盐酸埃克替尼对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制探讨

盐酸埃克替尼对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡的影响及其机制
探讨
王林梅;刘剑波;邵润霞;齐景宪;尚学琴
【摘要】目的观察盐酸埃克替尼对非小细胞肺癌PC-9细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制.方法取对数生长期的PC-9细胞,以40 μmol/L盐酸埃克替尼培养0、2、4、8、12、24h,以0、20、40、60、80 μmol/L的盐酸埃克替尼处理12 h,
采用MTT法检测细胞增殖活性;将对数生长期的PC-9细胞分为给药组和对照组,分别以40 μmol/L盐酸埃克替尼、DMSO处理8h,用流式细胞仪检测凋亡细胞并计
算凋亡率,Western blot法检测JAK2、p-JAK2、信号转导与激活因子3(STAT3)、p-STAT3和血管内皮生长因子(VEGF)蛋白,细胞免疫荧光技术观察并计算STAT3
入核细胞百分率.结果随着盐酸埃克替尼浓度的增加及作用时间的延长,PC-9细胞
增殖活性逐渐降低,40、60、80μmol/L与0μmol/L比较,8、12、24 h与0h比较,P均＜0.05.给药组PC-9细胞凋亡率3.70％±0.39％,明显高于对照组的1.40％±0.21％,P＜0.05.与对照组比较,给药组p-JAK2、p-STAT3相对表达量均减少(P
均＜0.05),VEGF蛋白相对表达量亦减少(P＜0.01).给药组STAT3入核细胞百分率
为36.48％±2.12％,低于对照组的86.56％±1.82％ (P＜0.01).结论盐酸埃克替尼
可抑制非小细胞肺癌细胞增殖,促进细胞凋亡;其可能通过抑制JAK2-STAT3信号通路活性及STAT3入核,并下调VEGF蛋白表达发挥作用.
【期刊名称】《山东医药》
【年(卷),期】2016(056)038
【总页数】4页(P9-12)
【关键词】非小细胞肺癌;PC-9细胞;盐酸埃克替尼;细胞增殖;细胞凋亡;信号通路;血管内皮生长因子
【作者】王林梅;刘剑波;邵润霞;齐景宪;尚学琴
【作者单位】郑州大学第二附属医院,郑州450014;郑州大学第二附属医院,郑州450014;郑州大学第二附属医院,郑州450014;郑州大学第二附属医院,郑州450014;昆明市第二人民医院
【正文语种】中文
【中图分类】R915
随着环境污染的加重，肺癌成为世界范围的一个主要致命性癌症，特别是非小细胞肺癌(NSCLC)，其5年存活率极低[1]。

由于放疗的不良反应[2]，目前NSCLC患者主要以药物作为一线治疗方案[3, 4]。

体外研究发现，盐酸埃克替尼可抑制人肿瘤细胞系的生长，尤其是对表皮生长因子受体(EGFR) 高表达的细胞[5]。

在上皮细胞性肿瘤如肺癌中EGFR多呈高表达[6，7]，因此EGFR通常作为NSCLC的有效治疗靶点。

盐酸埃克替尼作为我国完全自主产权的一种选择性EGFR酪氨酸激酶抑制剂，已经顺利通过药代动力学以及Ⅰ期临床试验，但对其治疗机制目前尚不清楚[8～11]。

信号转导与激活因子3(STAT3)通常作为一个转录因子促进细胞的增殖以及血管增生，抑制细胞凋亡[12]。

在肿瘤组织如胃癌、肺癌以及乳腺癌中，STAT3高表达最终促进肿瘤细胞的侵袭和转移[13, 14]。

因此，STAT3多作为判断肿瘤预后的指标[15，16]。

上游激酶JAK 磷酸化可激活STAT3并使其进入细胞核，从而促进肿瘤细胞的增殖和转移。

因此，JAK2-STAT3信号通路常作为肿瘤药物治疗的靶分子。

血管内皮生长因子(VEGF)是诱导肿瘤血管形成作用最强、特异性最高的血管
生长因子，在肿瘤的生成及侵袭转移中发挥重要作用。

2014年6月～2015年12月，我们观察了盐酸埃克替尼对NSCLC细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其机制。

