03 实验三 碱性蛋白酶活力测定
碱性蛋白酶检测
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碱性蛋白酶检测
碱性蛋白酶（Alkaline protease）是属于内肽酶中的一种丝氨酸蛋白酶类，在碱性环境下作用于肽键，可将蛋白质水解为氨基酸、多肽以及游离氨基酸，还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能，广泛应用于酶洗涤剂工业、食品加工、酿造、医药和皮革加工等领域。
迪信泰检测平台采用生化法，结合相应的酶类的试剂盒可以高效、精准的检测碱性蛋白酶的活性变化。
此外，我们还提供其他酯酶类的检测服务，以满足您的不同需求。
生化法测定碱性蛋白酶样本要求：
1. 请确保样本量大于0.2g或者0.2mL。
周期：2~3周。
项目结束后迪信泰检测平台将会提供详细中英文双语技术报告，报告包括：
1. 实验步骤（中英文）。
2. 相关参数（中英文）。
3. 图片。
4. 原始数据。
5. 碱性蛋白酶活性信息。
迪信泰检测平台可根据需求定制其他物质测定方案，具体可免费咨询技术支持。
碱性蛋白酶活力测定
碱性蛋白酶活力测定1 定义1克固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1µg酪氨酸为1个酶活力单位，以u/g（u/mL）表示。
2 福林法2.1 原理碱性蛋白酶在一定的温度与pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
2.2 试剂和溶液2.2.1福林酚试剂已配2.2.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)21.2g，用水溶解并定容至500mL。
2.2.3 三氯乙酸（CCl3·COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸16.34g，用水溶解并定容至500mL。
2.2.4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.05mol/L按GB601配制。
2.2.5 硼酸缓冲溶液（pH10.5）甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1000mL。
使用溶液取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1000mL。
上述缓冲溶液，需用pH计校正。
2.2.6 10g/L 酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol/L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用硼酸缓冲溶液稀释至刻度。
此溶液在冰箱内储存，有效期为3天。
2.2.7100µg/mL L-酪氨酸标准溶液a.称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g，精确至0.002g，用1mol/L盐酸60mL溶解后定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
b.吸取1mg/mL酪氨酸标准溶液10.00mL，用0.1mol/L盐酸定容至100mL，即得到100µg/mL L-酪氨酸标准溶液。
蛋白酶活力测定实验报告
蛋白酶活力测定实验报告
实验目的：
通过测定蛋白酶的活力，了解其功能和活性。
实验原理：
蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，可以将蛋白质分解为多肽和氨基酸。
蛋白酶活力是指单位时间内酶水解蛋白质的能力，通常以单位时间内水解的底物的量来表示。
本实验使用的方法是酶促反应测定法。
首先，将待测蛋白酶与底物混合，反应一定时间后，停止反应并添加淀粉溶液产生反应终止剂，最后用碘化钾溶液滴定反应产物。
实验步骤：
1. 预备试剂：制备蛋白酶和底物的工作液，制备淀粉溶液和反应终止剂，制备碘化钾溶液。
2. 实验装置：准备滴定装置和试管架。
3. 设置实验条件：保持温度恒定，控制pH值。
4. 实验操作：在试管中加入待测蛋白酶和底物工作液，反应一定时间后，加入淀粉溶液和反应终止剂，最后用碘化钾溶液滴定。
5. 记录数据：记录滴定所需碘化钾的体积，计算出酶活力。
实验结果：
根据实验数据，计算出蛋白酶的活力，通常以单位时间内水解的底物的量来表示。
实验讨论：
分析实验结果，比较不同条件下蛋白酶的活力差异，并讨论影响蛋白酶活力的因素。
实验结论：
通过分析实验结果，得出结论，总结蛋白酶活力与其他因素之间的关系，并提出可能的应用前景。
实验总结：
总结实验过程，评价实验结果及数据，提出改进意见，并对今后可能的研究方向进行展望。
参考文献：
列出所参考的文献。
碱性蛋白酶(Alkaline protease, AKP)活性测定试剂盒说明书
货号：MS2302 规格：100管/48样碱性蛋白酶（Alkaline protease, AKP）活性测定试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。
此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。
该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。
测定原理：在碱性条件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，测定680nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
自备仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、0.5mL EP管和蒸馏水。
