ellman测巯基

埃尔曼的试剂，5,5'二硫代双-（二硝基苯甲酸），5克分子量：396.35

CAS号：69-78-3

使用半胱氨酸标准精确量化巯基程序

材料的制备

1 反应缓冲液：0.1M的磷酸钠，pH 8.0，含有1 mM的EDTA

半胱氨酸标准品，分子量136.2 ：配成一定浓度梯度

3 Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液4毫克溶解DTNB

程序

3在各试管中加入250μL各浓度的标准工作液或待测物溶液

注：对于未知的样品需要稀释，以便使其浓度标准曲线的工作范围之内（理想的浓度为0.1-1.0）。

4在室温混合和反应15分钟。

在412 nm处测量吸光度。

根据得到数值生成一个标准曲线，测定待测样品由标准曲线计算SH含量

摩尔吸光系数的程序精确量化的巯基的

材料的制备

1 反应缓冲液：0.1M的磷酸钠，pH 8.0，含有1 mM的EDTA

Ellman试剂溶液：1mL反应缓冲液4毫克溶解DTNB

测量吸光度

去若干试管，每管加入50μL的Ellman试剂溶液和2.5mL反应缓冲液。

加入250μL待测样品,空白添加250μL反应缓冲液

在室温混合和反应15分钟。

分光光度计412nm测定吸光度。

根据TNB的摩尔消光系数(14,150)计算巯基含量

该国能在412nm的合成，有一个相对比较激烈的吸光度

同时二硫化物。由于蛋白质的巯基，以国能形成化学计量

为1:1，国能形成可以用来评估硫醇数目。

在变性剂的情况下，唯一能够找到的硫醇的反应，而

残留的chaotropic代理人在场的总数减少胱氨酸

目前可以衡量的。经处理后减少的蛋白质

与chaotropes及DTNB能够产生的半胱氨酸总数（半胱氨酸巯基

加半胱氨酸-β-半胱氨酸）。

- -

反应是敏感的碱性pH值（俄亥俄州）与RS竞争），

酸性pH值（二硫化物可以打破），氧（R的巯基再氧化），以及

温度（热致变色）。因此，通常的反应是

进行了过多的DTNB的蛋白质，在中性pH值固定的温度，

erature，有时在厌氧条件。此外，国能是

敏感的各种离子的缓冲，所以采用消光系数

硫醇数量计算必须正确匹配的反应

条件。这也是进行了存在的真实反应

尿素或盐酸胍的变性剂（盐酸胍）。下表概述

在DTNB的和国能在各种条件下的一些有用的数据：

-------------------------------------------------- ------------------------

复方最大的lambda（pH值?7）灭绝：（以磷酸盐）（以磷酸三）（以盐酸胍）--------- ----------------- -------------------- ---- ------ ----------

DTNB的324纳米17780 16600 ----

国能---- 412纳米14,150 13,700

-------------------------------------------------- ------------------------

消光系数以每摩尔每厘米长度的路径，30degC单位

国能在降低盐酸胍存在的灭绝是由于在移位

拉姆达从412到422最大纳米。在DTNB的灭绝是在412纳米212/M/cm，

规模虽小但可衡量的。

=-=-=-=-=-=-=-=

=协议=

=-=-=-=-=-=-=-=

联合解决方案：

蛋白质溶液（本地或以前减少，脱盐）

（?5 - 0.1M的磷酸钾缓冲液，pH值7.4 40uM）DTNB的股票（20毫米0.1M的KPO4，pH值7.4，分子量396.35; 7.93毫克/mL）

（DTNB的很慢进入的解决办法;涡定期

在2-3小时内实现完整的解决方案，

这将是很轻，颜色黄色）

尿素或盐酸胍（高纯度，结晶固体）

主要设备：

双光束分光光度计动力学模式设置在412nm

恒温细胞，30degreesC

程序：

示例1 = 1.0mL细胞蛋白质溶液+ 50μL20毫米DTNB的

引用单元1 = 1.0mL+ 50μL DTNB的缓冲区

记录吸光度前，DTNB的除了“零”。跟随

在412 nm的反应在30degC不断。记录过去的时候，

反应达到最大值。如果任何被视为重要的下坡

最大吸收后到达，这将需要更正

为了获得可访问硫醇的正确数目。

在第二个实验中，添加结晶盐酸胍到您的

蛋白质溶液，以达到最终浓度约4米。请注意

体积变化以及由此产生的蛋白显着的稀释

解决方案！

示例2 = 1.0mL细胞蛋白质溶液（4 M盐酸胍）+ 20 mM的DTNB的50μL 引用单元2 = 1.0mL缓冲液（4 M盐酸胍）+ 50μL20毫米DTNB的

同样，在30摄氏度的纪录外径412纳米，跨越高峰吸收。

本实验将产生硫醇总数减少。

样品细胞3 = 1.0mL预变性，减少，蛋白质和透析

+ 50μL20毫米DTNB的

引用单元3 = 1.0mL缓冲液（4 M盐酸胍）+ 20 mM的DTNB的50μL

同样，记录OD值随时间在30degC 412 nm到峰值吸收和超越。

本实验将产生的蛋白质的半胱氨酸残基的总数。

=-=-=-=-=-=-=-=-=-=

数据分析= =

=-=-=-=-=-=-=-=-=-=

计算硫醇数修改（或浓度除外）使用

在412 nm的最大吸收测量（或修正值除外）

啤酒的法律，以及适当的消光系数;鸿沟这个值

由精确已知的摩尔反应蛋白浓度比色皿

三个实验的每一个。这将使你获得硫醇，

总半胱氨酸巯基，总半胱氨酸巯基以及半胱氨酸-β-半胱氨酸。这样做，每个实验中

重复或一式三份，平均分别复制。如果您的

数字统计整数，你就大功告成了。如果不考虑重复

该议定书，但采用厌氧（脱气）缓冲区的所有反应。

=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=

一些参考= =

=-=-=-=-=-=-=-=-=-=-=

“甲硫醇为确定低浓度比色法”

埃尔曼，吉尔（1958）拱。生化。Biophys。74，443-450。

“重新评估埃尔曼的试剂”谜语，密码，布莱克利，汤顿和泽纳，

二（1983）方法酶学。91，49-60。

对兔血红素结合半胱氨酸残身份“研究

肝微粒体细胞色素P - 450同工酶2“黑色，SD和库恩，美兆

（1985）生物化学，Biophys。水库。Commun。128，82-89。

Hi All,

I had a couple of folks ask for my opinion and method for use of Ellmen's

reagent (DTNB) in the detemination of protein thiols (Cys-SH). Below, I've included a protocol, references, and general information that should be

helpful to all who anticipate using this method. Best Regards, Shaun