1.1 材料 NSCLC细胞株PC-9细胞购自中科院上海细胞库，盐酸埃克替尼购自浙
江贝达药业有限公司；胎牛血清(Gibco公司)，DMEM培养基(Thermo公司)；四甲基偶氮唑盐(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自Sigma公司；PVDF膜(Millipore
公司)，JAK2抗体、p-JAK2抗体、STAT3抗体、p-STAT3抗体和VEGF抗体购
自上海银海圣生物科技有限公司；增强化学发光试剂盒(Pierce公司)；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海银海圣生物科技有限公司)；微量移液器(Eppendorf公司)，垂直电泳槽(Bio-Rad公司)，水平摇床(华利达实验设备公司)，冷冻式离心机(Eppendorf公司)；PCR仪(Bio-Rad公司)，实时荧光定量PCR系
统ABI7500(Applied Biosystems公司)；细胞培养超净台和细胞培养箱(Thermo Scientific公司)，倒置显微镜(Olympus公司)，激光扫描共聚焦显微镜(Nikon公司)。

1.2 实验方法
1.2.1 PC-9细胞培养将PC-9细胞静置培养于37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中，DMEM培养基中含有10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的
链霉素。

当细胞融合度约80%时，用Trypsin-EDTA消化2 min，以1∶3传代。

1.2.2 PC-9细胞增殖活性观察采用MTT法。

①盐酸埃克替尼不同时间点处理肺
癌PC-9细胞：取对数生长期的PC-9细胞，用Trypsin-EDTA消化成细胞悬液；将细胞接种12孔板，2×104/孔。

待细胞贴壁后以含有40 μmol/L盐酸埃克替尼的DMEM培养基培养0、2、4、8、12、24 h。

②不同浓度盐酸埃克替尼处理肺癌PC-9细胞：取对数生长期的PC-9细胞，用Trypsin-EDTA消化成细胞悬液；将细胞接种于24孔板中，1×104/孔。

待细胞贴壁后分别予以0、20、40、60、80 μmol/L的盐酸埃克替尼孵育处理12 h。

将不同浓度盐酸埃克替尼作用不同时
点的PC-9细胞消化成细胞悬液，均匀接种于96 孔板，每孔200 μL，每组设6
个复孔及1个空白孔。

细胞贴壁后，在避光条件下每孔加入100 μL的MTT溶液(1 mg/mL)继续培养4 h；每孔加入200 μL DMSO，室温下放置30 min，在酶
联免疫检测仪上测定570 nm各孔的光密度(OD)值，以各孔与空白孔OD比值的
百分数表示细胞的增殖活性。

1.2.3 PC-9细胞凋亡情况观察采用流式细胞仪检测。

取对数生长期的PC-9细胞，用Trypsin-EDTA消化成细胞悬液，将细胞接种于12孔板中。

对照组用DMSO
处理8 h，给药组用含40 μmol/L盐酸埃克替尼处理8 h；用不含EDTA的胰酶消化细胞，1 000 g离心5 min，弃掉上清，加入2 400 μL 1×Binding Buffer轻轻重悬细胞；加入5 μL AnnexinV-FITC，室温避光染色15 min。

加入10 μL PI染
色液，避光染色5 min后进行流式细胞仪检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.2.4 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3和VEGF蛋白检测采用Western blot 法。

将细胞分为给药组和对照组，分别采用40 μmol/L盐酸埃克替尼、DMSO处理8 h；收集细胞，用800 μL RIPA裂解液裂解细胞；4 ℃下以15 000 g离心20 min，吸取500 μL上清液转至另一新的1.5 mL 离心管中。

将蛋白样品和6×SDS 上样缓冲液按5∶1混合，100 ℃加热样品10 min使蛋白充分变性。

在电泳槽中
加入电泳缓冲液，将蛋白样品上样于SDS-PAGE胶孔中，电压80 V直至目标蛋
白样品跑至玻璃板中下1/3停止电泳。

去除分离胶，将基层胶放入转膜三明治；
设定电压110 V，计时95 min进行转膜。

转膜后用5%脱脂奶粉封闭缓冲液封闭，用相应的一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h后进行胶片的压片检测。

用图像
处理软件裁取目标条带，以Image J软件测定各条带的光密度(OD)值。

以目的条
带与内参Tubulin条带OD比值表示目的蛋白相对表达量。

1.2.5 STAT3核移位情况观察采用细胞免疫荧光技术。

取对数生长期的PC-9细胞，用Trypsin-EDTA消化成细胞悬液，将细胞接种于底部已放置细胞玻片的12孔板
中。

待细胞在玻片上生长融合到70%时，对照组采用DMSO处理，给药组采用
40 μmol/L盐酸埃克替尼处理；8 h后用预冷的PBS洗涤细胞，4%甲醛固定20 min，0.2%Triton X-100透化3 min；然后用5% BSA室温封闭30 min，在湿
盒里一抗孵育2 h后加入二抗避光孵育1 h；最后滴加DAPI避光孵育5 min对标本进行染核，95%甘油封片后在激光共聚焦显微镜下观察。

