｎｅ＋１ ｇ／Ｌ ＭｇＳ０４·７Ｈ２０．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ １ ２ Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔａｎｋ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ｖａｌｕｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ａ ｔｗｏ—ｓｔａｇｅ ｐＨ ｅｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｓ ｂｅｓｔ ｆｏｒ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ．Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅａｃｈ １７．３１ ｇ／Ｌ ａｎｄ ４３．４７ ｇ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ；ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｍａｎｎｉｔｏｌ；ｂｉｏｍａｓｓ
三－、
■
孙
≤ 蛙 划 酒 苦
Ｆｉｇ．１
图１温度对蛹虫草生长的影响 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ
ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ
徐桂香等［１３。１４］：蛹虫草在温度为１５～３０℃时 都能生长，但温度明显影响蛹虫草的生长速度，且 在２８℃其生长速度最快。本实验结果表明：蛹虫草 在２０～３０℃时都能生长，且在２５℃左右时其生长 情况最好，所得菌丝体质量浓度最高（１９．１５ ｇ／Ｌ）。 因此，选择２５℃对蛹虫草进行培养。 ２．１．２初始ｐＨ值对蛹虫草生长的影响
以菌丝体质量浓度和甘露醇质量浓度为分析指 标进行极差分析和方差分析口５｜。
由分析结果可知，碳源、氮源及无机离子的最
万方数据
时间／ｈ
１ ｐＨ；２一甘露醇质量浓度；３菌丝体质量浓度 图４不控制ｐＨ条件下发酵液ｐＨ、甘露醇浓度
收稿日期：２００６—０４一０７ 基金项目：国家自然基金创新研究群体科学基金资助项目（５０３２１４０２）；湖南省青年骨干教师基金资助项目（２００１年） 作者简介：周洪波（１９６９一），男，湖南湘潭人，博士，副教授，从事微生物工程研究 通讯作者：周洪波，男，博士；电话：０７３１－８８７７２１６（０）；Ｅｍａｉｌ：ｚｈｏｕｈｂ＠ｍａｉｌ．ＣＳＵ．ｅｄｕ．ＣＦＩ
蛹虫草又名北虫草、北冬虫夏草，属于子囊菌 亚ｆ－Ｉ（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ），麦角菌科（Ｃ如机ｃｉ声ｉ抛ｃｅ口ｅ）， 虫草属（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ）的模式种，学名为Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ。蛹虫草在世界性分布天然资源数量很 少［１］。蛹虫草含有３０多种元素，主要活性物质包括 虫草素及甘露醇等，其含量与冬虫夏草含量类似。 大量研究结果表明：蛹虫草与冬虫夏草类似，具有
及菌丝体质量浓度随时间的变化 Ｆｉｇ．４ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＨ，ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｍａｎｎｉｔｏｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ ｗｉｔｈｏｕｔ ｐＨ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌ
由图４可得： ａ．菌丝体生长曲线和甘露醇质量浓度曲线呈正 相关关系，即随着菌丝体的生长，甘露醇质量浓度 随之增加；由此可以初步判断，甘露醇为生长偶联 型代谢产物。
采用自动流加２ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ或４ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ 控制ｐＨ值。 １．３．３ 茵丝体质量浓度的测定
取一定量的发酵液分装在离心管中，在转速为 ４ ０００ ｒ／ｍｉｎ条件下，离心２０～２５ ｍｉｎ。倾去上层清 液，用蒸馏水洗涤１次后，将沉淀置于７０℃烘箱中 烘至恒重再称量。 １．３．４甘露醇浓度的测定
图３培养时间对蛹虫草生长的影响 Ｆｉｇ．３ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ
ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ
２．１．４ 不同营养配方对蛹虫草生长的影响 通过不同碳源、氮源及无机离子配方，确定蛹
虫草的最适宜发酵培养基。 按表１配方配制９种培养基，２５０ ｍＬ摇瓶装液
关键词：蛹虫草；液体发酵；甘露醇；茵丝体
中图分类号：Ｑ９３９．５
文献标识码：Ａ
文章编号：１６７２—７２０７（２００６）０６—１０９８—０５
Ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ
