氨基酸分析方法的研究进展

表 1 柱前衍生反相高效液相色谱法分析氨基酸的衍生试剂 Table 1 Reagent of p re2column derivatization method used for am ino acid analysis by reversed phase liquid chromatography ( R P2H PLC)
目前 ,专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性阳离子交换树脂为柱填料 。该树脂是由 苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成 ,球状树脂的粒度一般在 5～10μm 之间 ,交联度多为 8% ～12%。 流动相一般采用 3～5种不同 pH 值的缓冲液 (柠檬酸钠或柠檬酸锂等 ) 。氨基酸的分离不仅受离子交 换树脂的型号 、交联度和粒度的影响 ,还受柱温 、洗脱缓冲液的阳离子类型 、pH、离子强度 、淋洗梯度 、流 速以及其中有机溶剂含量的影响 。
摘 要 对目前应用于氨基酸分析的主要方法作了较详细评述 。这些方法包括柱后衍生高效阳离子交换色 谱法 、柱前衍生反相高效液相色谱法 、高效阴离子交换色谱 2积分脉冲安培检测法等 。引用文献 73篇 。
关键词 氨基酸 ,色谱法 ,评述
1 引 言
迄今为止 ,自然界中已发现 180多种氨基酸 ,其中参与蛋白质合成的氨基酸只有 20多种 ,称为基本 氨基酸 。氨基酸主要有两种存在形式 ,一种是以游离态存在于生理体液 (血浆 、尿 ) 、食品 (酒 、饮料 )中 , 另一种是以结合态存在于肽和蛋白质中 。由于氨基酸分析在蛋白质化学 、生物化学 、食品科学 、临床医 学等领域的研究中起着重要的作用 ,因此 ,对氨基酸分析方法的研究与改进得到人们高度重视 。 1958 年 , Spackm an等 [1 ]首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基 酸 ,实现了氨基酸分析的自动化 。其后 ,人们不断地发展新的氨基酸分析方法 ,柱前衍生反相高效液相 色谱法 、高效阴离子交换色谱 2积分脉冲安培检测法等相继应用于氨基酸分析 。现已是多种氨基酸分析 方法并存 、互补 。本文就目前应用于氨基酸分析的主要方法作一综述 。
用 P ITC作柱前衍生试剂的氨基酸分析得到了广泛应用 。氨基酸与 P ITC反应生成苯氨基硫甲酰衍 生物 ( PTC) 。衍生物单一 、稳定 ,衍生反应速度快 。这种衍生物经 RP2HPLC分离后 ,用紫外检测 ( 254 nm ) 。检出限大约是 1 pmol。一 、二级氨基酸均可被测定 。 P ITC衍生法在仪器自动化方面也是可行的 。 此方法已拓展至含磷氨基酸 [ 17 ]和含硫氨基酸 [ 18 ]等修饰氨基酸的分析 。
文献 Reference
7 ～11 12～18 19～25 26～29
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Байду номын сангаас36, 37
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在还原剂 (β2巯基乙醇或 32巯基丙酸 ) 存在下 , OPA 与一级氨基酸发生衍生反应 ,衍生物在 RP2 HPLC柱上分离 ,根据衍生物荧光特性检测 。此方法在仪器自动化方面是可行的 。采用 OPA 衍生方法 可在 13 m in内 ,在亚 pmol水平 ,分离测定 23种主要生理氨基酸 [ 10 ] 。OPA 衍生法具有样品制备简单 、衍 生反应迅速 、灵敏度高及易于实现自动化操作等优点 。此方法的缺点是不能检测仲氨基酸及衍生物不 够稳定 。后者可通过在线自动衍生分析来克服 。
检测方法 D e tec tion 荧光 Fluor UV ( 254 nm ) 荧光 Fluor 荧光 Fluor, UV UV ( 365 nm ) UV ( 340 nm ) UV ( 360 nm ) UV , 荧光 Fluor 安培 Amperometry