试剂组成和配制：试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。
临用前加 5mL 蒸馏水溶解。
试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。
临用前加入 5mL 试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。
试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。
临用前加 20mL 蒸馏水溶解。
试剂五：液体×1 瓶，4℃保存。
标准品：液体×1 支，0.25μmol/mL 标准酪氨酸溶液，4℃保存。
粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心10min，取上清，即粗酶液。
2. 血清或培养液：直接测定。
3. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后8000g，4℃，离心10min，取上清置于冰上待测。
测定操作：1. 分光光度计/酶标仪预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。
酶活力测定实验报告
酶活力测定实验报告一、实验目的酶活力测定实验的主要目的是了解酶的特性和作用机制，掌握测定酶活力的基本方法和原理，并通过实验数据的分析和处理，计算出酶的活力值，为进一步研究酶的性质和应用提供基础数据。
二、实验原理酶是一种具有生物催化活性的蛋白质或核酸分子，能够加速化学反应的进行。
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力，通常用单位时间内底物的消耗量或产物的生成量来表示。
本次实验采用的是分光光度法测定酶活力。
以过氧化氢酶为例，过氧化氢酶能够催化过氧化氢分解为水和氧气。
在一定条件下，加入适量的过氧化氢溶液，然后通过测定反应体系中剩余过氧化氢的量，间接计算出过氧化氢酶的活力。
三、实验材料与仪器1、实验材料新鲜的猪肝组织过氧化氢溶液（3%）磷酸缓冲液（pH 70）2、实验仪器分光光度计离心机恒温水浴锅移液器试管、量筒、烧杯等玻璃仪器四、实验步骤1、酶液的制备称取新鲜猪肝组织_____g，剪碎后放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液（pH 70），研磨成匀浆。
将匀浆转移至离心管中，在 4℃下以_____rpm 离心_____min，取上清液即为酶液。
2、绘制标准曲线取 6 支干净的试管，分别加入 0、01、02、03、04、05 mL 的过氧化氢标准溶液（10 mmol/L），然后用磷酸缓冲液（pH 70）补足至 1 mL。
向各试管中加入 2 mL 显色剂（4-氨基安替比林与酚的混合液），摇匀后在 37℃水浴中保温 15 min。
以第一支试管为空白对照，在分光光度计上于 510 nm 波长处测定各管的吸光度值。
以过氧化氢的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
3、酶活力的测定取 2 支干净的试管，分别标记为测定管和对照管。
向测定管中加入 1 mL 酶液和 1 mL 过氧化氢溶液（3%），立即摇匀，在 37℃水浴中反应 5 min。
向对照管中加入 1 mL 磷酸缓冲液（pH 70）和 1 mL 过氧化氢溶液（3%），在 37℃水浴中保温 5 min。
03 实验三 碱性蛋白酶活力测定
实验三. 碱性蛋白酶活力测定【实验目的】1. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
2. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
【实验材料】1.实验器材电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度计2.实验试剂(1)福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。
回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml。
过滤，置于棕色瓶中暗处保存。
使用前加4倍蒸馏水稀释。
(2)1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。
(3)pH10缓冲溶液：甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。
蛋白酶活性检测实验报告
一、实验目的1. 学习和掌握蛋白酶活性检测的基本原理和方法。
2. 了解蛋白酶的特性和作用。
3. 通过实验，学会使用相关仪器和操作技能。
二、实验原理蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶，其活性是指在一定条件下，蛋白酶催化蛋白质水解的能力。
蛋白酶活性检测通常采用紫外分光光度法，通过测定反应体系中蛋白质的降解程度来评估蛋白酶的活性。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）蛋白酶样品（2）底物：酪蛋白（3）缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 7.0）（4）其他试剂：硫酸铜、碘化钾、氢氧化钠等2. 实验仪器：（1）紫外分光光度计（2）恒温水浴锅（3）电子天平（4）移液器（5）试管（6）烧杯四、实验步骤1. 准备实验试剂和仪器。
2. 配制底物溶液：称取一定量的酪蛋白，加入适量磷酸盐缓冲液，溶解后备用。
3. 设置实验组：（1）取若干个试管，分别加入不同浓度的蛋白酶样品。
（2）在每个试管中加入相同体积的底物溶液。
（3）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。