ＺＨＯＵ Ｈｏｎｇ—ｂｏ，ＸＩＡＯ Ｓｈｅｎｇ—ｍｕ，ＲＵＡＮ Ｃｈｅｎｇ—ｃｈａｏ，ＱＩＵ Ｇｕａｎ—ｚｈｏｕ
第３７卷第６期 ２００６年１２月
中南大学学报（自然科学版） Ｊ．ＣＥＮＴ．ＳＯＵＴＨ ＵＮＩＶ．（ＳＣＩＥＮＣＥ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ）
Ｖ０１．３７ ＮＯ．６ Ｄｅｃ． ２００６
蛹虫草液体的深层发酵
周洪波，肖升木，阮承超，邱冠周 （中南大学资源加工与生物工程学院，湖南长沙，４１００８３）
摘要：以茵丝体质量浓度（干重）和发酵液中甘露醇浓度为指标，研究温度、初始ｐＨ值、培养时间等因素对蛹虫草 液体培养的影响，得到蛹虫草摇瓶液体培养的最佳温度为２５．０。Ｃ，初始ｐＨ值为６．１０，培养时间为５ ｄ；蛹虫草液 体发酵最适培养基的组成为：２０ ｇ／Ｌ蔗糖＋５ ｇ／Ｌ蛋白胨＋１ ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ。·７ＨｚＯ。在此基础上进行小型分批式发 酵罐实验，研究有利于蛹虫草生长及活性物质生成的ｐＨ控制策略。研究结果表明，ｐＨ分段控制的液体深层发酵 对蛹虫草生长最为有利，茵丝体质量浓度为１７．３１ ｇ／Ｌ，甘露醇质量浓度达４３．４７ ｇ／Ｌ。
将培养基的初始ｐＨ值分别调至４．１０，４．９０， ５．３０，５．７０，６．１０，６．４０和６．８０，进行３组平行实 验。培养４ ｄ后测定菌丝体质量浓度，结果如图２所 示。
刘丽丽等［１５３的研究结果表明：菌体生长速度随 着初始ｐＨ值的升高而加快，在发酵起始ｐＨ值为中 性时生长最好。但本实验结果表明，当液体培养基的 初始ｐＨ值为６．１０时，菌丝体质量浓度最高（１０．６３ ｇ／Ｌ）；当ｐＨ值为中性时，不利于菌丝体生长。 ２．１．３ 培养时间的确定
在培养时间分别为１，２，３，４，５和６ ｄ，培养 温度为２５℃，ｐＨ一６．１０时进行３组平行实验，测
万方数据
中南大学学报（自然科学版）
第３７卷
定蛹虫草发酵液的菌丝体质量浓度，结果如图３所 示。可见，在前５ ｄ的培养过程中，菌丝体质量浓度 逐渐增加，尤其是第２～３ ｄ菌丝体质量浓度呈直线 上升。随后菌丝体质量浓度增长减慢，基本处于稳 定期，生长第５ ｄ即培养时间为１２０ ｈ达到最大 （１７．１３ ｇ／Ｌ）。继续培养，产生菌丝体自溶现象，且 菌丝体质量浓度开始下降，开始进入衰退期。
１．１ 菌种 蛹虫草（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）菌种由中南大学
生物冶金教育部重点实验室提供。 １．２培养基
固体斜面ＰＤＡ培养基组成为２００ ｇ／Ｌ马铃薯（去 皮）＋２０ ｇ／Ｌ葡萄糖＋１５ ｇ／Ｌ琼脂，ｐＨ值不控制。
液体种子培养基组成为［１¨：２０ ｇ／Ｌ蔗糖＋ ２０ ｇ／Ｌ蛋白胨＋０．５ ｇ／Ｌ ＭｇＳＯ。·７Ｈ：Ｏ，１ ｇ／Ｌ ＫＨｚＰＯ。，ｐＨ值不控制。
ｐＨ值出现这种变化，可能是随着菌丝体的生 长，分泌胞外活性物质如有机酸和甘露醇等，使得 发酵液的ｐＨ值下降；当菌丝体质量浓度和甘露醇 质量浓度达到最大后，由于培养基中养分耗尽，菌 丝体开始自溶，开始利用有机酸及甘露醇等作为碳 源，ｐＨ上升。 ２．２．２恒定ｐＨ发酵
由以上实验结果可知，初始ｐＨ为６．１０时最适 合菌丝体生长。运用自动流加酸碱的方法控制ｐＨ 恒定在６．１０，其他实验条件不变进行发酵实验。实 验结果如图５和图６所示。可见，将初始ｐＨ控制 为６．１０在发酵初期有利于菌丝体生长，但一直恒定 控制ｐＨ为６．１０并不利于菌丝体的生长和甘露醇 的生成。 ２．２．３分段控制ｐＨ发酵
这里考察的活性产物为甘露醇。分别取稀释至 一定浓度的样品１ ｍＬ及空白液１ ｍＬ，置于不同的 比色管中，用比色法ｍ１测定样品的吸光度，并计算 样品中甘露醇的质量浓度。
２结果
２．１摇瓶实验 ２．１．１ 最适宜温度的确定
分别选择２０，２２，２５，２７和３０℃５种不同的 温度进行３组平行实验。在５００ ｍＬ摇瓶中装入培 养基１００ ｍＬ，接种量为５％，摇床转速为１４０ ｒ／ｍｉｎ，培养４ ｄ，观察蛹虫草的生长情况。４ ｄ后， 测量菌丝体质量浓度，结果如图１所示。
多种功能，对人体具有明显的保护作用，可以作为 冬虫夏草的替代品［２曲］。
目前，蛹虫草生产仍以固体栽培为主，液体深 层发酵研究的时问不长，许多培养条件如培养周期 等的研究还不成熟［７］，但是，液体发酵具有许多如 培养周期短、活性物质易于提取的优点，很多药用 真菌液体发酵的活性物含量虫草液体的深层发酵
真菌的活性物含量，所提取的活性物含量约为人工 栽培活性物含量的１０倍多［１ ０｜。为此，本文作者研 究蛹虫草的液体深层发酵条件。在单因素优化实验 的基础上，进行小型分批式发酵罐实验，研究有利 于蛹虫草生长及活性物质（甘露醇）生产的ｐＨ控制 策略。
１材料与方法
发酵培养基组成为：２０ ｇ／Ｌ蔗糖３－－１０ ｇ／Ｌ蛋白 胨＋０．５ ｇ／Ｌ ＭｇＳ０４·７Ｈ２０＋１ ｇ／Ｌ ＫＨ２Ｐ０４，ｐＨ 值根据不同实验要求进行调节。 １．３实验方法 １．３．１培养条件及方法
摇瓶培养基本条件：摇床转速为１４０ ｒ／ｍｉｎ，温 度为２５℃，培养时间为５ ｄ。
发酵罐培养基本条件：在容积为１０Ｌ的微生物 发酵罐中装入６ Ｌ液体培养基，液体接种量为５％ （体积分数），摇床转速为１５０ ｒ／ｍｉｎ，通气量为２５０ ～３００ Ｌ／ｈ，温度为２５℃，培养时问为５ ｄ。每隔８ ｈ取样１次，每次取样１００ ｍＬ，测定菌丝体质量浓 度和上层清液中甘露醇的质量浓度。 １．３．２ ｐＨ控制
第６期
周洪波，等：蛹虫草液体的深层发酵
ｂ．接种约８０ ｈ后，甘露醇质量浓度和菌丝体 质量浓度均达到最大值，比陈晋安等口６３报道的菌丝 体质量浓度达到最大值时间（１４４ ｈ）大大缩短。