荧光 Fluor
UV ( 280 nm ) 荧光 Fluor UV
第 33卷
分析化学 ( FENX I HUAXUE) 评述与进展
第 3期
2005年 3月
Chinese Journal of Analytical Chem istry
398～404
评述与进展
氨基酸分析方法的研究进展
于 泓 1, 2 牟世芬 3 1
1 (中国科学院生态环境研究中心 ,北京 100085) 2 (哈尔滨师范大学化学系 , 哈尔滨 150080)
为了提高分析灵敏度 ,用荧光胺代替茚三酮作柱后衍生试剂 ,采用荧光检测 ,可检测几个 pmol的氨 基酸 [3 ] 。荧光胺与氨反应的灵敏度比茚三酮与氨反应的灵敏度大约提高了 3个数量级 。这样 ,测定中
2003207216收稿 ; 2003211217接受 本文系国家重点基础研究计划 (973)项目 (No. 2003 CB415001)和国家自然科学基金 (No. 20475060)资助课题
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第 3期
于 泓等 :氨基酸分析方法的研究进展
993
受氨干扰程度较小 。但荧光胺不能直接与脯氨酸反应 ,需通过氧化打开脯氨酸的咪唑环才能衍生 [ 4 ] 。 在柱后衍生荧光检测中 ,邻苯二甲醛 (OPA )比荧光胺更常用 ,检出限一般可达 5～10 pmol[5 ] ,但需从样 品谱图中扣除 OPA 的本底吸收 [6 ] 。OPA 不能直接同脯氨酸反应 ,需将后者氧化开环后方可衍生 。
衍生试剂 R eagen t
邻苯二甲醛 o2Phthaldiadehyde (OPA ) 异硫氰酸苯酯 Phenylisothiocyanate ( P ITC) 氯甲酸芴甲酯 92Fluorenylmethyl chloroformate ( FMOC2Cl) 丹酰氯 12D imethylam inonaphthalene252sulphonyl chloride (Dansyl2Cl) 二硝基氟苯 12Fluoro22, 42dinitrobenzene ( FDNB ) 12氟 22, 42二硝基苯基 252L2丙氨酰胺 12Fluoro22, 42dinitrophenyl252L 2alanine am ide ( FDNPAA ) N , N 2二乙基 22, 42二硝基 252氟苯胺 N , N 2D iethyl22, 42dinitro252fluoroaniline ( FDNDEA ) 磺酰氯二甲胺偶氮苯 D imethylam inoazobenzene sulfonyl chloride (DABS2Cl) 萘二甲醛 Naphthalene22, 32dicarboxaldehyde (NDA ) 62氨基喹啉基 2N 2羟基琥珀酰亚氨基氨基甲酸酯 62Am inoquinolyl2N 2hydroxysuccinim idyl carbamate (AQC) 乙氧亚甲基丙二酸二乙酯 D iethyl ethoxymethylenemalonate (DEMM ) 12甲氧基羰基中氮茚 23, 52二甲醛 12Methoxycarbonylindolizine23, 52dicarbaldehyde ( IDA ) N 2羟基琥珀酰亚氨 2α2萘乙酸酯 N 2Hydroxysuccinim idyl2α2naphthylacetate ( SINA )
FMOC2Cl衍生法亦是一种常用的柱前衍生法 ,而且在仪器自动化方面也是可行的 。 FMOC2Cl可与 一级和二级氨基酸生成稳定的衍生物 。荧光检测灵敏度可达 fmol水平 。此方法的缺点是需要将反应 过程中剩余的衍生试剂萃取出以中止衍生反应 ,同时避免衍生物的分解 。另外 , FMOC2Cl与组氨酸形 成单 、双衍生物的比例不稳定 ,影响定量 。Dansyl2Cl与包括亚氨基在内的所有氨基酸均起反应 ,与组氨