4. 设置对照组：（1）取若干个试管，分别加入相同体积的蛋白酶样品和底物溶液。
（2）将试管放入恒温水浴锅中，设定温度为37℃，反应一定时间。
5. 测定反应体系中蛋白质的降解程度：（1）取一定体积的反应体系，加入硫酸铜和碘化钾溶液。
（2）用紫外分光光度计测定反应体系的吸光度。
（3）根据吸光度计算蛋白质的降解程度。
6. 数据处理和分析：（1）绘制蛋白酶活性与酶浓度、反应时间的关系曲线。
（2）分析蛋白酶的特性和作用。
五、实验结果与分析1. 实验结果：（1）不同浓度的蛋白酶样品对底物溶液的降解程度不同。
（2）随着反应时间的延长，蛋白质的降解程度逐渐增加。
2. 分析：（1）蛋白酶的活性与酶浓度呈正相关，即酶浓度越高，活性越强。
（2）在一定反应时间内，蛋白酶活性随着反应时间的延长而增加，但当反应时间过长时，活性逐渐降低，可能是因为蛋白酶自身发生降解。
六、实验结论1. 通过本实验，掌握了蛋白酶活性检测的基本原理和方法。
蛋白酶活力的测定
实验:蛋白酶的活力测定一、实验目的1、学习蛋白酶活力的测定方法。
2、深入了解酶的活力和比活力的概念。
二、实验原理1、酶活力的大小，是以该酶在适宜的温度和pH下，酶催化一定时间后，反应底物的减少量或者反应产物的增加量来表示。
2、本实验蛋白酶的活力大小是以分解出的酪氨酸的量来表示，其单位为：每分钟内分解出1微克酪氨酸的酶量称为1单位。
3、本实验采用福林-酚与蛋白质水解出的酪氨酸生成兰色物，从兰色的深浅程度可以求知酪氨酸的多少，从而确定酶活力的大小。
4、在测酶活力前，先用福林-酚与用已知的不同浓度的酪氨酸作用，作出兰色深浅程度（用光密度表示）与酪氨酸浓度关系的标准曲线。
5、将酶与底物反应产生的产物与福林-酚试剂作用后测光密度，从标准曲线上查出相当于多少微克的酪氨酸，就可以计算出酶的单位了。
三、实验材料、仪器和试剂1.实验材料1398中性蛋白酶粗酶粉（上海新型发酵厂）、滤纸2.仪器（1）试管（1.5*15cm*24) (2)移液管（3）电热恒温水浴（4）721型分光光度计3.试剂（1）福林-酚试剂B（2）标准酪氨酸溶液称取50毫克酪氨酸（预先在105摄氏度烘至恒重），加0.2MHCL溶液后定容至100ml，在加水稀释5倍得到100微克/毫升的酪氨酸溶液。
（3）酪蛋白溶液称取酪蛋白2克，置150ml三角烧瓶中，加入0.2M磷酸氢二钠61ml，在水浴上搅拌使溶解，再加入39ml0.2M磷酸二氢钠，得到pH7的酪蛋白液，倾出上清液备用。
（4）0.4M三氯醋酸溶液（TCA）（5）0.4M碳酸钠溶液四、操作步骤1、酪氨酸标准曲线制作：按下列次序加入试剂，混合均匀，保温，然后在分光光度计上进行比色，测出650nm处的光密度值。
以酪氨酸浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。
管号 1 2 3 4 5 62、蛋白酶活力测定 （1）浸出酶液称取0.5克酶粉加入40ml 水，在室温下放置1小时并时加搅动。
将酶浸出液过滤，取滤液1ml 用水稀释至20ml ，即为稀释1600倍的酶液。
蛋白酶活力的测定
蛋白酶活力的测定一、实验目的1、了解碱性蛋白酶活力测定的原理；2、掌握碱性蛋白酶活力测定的方法。
二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，就可计算酶的活力。
三、实验步骤1、将5%TCA溶液和1%酪蛋白溶液在37℃下保温。
2、取四支15ml具塞试管，分别标上记号A1,A0,B1和B0。
在A1和A0试管中各吸入0.20ml酶液，在B1和B0试管中各吸入0.40ml酶液，分别用0.2mol/L 磷酸盐缓冲液定容至2.00ml。
在A0和B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支试管都置于37℃水浴中保温。
3、在各试管中吸入2.00ml1%酪蛋白溶液，在37℃下保温10min(准确计时)后，再向A1和B1试管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。
4、奖试管从水浴中取出，在室温下放置1h，用少量上清液润湿滤纸后过滤，保留滤出液。
5、在280nm波长下，分别以A0和B0滤液为空白，测定A1和B1滤液的吸光度。
三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）:称取1.0g酶制剂，加100ml蒸馏水搅拌30min，在4℃下离心分离后，将上层清夜置于冰箱中保存，使用前稀释一定倍数；②0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5）；③1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.5），加热并搅拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；④5%三氯醋酸（TCA）溶液。
蛋白酶活力的测定
实验三蛋白酶活力的测定一、目的掌握用分光光度计法测定蛋白酶活力的原理与操作技术。
二、原理蛋白酶水解酪蛋白，其产物酪氨酸能在碱性条件下使福林——酚试剂还原，生成鉬蓝与钨蓝，以比色法测定。
三、试剂及仪器1．福林—酚试剂称取50g钨酸钠(Na2WO4•2H2O)，12.5g钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)，置入1000mL原底烧瓶中，加350mL水，25mL85%磷酸，50mL浓盐酸，文火微沸回流10h，取下回流冷凝器，加50g硫酸锂(Li2SO4)和25mL水，混匀后，加溴水脱色，直至溶液呈金黄色，再微沸15min，驱除残余的溴，冷却，用4号耐酸玻璃过滤器抽滤，滤液用水稀释至500mL。
使用时用2倍体积的水稀释。
2．0.4mol/L碳酸钠溶液：称取42.4g碳酸钠，用水溶解并定容至1000mL。