Ｃ．在不控制ｐＨ发酵条件下，发酵液的ｐＨ先 下降而后上升；当ｐＨ约为５．５时，菌丝体质量浓 度和甘露醇质量浓度均达到最大。
佳配方为：２０ ｇ／Ｌ蔗糖＋５ ｇ／Ｌ蛋白胨＋１ ｇ／Ｌ ＭｇＳ０４·７Ｈ２０。
Ｔａｂｌｅ １
表１ 蛹虫草培养基配方
Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ
Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ
ｐ／（ｇ·Ｌ－１）
， ■
钿
≤ 蝗 划 波 苦
图２初始ｐＨ对蛹虫草生长的影响 Ｆｉｇ．２ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ
Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ
，
Ｌ 钿 ≤ 醺 划 坦 ≮
２．２小型发酵罐分批发酵实验 发酵液ｐＨ对微生物的生长和代谢具有重要影
响。因此，在摇瓶发酵实验结果的基础上，考察蛹 虫草在小型发酵罐中发酵的ｐＨ控制策略。 ２．２．１不控制ｐＨ发酵
在实验中不控制ｐＨ，每隔８ ｈ取样１次，每次 取样１００ ｍＩ。，测定菌丝体质量浓度和上层清液中甘 露醇的浓度，结果如图４所示。
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｉｎｅｒａｌｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎ百ｎｅｅ“ｎｇ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１００８３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｉｎｉｔｉａｌ ｐＨ ｖａｌｕｅ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａ— ｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｎ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：２５．０℃，ｐＨ ６．１０ ａｎｄ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ ５ ｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｍｅｄｉｕｍ ｉｎ ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ ｗａｓ ａｌｓｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｕｍ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｉｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ：２０ ｇ／Ｌ ｓｕｃｒｏｓｅ＋５ ｇ／Ｌ ｐｅｐｔｏｎｅ＋１ ｇ／Ｌ ＭｇＳ０４·７Ｈ２０．Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ａ １ ２ Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｔａｎｋ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐＨ ｖａｌｕｅ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ａ ｔｗｏ—ｓｔａｇｅ ｐＨ ｅｏｎｔｒｏｌ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｉｓ ｂｅｓｔ ｆｏｒ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｂａｔｃｈ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ．Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｉｏｍａｓｓ ａｎｄ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅａｃｈ １７．３１ ｇ／Ｌ ａｎｄ ４３．４７ ｇ／Ｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ；ｓｕｂｍｅｒｇｅｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｍａｎｎｉｔｏｌ；ｂｉｏｍａｓｓ
三－、
■
孙
≤ 蛙 划 酒 苦
Ｆｉｇ．１
图１温度对蛹虫草生长的影响 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｇｒｏｗｔｈ
ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｍｉｌｉｔａｒｉｓ
徐桂香等［１３。１４］：蛹虫草在温度为１５～３０℃时 都能生长，但温度明显影响蛹虫草的生长速度，且 在２８℃其生长速度最快。本实验结果表明：蛹虫草 在２０～３０℃时都能生长，且在２５℃左右时其生长 情况最好，所得菌丝体质量浓度最高（１９．１５ ｇ／Ｌ）。 因此，选择２５℃对蛹虫草进行培养。 ２．１．２初始ｐＨ值对蛹虫草生长的影响