黄芪多糖的分子量分布

收稿日期：２００３－１０－１４基金项目：国家“十五”攻关子课题（２００２ＢＡ５１４Ａ－１２－３）作者简介：闫巧娟（１９７１－），女，讲师，在职博士生，主要从事生物质资源及天然生物活性物的研究。

黄芪多糖的分子量分布闫巧娟１，韩鲁佳１，江正强２，皇才进１（１．中国农业大学工学院，北京 １０００８３；２．中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 １０００８３）摘 要：本文通过分级醇沉、分步醇沉和超滤方法研究黄芪多糖的分子量分布。

结果表明：分级醇沉浓度对应的得率随醇浓度的升高而呈增加趋势；糖的含量变化起伏较大，醇浓度为６０％时所得多糖含量比较低，醇浓度为３０％和７０％时所得多糖含量较高；分步醇沉的醇浓度为１０％时沉淀下来的多糖所占比例最大，醇浓度达到８０％时大部分多糖都可以沉淀下来；而所得多糖含量除９０％醇浓度时较低外，其余相差不大；超滤后黄芪多糖大部分分布在离心沉淀和截留分子量１５０千道尔顿（１５０ｋＤａ）以上部分，两者占了５７．６％；其含量除３ｋＤａ以下和６ｋＤａ至５０ｋＤａ部分较低外，其它部分含量相差不大。

黄芪多糖的分布很不均匀，大分子量和小分子量的多糖较多，而３ｋＤａ至１５０ｋＤａ这一段的多糖只占总多糖的１３．２％。

关键词：黄芪多糖；醇沉；超滤；分子量分布Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｍａｓｓ　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ＰｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓＹＡＮ　Ｑｉａｏ－ｊｕａｎ１，ＨＡＮ　Ｌｕ－ｊｉａ１，ＪＩＡＮＧ　Ｚｈｅｎｇ－ｑｉａｎｇ２，ＨＵＡＮＧ　Ｃａｉ－ｊｉｎ１（１．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，　Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，　Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄＮｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８３，　Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔｕｄｙ，　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　（ＡＰＳ）　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ　ｂｙ　ｅｔｈａｎｏｌｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　（ｓｔｅｐ　ａｎｄ　ｓｔｅｐｗｉｓｅ）　ａｎｄ　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ．　Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ：　Ｆｏｒ　ｓｔｅｐ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，　ｙｉｅｌｄｓ　ｏｆ　ＡＰＳ　ｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｏｆ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．　Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｈｉｇｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　ｓａｍｐｌｅｓ，　ｔｈｅ　ｌｏｗｃｏｎｔｅｎｔ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｗｈｅｎ　ｕｓｉｎｇ　６０％　ｅｔｈａｎｏｌ，　ｂｕｔ，　ｈｉｇｈ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｕｓｉｎｇ　３０％　ａｎｄ　７０％　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．　Ｆｏｒ　ｓｔｅｐｗｉｓｅｅｔｈａｎｏｌ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，　ＡＰＳ　ｒａｔｉｏ　ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ａｔ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　１０％，　ｗｈｉｌｅ　ｍｏｓｔ　ＡＰＳ　ｍｉｇｈｔ　ｂｅ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ　ｗｈｅｎｅｔｈａｎｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｕｐ　ｔｏ　８０％．　ＡＰＳ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｗａｓ　ｖｅｒｙ　ｌｏｗ　ｗｈｅｎ　ｕｓｉｎｇ　９０％　ｅｔｈａｎｏｌ，　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｓｔ　ｃｏｎｔｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｎｏｔａｐｐａｒｅｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｕｎｄｅｒ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｒａｎｇｉｎｇ　ｆｒｏｍ　１０％　ｔｏ　８０％．　Ａｆｔｅｒ　ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，　ｍｏｓｔ　ＡＰＳ　（５７．６％）　ｗｅｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅｄ　ｐｅｌｌｅｔｓ　ｏｆ　ｍｏｒｅ　ｔｈａｎ　１５０ｋＤａ　ｆｒａｃｔｉｏｎ．　Ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏｔ　ｍｕｃｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ　ｃｏｎｔｅｎｔｓｅｘｃｅｐｔ　ｆｏｒ　ｔｈｏｓｅ　ｏｆ　ｌｅｓｓ　ｔｈａｎ　３ｋＤａ　ａｎｄ　６～５０ｋＤａ　ｆｒａｃｔｉｏｎｓ．　Ｂｏｔｈ　ｈｉｇｈ　ａｎｄ　ｌｏｗ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓｅｓ　ｏｆ　ＡＰＳ　ｗｅｒｅ　ｏｆ　ｈｉｇｈｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，　ｈｏｗｅｖｅｒ　ｔｈｅ　ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ　３～１５０ｋＤａ　ＡＰＳ　ｗａｓ　ｏｎｌｙ　１３．２％．　Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｗａｓ　ｖｅｒｙ　ｕｎｅｖｅｎ　ｉｎ　ＡＰＳ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ　ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ；ｅｔｈａｎｏｌ　ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ；ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｓｓ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ中图分类号：Ｏ６３６．１；Ｒ２８４．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００２－６６３０（２００４）０８－００２７－０４黄芪为一种常用中药，来源于豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根［１］，主产于山西、内蒙、甘肃、黑龙江、吉林等地。