衍生后的氨基酸一般在键合 C18柱上 ,根据液液分配原理进行分离 。流动相多以乙酸盐或磷酸盐缓 冲液为主 ,以乙腈 、甲醇或四氢氟喃为调节剂 。由于氨基酸衍生物仍保留着两性化合物的特点 ,故除改 变调节剂之外 ,还可通过调节缓冲液 pH 值 、离子强度 、柱温等使之达到理想的分离 。当然 ,不同衍生物 所选用的柱型 、流动相以及氨基酸的洗脱时间和顺序不尽相同 。柱前衍生反相高效液相色谱法可用于 分析蛋白质水解液 、生理体液和食品等样品中的氨基酸 。
RP2HPLC要求将氨基酸在柱前转化为适于反相色谱分离并能被灵敏检测的衍生物 。柱前衍生的 关键在于衍生试剂的选择 。选择衍生试剂的标准是能与各氨基酸定量反应 ,每种氨基酸只生成一种化 合物且产物有一定的稳定性 ,不产生或易于排除干扰物 ;操作简单 ,色谱分离分辨率高 ,检测灵敏度高 , 分析时间短 ,便于实现自动化和使产物能在不同型号的高效液相色谱仪上测定 。一些比较常用的柱前 衍生试剂列于表 1。主要的柱前衍生试剂有邻苯二甲醛 (O PA ) [ 7～11 ] 、异硫氰酸苯酯 ( P ITC) [ 12～18 ] 、氯甲 酸芴甲酯 ( FMOC2C l) [ 19～25 ]及丹酰氯 (D an syl2C l) 。 [ 26～29 ]
2 柱后衍生高效阳离子交换色谱法
高效阳离子交换色谱 (HPCEC) 2柱后茚三酮衍生光度检测分离测定氨基酸是一种经典的氨基酸分 析方法 。此方法是利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子而在阳离子交换柱中分离 ,分离后的氨基酸用 茚三酮衍生 、紫外可见光度检测器检测 。采用阳离子交换色谱分离 、柱后茚三酮衍生光度检测技术的商 品化的自动氨基酸分析仪在 20世纪 60年代初问世 。现在的自动氨基酸分析仪已实现了程控自动化和 数据处理电脑化 ,分析时间已缩短至 1 h以内 。
一些柱前衍生方法的主要特点总结于表 2。作为柱前衍生试剂 , Dansyl2Cl、FDNB、FDNPAA 和 FDNDEA 衍生法的缺点是衍生后生成干扰副产物 ,并且后 3 种方法需要通过抽干的方法除去反应剂 。 FMOC2Cl法的缺点是 ,为停止衍生反应和防止生成的衍生物自发水解 ,过量的反应剂必须用戌烷萃取 除去 [ 23 ] 。由于以上几种方法的不足 ,只有 OPA 和 P ITC被广泛用作柱前反应试剂 。
由于大多数氨基酸在紫外可见光区无吸收 ,因此必须将其衍生 、转化为具有紫外可见吸收或能产生 荧光的物质才能检测 。茚三酮是最常用的柱后衍生化试剂 。采用茚三酮作柱后衍生试剂的方法被认为 是这一技术的标准方法 (AOAC采用的氨基酸分析标准方法 ) 。这种方法的优点是准确 、可靠 、重现性 好 ,能测定大量氨基酸及其同系物 。方法的不足是灵敏度不高 ,只可对 100 pmol以上的氨基酸进行准 确分析 ,而且需要双波长检测 ,在 440 nm 处检测脯氨酸 ,在 570 nm 处检测其它氨基酸 [2 ] 。
柱后衍生高效阳离子交换色谱法可应用于蛋白质水解液、生理体液 、食品等样品中氨基酸的测定。但 色谱仪器较复杂 ,需要通过泵和反应器以保证洗脱液与柱后衍生试剂均匀混合 ,使仪器局限于一类分析 。
3 柱前衍生反相高效液相色谱法
近 20 年来 ,柱前衍生反相高效液相色谱法 (RP2HPLC)分析氨基酸得到了迅速发展 ,逐渐取代柱后 衍生 HPCEC在许多领域中的应用 。RP2HPLC分析方法更加灵敏 、快速 。而且 ,与局限于氨基酸分析的 自动分析仪不同 , HPLC仪适用性极广 。
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分析化学
第 33卷
酸形成多种衍生物 ,与赖氨酸 、酪氨酸 、胱氨酸形成双丹酰衍生物 ,与其他氨基酸则形成单丹酰衍生 物 [ 28 ] 。此方法对胱氨酸的线性特别好 [ 29 ] 。