基因克隆载体-噬菌体

λ类噬菌体
λ类噬菌体DNA全长48520bp
λ类噬菌体有50多个基因，功能相近的聚集
成簇
λ类噬菌体DNA有些区域对λ类噬菌体的生 长并非必须，可以缺失或被外源DNA取代
λ噬菌体
溶菌生长模式 溶源生长模式
λ类噬菌体
溶菌方式：
在条件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和 原料，λDNA上基因表达合成构成噬菌体头、尾和 尾丝所需的各种蛋白质，λDNA经多次复制合成许 多子代λDNA，于是装配成许多子代的λ噬菌体， 最后裂菌，释放出新的λ噬菌体。
λ类噬菌体
溶源方式：
进入细菌的λDNA可整合入细菌的染色质DNA中， 细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定 潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体， 含有原噬菌体的细菌称为溶源菌。 λDNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA 中切出，进入溶菌性方式的繁殖。
λ噬菌体载体的构建策略
细菌人工染色体载体BAC
在大肠杆菌F因子的基础上发展而来，容量 比YAC小，但具有YAC无可比拟的优点：
1. 可稳定遗传 2. 嵌合现象少 3. 操作容易
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基因克隆载体
生物与食品工程学院
噬菌体克隆载体
能感染细菌的病毒统称为噬菌体
噬菌体有双链噬菌体，也有单链噬菌体。
双链噬菌体：λ类噬菌体 单链噬菌体：M13噬菌体
λ类噬菌体
DNA + 蛋白质外壳
λ噬菌体感染时，通过尾管将DNA注入大肠
杆菌，而将其蛋白质外壳留在受体细胞外
λ噬菌体在噬菌体中是线性DNA分子，进入 宿主细胞后，连接成环状，连接末端称为 cos位点
在lacZ’ 添加不同的链接杆
通过构建成对的M13载体，使外源DNA的双链都
可以随M13的“＋”链一起复制。
酵母基因克隆载体
酵母：
1. 结构简单的真核生物 2. 培养廉价 3. 可以对外源基因表达蛋白进行加工和修
饰
二硫键的正确形成、羰基化
酵母2μm质粒
每个细胞含20~80个拷贝
能在酵母细胞内自我复制
一、切去非必需区，抹去多余的限制性酶 切位点
用点突变或甲基化酶处理等方法使必须区内的
酶切位点失效，避免外源DNA插入非必须区。
λ类噬菌体载体的构建策略
二、加入选择标记基因
1. 包装容量 只有特定大小的片段才可以包装，大小选择 2. lac基因 颜色显示
λ类噬菌体载体的构建策略
三、体外包装系统
E基因缺失的λ噬菌体 D基因缺失的λ噬菌体 混合
λ类噬菌体载体的应用
最长加载片段为16kb，最小为0.7kb
主要用于构建cDNA文库
也可以使外源基因在大肠杆菌中进行表达
M13噬菌体载体
M13噬菌体是雄性大肠杆菌噬菌体，基因组为一
长度 6.4kb 的单链（＋链）闭环 DNA 分子。 基因间隔区（IS区），可以突变、缺失、插入外 源DNA，不影响M13噬菌体的复制。 M13子代噬菌体通过细胞壁挤出，并不杀死细菌， 但细菌生长速度缓慢。
含有复制起始点 ori
YEp24载体
构成：
2μm质粒复制起始点的2.2kb片段 酵母染色体基因组URA3 基因(尿嘧啶营养缺陷基 因)1.1kb片段 将上述两个片段分别接入pBR322质粒的EcoR I 和 Hind III位点
YEp24载体
YEp24载体
穿梭质粒：人工构建的具有两种不同复制起点
ห้องสมุดไป่ตู้
M13噬菌体载体
M13 噬菌体的增殖
在感染 E.coli 时，会产生临时的双链DNA分子。 双链DNA分子复制到一定数量时，停止复制，＋ 链指导合成相关蛋白，－链指导合成＋链DNA 。
M13噬菌体载体
M13噬菌体的构建策略 在间隔区（IS）添加选择标记基因和克隆位 点。
lacZ’ 基因
YAC）。
酵母人工染色体载体的应用
构建基因组文库
可以装载更大的外源DNA片段，有利于基因克隆 包含的片段可以包含内含子和调控区 克隆的基因可以和酶、转录因子等相互作用
酵母人工染色体载体的不足
1. 存在嵌合现象
插入序列可能来自多个片段
2. 稳定性差
继代培养中容易丢失
3. 分离纯化操作难度大 4. 转化效率低
和选择标记，可以在两种不同类群宿主中存活和 复制的质粒载体。 制备。
YEp24载体常用于酵母菌高水平表达外源目的基因。
穿梭质粒有利于对质粒的分子生物学操作和大量
酵母人工染色体载体
构建方法：
将酵母染色体的端粒，复制起点和着丝粒以及 必要的选择基因序列克隆到大肠杆菌的pBR322 中，获得的质粒就成为酵母人工染色体载体（