黄芪中所含化学成分较多，包括多糖、甙类、氨基酸、黄酮和微量元素等多种成分，是目前临床应用较为广泛，研究比较深入的中药之一。

药理研究证明，多糖是黄芪的主要有效成分之一，具有增强机体抵抗力、促进免疫、促进抗体合成、双向调节血糖和保护心血管系统等作用，广泛应用于中医临床。

因此黄芪多糖引起了研究者的极大兴趣。

由于多糖的分子量分布很广，即使采用相同的黄芪原料，提取或分离过程中的差异都可能造成产物的不同，目前已分离纯化出十几种黄芪多糖［２～６］。

在进行黄芪多糖分离纯化时醇沉往往是其第一步操作，不同醇沉条件对黄芪多糖的组成、得率和含量影响较大。

近年来，超滤膜分离法已经成为在中药研究中备受关注的分离方法之一，李树珍等对不同提取工艺黄芪多糖含量进行了比较，结果超滤法截留分子量６ｋＤａ以上的药液醇沉后比水煮醇沉法含量高出２０％左右［７］。

醇沉和超滤都是依据分子量大小进行分离纯化的，迄今尚未见到用这两类方法系统研究黄芪多糖分子量分布的报道，所以本文探讨分步醇沉和分级醇沉对黄芪多糖得率和含量的影响。

另外，通过选用不同截留分子量的中空纤维超滤膜对黄芪提取液进行超滤，将提取液分成几个相对分子量范围组，了解黄芪多糖的分子量分布情况。

由于多糖的生理活性与分子量大小有非常密切的关系［８］，因此，本研究为进一步明确黄芪多糖有效部位和优化提取工艺提供依据。

１材料与方法１．１药材来源蒙古黄芪 北京同仁堂饮片厂提供，产地山西。

１．２主要试剂９５％乙醇 化学纯，北京化工厂；纯净水 实验室自制；无水乙醇、硫酸、苯酚（重蒸）等均为国产分析纯；Ｄ－葡萄糖为ＳＩＧＭＡ分析纯产品。

１．３主要仪器：超滤试验台，配中空纤维超滤膜（截留分子量分别为１５０、１００、５０、３０、６、３ｋＤａ），中国科学院生态环境中心；旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；ＴＵ１８００ＳＰＣ紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；　ＡＢ２０４－Ｂ型电子分析天平，瑞士梅特勒公司；ＬＧＪ－１８型冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂；ＬＸＪ－ⅡＢ低速大容量多管离心机，上海安亭科学仪器厂。

１．４工艺流程［９］乙醇回流脱脂一次（溶剂用量８倍，２ｈ），水煮提取２次　，第一次溶剂用量１０倍，２ｈ，第二次溶剂用量８倍，１．５ｈ，合并提取液浓缩，醇沉，干燥得黄芪多糖。

