小麦叶片胞间洗脱液的蛋白质组学检测分析

小麦叶片胞间洗脱液的蛋白质组学检测分析
胡新明;杨友才;潘映红
【摘要】植物叶片胞间液蛋白主要是一些低丰度蛋白,其中某些种类在植物抗病反应中起着重要的作用.通过改进已有的技术方法,结合超滤和丙酮沉淀处理,从500 9抗条锈病近等基因系小麦Taichung29*6/Yr5的叶片中获得了1.5mg可溶性的胞间洗脱液蛋白.SDS-PAGE电泳分析显示,胞间洗脱液蛋白样品和总蛋白样品存在着明显的差异.进一步的双向电泳分析证实,两个样品在胶图上可分别检测到1
241±59(n ＝3)和1 849±138(n ＝3)个蛋白点,其中胞间洗脱液样品有1
042±47(n ＝3)个不同于总蛋白样品的蛋白点,与总蛋白样品共有的蛋白点仅
198±13(n ＝3)个.随意取100个差异蛋白点进行MALDI-TOF质谱分析,鉴定到一些已被确证存在于小麦胞间液中的蛋白质,如β-1,3-萄聚糖酶、葡聚糖-β-D-1,3-葡萄糖苷内切酶、几丁质酶、过氧化物酶等.从蛋白质组学角度初步分析了小麦叶片胞间洗脱液的组成,为进一步探索小麦叶片胞间液中低丰度蛋白的抗病功能提供依据.
【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2011(000)008
【总页数】8页(P91-98)
【关键词】小麦;叶片;胞间洗脱液;蛋白质组学;双向电泳
【作者】胡新明;杨友才;潘映红
【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院,长沙410128;中国农业科学院作物科学研究所国家农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程,北京100081;湖南
农业大学生物科学技术学院,长沙410128;中国农业科学院作物科学研究所国家农
作物基因资源与基因改良国家重大科学工程,北京100081
【正文语种】中文
细胞间隙液(Intercellular fluid，IF)，简称胞间液，是指存在于细胞与细胞之间的非原质液体，其中包含多种在生物体生长发育、物质运输、信号转导、防卫反应等过程中发挥着关键作用的蛋白质。

当病原菌侵染植物时，病原菌会在胞间与寄主发生相互作用，产生一些肽酶和激发子之类的物质，启动植物级联信号系统，调控防卫基因表达［1］。

因此，植物胞间液研究对深入了解植物的抗病性具有重要意义。

对植物胞间液的研究主要是采用低渗透―离心方法制备胞间洗脱液(intercellular washing fluid，IWF)后进行组成和功能分析［2–5］。

早年［6，7］通过比较分
析接种条锈菌前后的小麦、大麦叶片胞间液，检测到至少10种病程相关性蛋白。

随着胞间液制备方法的改进和蛋白质质谱检测新技术的应用，更多的病程相关性蛋白和一些其它蛋白被陆续发现，如奇异果甜蛋白类似蛋白、β-1，3-葡聚糖酶［4］、葡聚糖-β-D-1，3-葡萄糖苷内切酶、几丁质酶［8］、过氧化物酶、糖苷
酶［7］、类萌发素蛋白等。

此外，对植物胞间的其他物质如脱落酸［10］、抗坏血酸盐［11，12］、磷脂质［13］、过氧化物［14］等也有较多的研究。

植物叶片胞间液的研究将会成为植物生理学和植物病理学的热点领域之一。

在小麦与病原菌的相互作用中，叶片胞间液蛋白无疑是极为关键的角色。

为了深入了解小麦叶片胞间液蛋白的组成和功能，本研究以小麦叶片总蛋白为对照进行了初步的蛋白质组学检测分析。

1.1.1 材料来源小麦抗条锈病近等基因系Taichung29*6/Yr5，由中国农业科学院
植物保护研究所条锈病组繁殖培养。

1.1.2 材料的培养小麦种子经浸种、催芽后种于口径50×100 cm塑料盆中，置于
自控温室中(温度昼15－20℃/夜11－14℃，光照强度6 000 Lx，光照时间12 h)，直到幼苗在温室内培养至1叶期。

1.1.3 主要仪器和试剂试验所用的仪器和试剂列于表1。

1.2.1 小麦总蛋白的提取称取新鲜1叶期小麦叶片5 g加入100 mg PVPP-40液
氮研磨成粉，至少研磨20 min使得叶片成粉末状，将研磨好的叶片粉末倒入250 mL离心管中，加入200 mL冰丙酮(含2%DTT和10%TCA)－20℃过夜(至少12 h)。