STAT3在细胞中呈绿
色荧光，计算入核细胞百分率。

1.3 统计学方法采用SPSS20.0统计软件。

计量资料以±s表示，数据比较采用方
差分析及q检验。

P<0.05为差异有统计学意义。

2.1 盐酸埃克替尼对肺癌PC-9细胞活性的影响用0、20、40、60、80 μmol/L
盐酸埃克替尼作用12 h后，PC-9细胞增殖活性分别为98.72%±1.02%、
76.23%±2.14%、62.49%±3.91%、43.12%±2.99%、34.28%±3.03%，40、60、80 μmol/L与0 μmol/L比较P均< 0.05；40 μmol/L盐酸埃克替尼作用0、2、4、8、12、24 h，PC-9细胞增殖活性分别为98.51%±0.81%、86.55%±3.11%、73.24%±2.31%、35.61%±2.43%、2.45%±1.93%，8、12、24 h与0 h比较P 均<0.05。

2.2 盐酸埃克替尼对肺癌PC-9细胞凋亡的影响给药组PC-9细胞凋亡率
3.70%±0.39%，明显高于对照组的1.40%±0.21%，P<0.05。

2.3 盐酸埃克替尼对肺癌PC-9细胞JAK2-STAT3信号通路及VEGF蛋白表达的影响与对照组相比，给药组肺癌PC-9细胞p-JAK2、p-STAT3相对表达量均减少(P均<0.05)，VEGF蛋白相对表达量亦减少(P<0.01)。

见表1。

2.4 盐酸埃克替尼对STAT3核移位的影响给药组STAT3入核细胞百分率为
36.48%±2.12%，低于对照组的86.56%±1.82%(P<0.01)。

VEGF又名血管穿透因子，作为一种血管内皮细胞生长因子，该因子的发现为后期大量关于抑制癌症血管化的研究奠定了基础。

在肿瘤微环境中，VEGF还可作为应
激生长因子，作为炎症和肿瘤生长之间的桥梁。

其发挥促进肿瘤生长作用，主要是通过炎症转录因子促进肿瘤细胞的生长、黏附以及侵袭、趋化作用。

因此，VEGF
在肿瘤中的作用并不仅限于促进肿瘤组织的血管化。

众多研究表明，在肿瘤组织中多存在STAT3的过度激活，且抑制STAT3活性可以促进肿瘤细胞凋亡[17]。

但是，对于STAT3的促癌机制目前尚不清楚，尤其是JAK-STAT3信号通路和盐酸埃克
替尼抗癌之间的机制关联，这也是本研究主要探讨的关键点。

本研究主要探讨盐酸埃克替尼对肺癌PC-9细胞增殖、凋亡的影响及机制，结果发现随着盐酸埃克替尼浓度增加和作用时间的延长，其对肺癌PC-9细胞增殖活性的抑制作用增强。

有研究表明，JAK2-STAT3信号通路参与调控肿瘤细胞的凋亡、
分化以及自噬[18,19]。

因此，我们观察了盐酸埃克替尼对肺癌PC-9细胞活性的
抑制作用是否与JAK2-STAT3信号通路具有一定的机制关联。

Western blot检测结果显示，盐酸埃克替尼能够降低p-JAK2、p-STAT3的表达，说明其可通过抑制JAK2和STAT3的磷酸化抑制该通路的激活。

STAT3作为转录因子，其细胞定位
对于其功能的发挥具有重要作用[17]。

我们通过细胞免疫荧光技术检测了STAT3
蛋白的细胞定位，发现盐酸埃克替尼可抑制STAT3的核内移位。

然而，转录因子STAT3的核内含量减少是否与肺癌PC-9细胞的凋亡有关呢? Jiang等[17]研究发现，STAT3和低氧诱导因子1(HIF-1)协同作用，转录结合VEGF启动子区并上调VEGF的转录表达。

本研究结果表明，盐酸埃克替尼在降低JAK2-STAT3信号通
路相关蛋白的同时，VEGF蛋白表达也显著降低。

说明盐酸埃克替尼可通过抑制JAK2-STAT3信号通路的活性，从而下调VEGF蛋白的表达，进而抑制肿瘤细胞
的增殖活性，并促进其凋亡。

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