１．５分级醇沉取８份浓缩液，分别以醇浓度１０％，２０％，３０％，４０％，５０％，６０％，７０％，８０％和９０％进行醇沉。

将醇沉物冷冻干燥，分析多糖的得率和含量。

１．６分步醇沉将浓缩液加乙醇调醇浓度为１０％，收集沉淀，再将上清液调节醇浓度为２０％，收集沉淀，将上清液调节醇浓度为３０％，依此类推至醇浓度为９０％。

将醇沉物冷冻干燥，分析多糖的得率和含量。

１．７超滤法提取液静置过夜后将上清液离心，收集沉淀物，上清液依次用１５０、１００、５０、３０、６、３ｋＤａ的超滤膜进行超滤处理。

所得截留液分别收集，浓缩，冻干，得到不同分子量范围的黄芪多糖。

分析多糖的得率和含量。

１．８分析方法［１０］样品中糖含量的定量测定，采用Ｄｕｂｉｏｓ法，即苯酚－硫酸法，以葡萄糖为标准品。

多糖的得率为所得每部分冻干物质量占所用黄芪原料质量的百分数。

２结果与讨论２．１分级醇沉对多糖得率和含量的影响分级醇沉后所得样品得率和含量结果见图１。

各醇沉浓度对应的得率都随醇浓度的升高而呈增加的趋势，得率与醇沉浓度呈指数相关。

黄芪多糖易溶于水，不溶于醇，在不同浓度乙醇溶液中不同分子量范围的多糖溶解度差异较大。

醇沉浓度越高，能够沉淀下来的多糖分子量越小，醇浓度达９０％时，几乎所有多糖都能沉淀下来，上清液中主要为低聚糖。

由于水提液含有较多杂质，分级醇沉所得样品中多糖的含量变化起伏较大，含量与醇沉浓度基本为三次多项式的关系。

醇浓度为６０％时所得多糖含量较低，醇浓度为３０％和７０％时所得多糖含量较高，说明黄芪多糖的分子量分布很不均匀。

２．２分步醇沉对多糖得率和含量的影响分步醇沉对黄芪多糖得率和含量的影响分别见图２和３。

　可以看出，醇浓度１０％的多糖所占比例最大，其次是２０％和３０％，而９０％的醇沉淀出的多糖最少，这说明，黄芪多糖中不同醇沉部分的多糖分布是很不均匀的，１０％～３０％部分应是一些高分子量的多糖，占了８０．４％。

９０％的乙醇沉淀出的应是一些小分子糖类和一些杂质占０．４％。

从图３的含量图可以看出，醇浓度９０％的多糖含量比较低，其它各点的变化相对比较平缓，以２０％的为最高，这与低浓度醇对其它杂质的溶解度较大有关。

２．３超滤各部分多糖比例及含量的变化在超滤前将经过静置后的提取液进行１２００ｒ／ｍｉｎ离心后出现较多沉淀；超滤过程中，５０ｋＤａ以下透过液进行３０ｋＤａ超滤膜超滤时几乎无截留物；而５０ｋＤａ超滤膜的截留液醇沉后出现与其它部分不同的大片状絮状物，将此絮状物与其它部分分开处理，所以通过超滤将提取液分为以下几部分：离心沉淀、１５０ｋＤａ以上、１００～１５０ｋＤａ、５０～１００ｋＤａ（絮状）、５０～１００ｋＤａ（其它）、６ｋＤａ～５０ｋＤａ、３ｋＤａ～６ｋＤａ以及３ｋＤａ以下８部分。

图４及图５显示了各部分的比例和含量。

由图４看出，超滤后黄芪多糖大部分分布在离心沉淀和１５０ｋＤａ以上部分，两者占了５７．６％，另外，３ｋＤａ以下部分也较多，占２９．１％，其它的除５０～１００ｋＤａ絮状部分达到８．２％以外，都在２．１％以下。