离心(4℃，40 000×g，1 h)弃上清，往沉淀加入200 mL的冰丙酮(含2%的DTT)放入－20℃冰箱中1 h(中间取出震荡3次)后离心，重复3次。

彻底去除沉
淀里含有的TCA等杂质，去除多余的丙酮溶液，并用氮气将沉淀物吹干，沉淀即
为粗蛋白样品。

如果样品长期保存则放入－80℃冰箱保存。

1.2.2 小麦胞间液蛋白的提取参考白婷等［15］的方法，取新鲜1叶期的小麦幼苗叶片500 g，去除叶尖，将叶片切成4 cm左右的小段，取适量长度塑料膜包裹好小麦叶片然后扎成小束;用4℃的去离子水清洗1次，4℃的50 mmol/L的乙酸钠
缓冲液(pH8.8)清洗叶片表面和切口两遍;将叶片束全部浸入4℃的50 mmol/L的
乙酸钠缓冲液中低温负压渗透(－20 Kpa)处理20 min至缓冲液渗入叶片;取出叶片束，静置4℃中滤去大量附着液，再将其直立放置在特制的带垫板的50 mL离心
管中离心(4℃，30×g，5 min)，用以甩干附着在叶片表面的水分、切口破碎细胞
流出的胞内物质和一些杂质等;取出小麦束放入新的离心管中以较高的离心力离心(4℃，2 000×g，15 min)并收集离心管底部胞间液;收集到的胞间液通过超滤系统浓缩(5K孔径的超滤膜)，除去盐类等小分子杂质，浓缩后的样品按照TCA/丙酮沉淀法提取蛋白，放入－80℃冰箱保存。

1.2.3 2-DE分离蛋白及染色取蛋白干粉分
别溶于裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，4%CHAPS，40 mmol/L DTT，
2%IPG缓冲液，40 mmol/L Trisbase)中，超声促溶30 min后常温下裂解蛋白1 h后离心(20℃，40 000×g，1 h)，去除沉淀杂质取上清液继续离心(20℃，100
000×g，1 h)，取上清备用。

用2D-quant kit试剂盒蛋白定量，最终上样的蛋白含量为400 μg，聚焦程序，平衡以及第二向SDSPAGE参照Amersham Biosciences的双向电泳试验手册的方法，稍加改进，采用主动水化方式，最终达到100 000 Vh。

采用银染试剂盒进行染色。

1.2.4 图像采集分析染色后的凝胶用Imagemaster Lab scan扫描仪以及Lab Scan扫描软件进行扫描获取图像，利用Image Master 2D Elite 6.0分析软件进行分析，图像分析过程包括强度校正、蛋白点检测、背景消减、凝胶匹配、相对分子量和等电点的确定。

1.2.5 胶内酶切从染色后的胶图中挖出重要蛋白点放入2 mL的离心管中，水洗两次;用30 mmol/L铁氰化钾和100 mmol/L的硫代硫酸钠按1∶1混合，每管中加入30－50 μL脱银;水洗3次，加入200 mmol/L的碳酸氢铵摇匀，脱色20 min 直到胶块颜色完全脱掉;脱色完全后加入50%乙腈脱水15 min，100%的乙腈脱水至胶粒白色;除去乙腈，置于真空离心蒸发浓缩器内，5－10 min使胶粒完全干燥;每管中加入约10 μL胰蛋白酶溶液至冰上1 h，使胶粒再水化，除去过量的胰蛋白酶溶液，加入最小量(10 μL)50 mmol/L的碳酸氢铵溶液覆盖胶粒，保持酶切使胶粒湿润，37℃放置过夜(大约16 h);将离心管中的胶粒和液体一起通过真空离心蒸发浓缩器蒸发干净，加入5%TFA，每孔30 μL，40℃温箱1 h，将液体移入新管中;加入2.5%TFA和50%ACN，30℃温箱1 h，将液体与上一次的提取液合并;真空旋转蒸发干燥液体，放置－80℃保存。

样品脱盐处理:首先在干燥的样品中加入10 μL 0.1%TFA水溶液，振荡，使样品充分溶解，然后用C18 ZipTips(Millipore)脱盐。

先用ZipTips吸取10 μL 50%ACN/0.1%TFA溶液润洗两次，再用
0.1%TFA溶液平衡4－5次;然后将ZipTips伸入样品溶液中反复吸进压出，再用0.1%TFA水溶液洗涤ZipTips 4－5次以除去盐类小分子;然后另取一小EP管吸入4 μL 50%ACN/0.1%TFA溶液，再将带有样品的ZipTips在其中反复洗脱，最后
将洗脱下来的样品真空浓缩至2－3 μL或干燥，脱盐后的样品可以－80℃保存或
直接用于质谱检测。

1.2.6 质谱检测和数据库检测参照陈平［16］点靶方式并作改进，配制溶液A:0.1%三氟乙酸(TFA)的50%乙腈(ACN)溶液，取一部分A溶液向每管酶切后的样品中加入1－2 μL溶解质谱样品;取一部分A溶液将α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)溶于该溶液中，充分混匀制成饱和溶液后离心(20℃，20 000×g，20 min)。

用进口枪头取基质溶液上清1 μL点到于质谱靶圆圈中心上，迅速用枪头吸取1 μL样品与靶
上的基质溶液充分混合，待干燥充分后，送入离子源中进行检测。

手动检测，并选择3次较好的质谱图叠加。

质谱分析后得出的肽质量指纹图谱数据和一些重要的
参数在数据库中寻找与这些参数相匹配的蛋白质。

小麦叶片通过TCA/丙酮沉淀，用裂解液溶解沉淀，通过定量试剂盒测出其蛋白浓度为7.84 mg/mL;小麦叶片胞间液蛋白浓度为3.34 mg/mL。

从5 g叶片中提取
出25 mg蛋白，500 g叶片中提取出1.5 mg胞间液蛋白。

通过计算得出小麦叶
片总蛋白的提取率约为0.5%，小麦胞间液蛋白的提取率约为0.0003%。

利用TCA/丙酮沉淀法提取的小麦叶片总蛋白和低温负压渗透处理后差速离心法提取的小麦叶片胞间液蛋白的SDS-PAGE分离分析结果见图1。

从图1中可以看出
小麦叶片总蛋白与小麦叶片胞间液蛋白有很显著的差异，胞间液蛋白得到明显富集。

2.3.1 双向电泳分析比较小麦叶片总蛋白和胞间洗脱液蛋白经过定量后进行双向电泳分离(图2)，第一维电泳采用24 cm pH4－7的IPG胶条，第二维SDS-PAGE
灌制浓度12.5%的凝胶，小麦叶片总蛋白和胞间液蛋白两组的2-DE试验平行重复3次。

将3次重复得到的总蛋白和胞间液蛋白的电泳图谱用Image Master 2D Elite 6.0软件进行统计分析后分别检测到1 849±138和1 241±59个蛋白点。

从图2可以看出，小麦叶片总蛋白和胞间液蛋白的差异性明显，不少在总蛋白难以
被检测到的蛋白点都能在胞间液提取样品中得到富集，并能通过质谱鉴定出其所属
蛋白类型。

2.3.2质谱鉴定结果从胶图中重要差异蛋白中任意抽取100个蛋白点进行质谱鉴定。

由于银染质谱鉴定技术的缺陷，质谱灵敏度的限制，以及小麦数据库的不完善，仅有35个差异点被准确鉴定出来，如表2所示。

另外30余个蛋白点指纹图谱较好
但是不能从数据库总得到匹配，其余30多个蛋白点由于含量达不到质谱检测的最低浓度所以未能测出。

植物细胞间隙液与植物的生长发育、抗病抗逆反应及其信号传导有密切关系。

前人曾深入研究过一些植物胞间液蛋白质，如烟草叶片胞间液中的几丁质酶和肽酶［17，18］、拟南芥胞间液中过氧化物酶［19－21］及苹果胞间液中病程相关性蛋白［22］等，发现这些胞间液蛋白在植物抗逆、抗病中起着至关重要的作用。

在小麦胞间液蛋白方面，也曾较深入分析过一些重要的功能性蛋白质，如过氧化物酶［14］、类萌发素蛋白［9］、类奇异果甜蛋白［23］等，尤其一些病程相关蛋白［6，7，22］。

本研究完善了小麦叶片胞间液蛋白分离分析体系，比较分析了
小麦叶片胞间液蛋白与总蛋白差异，在抗条锈病近等基因系Taichung29*6/Yr5
叶片胞间蛋白样品的胶图中检测到1 042±47个与叶片总蛋白样品不相同的蛋白点，从100个点中鉴定到几十个已被确证存在于小麦胞间液中的蛋白质，如葡聚
糖酶、葡聚糖苷酶、几丁质酶、过氧化物酶等。

上述结果显示，本研究采用的低温负压渗透―差速离心方法能有效提取存在于小麦胞间液中的低丰度蛋白。

低丰度蛋白可能在植物的抗逆过程中发挥着重要的作用，小麦叶片胞间液低丰度蛋白分析有望为深入研究小麦与条锈病的相互作用奠定重要的基础。

致谢:中国农业科学院植物保护研究所徐世昌研究员和冯晶副研究员为本研究提供
了试验材料和具体指导。

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