3．0.4mol/L三氯乙酸溶液：称取65.5g三氯乙酸，用水溶解并定容至1000mL。
4．2%酪蛋白溶液称取2.00g酪蛋白(又名干酪素)，加约40mL水和2~3滴浓氨水，于沸水浴中加热溶解，冷却后，用pH7.2磷酸缓冲溶液稀释定容至100mL，贮存于冰箱中。
5．pH7.2磷酸缓冲液0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：称取31.2g磷酸二氢钠(NaH2PO4•2H2O)，用水溶解稀释至1000mL；0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液：称取71.6g磷酸氢二钠(Na2HPO4•12H2O)，用水溶解稀释至1000mL；pH7.2磷酸缓冲溶液：取28mL 0.2mol/L磷酸二氢钠溶液和72mL 0.2mol/L磷酸氢二钠溶液，用水稀释至1000mL。
6．标准酪氨酸溶液：准确称取0.1g DL-酪氨酸，加少量0.2mol/L盐酸溶液(取1.7mL浓盐酸，用水稀释至100mL)，加热溶解，用水定容至1000mL，每毫升含DL-酪氨酸100微克。
7．仪器：分光光度计、试管四、操作步骤1．标准曲线绘制标准酪氨酸溶液(mL)[100 g/mL]稀释酪氨酸溶液浓度(g/mL)在上述各管中各取1mL，分别加入5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液，1mL福林—酚试剂，于400C水浴显色20min，在680nm波长下测吸光度，绘制标准曲线，在标准曲线上求得吸光度为1时相当的酪氨酸g 数，即为K 值。
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)1 原理蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。
磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。
由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。
利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
2 仪器和设备2.1 分析天平：精度0.0001g2.2 恒温水浴：精度±0.2℃2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计: 精度0.01pH单位3 试剂和溶液3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。
3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12H2O）6.02和磷酸二氢钠（NaH2PO3.2H2O）0.5g,加水定容至1000ml3.3 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。
3.4 0.4mol/L碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.3.5 0.4mol/L的三氯醋酸液：准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml3.6 0.5mol/L的NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml酪素溶液称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.3.8 100μg/ml酪氨酸标准溶液3.8.1 准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.3.8.2 吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。
蛋白质酶活力的测定
蛋白质酶活力的测定蛋白质酶活力的测定是生物化学实验中很重要的一项实验。
酶是一种催化剂，能够加速反应的速率而不参与反应本身。
蛋白质酶最显著的特点是具有酶活力，也就是能够催化特定的蛋白质分子降解为较小的分子。
测定蛋白质酶活力的目的是为了确定酶的催化效率，提高酶的纯度和测定酶的反应条件等方面提供依据。
一、实验原理蛋白质酶催化降解蛋白质分子时，会产生对应的氨基酸，这些氨基酸可以与试剂发生反应。
蛋白质酶的酶活力大小可以通过反应中产生的氨基酸数量来表示。
常用的测定方法有以下两种：1.二肽基(p-nitroaniline)法该方法的原理是利用蛋白质酶在一定的反应条件下（如适宜温度、pH值等）催化蛋白质水解生成相应的氨基酸，进而与试剂p-nitroaniline反应，生成黄色的产物p-nitroaniline，根据产生的p-nitroaniline的吸光度可以测定蛋白质酶的活力。
该方法具有操作简单、结果可靠、灵敏度高等优点。
但该方法并不适用所有类型的蛋白质酶，且试剂p-nitroaniline有毒性，需要避免吸入和接触。
2.钠二氢茚三硫酸法该方法的原理是利用蛋白质酶催化蛋白质水解产生的氨基酸与酚类试剂钠二氢茚三硫酸（TNBS）反应，生成黄色的产物，根据产生的色谱法或比色法来测定酶的活性。
该方法操作较复杂且对反应体系条件较为苛刻，但适用于大多数蛋白质酶。
二、实验步骤1.制备酶样溶液：取少量蛋白质酶，加入足量的缓冲液，并在适宜的催化条件下(如pH、温度等)，静置30分钟左右。
2.制备底物溶液：将p-nitroaniline溶于缓冲液中，制备一定浓度的p-nitroaniline底物溶液。
3.将相应的底物溶液加入到酶样液中，保持一定的条件，如时间、温度、摇床等，反应20-30分钟。
4.添加止反应液，阻止反应继续进行。
5.测定反应液中产生的p-nitroaniline的吸光度，计算蛋白质酶的酶活力。
2.制备底物溶液：将相应的血红蛋白等蛋白质溶解于缓冲液中，制备一定浓度的蛋白质底物溶液。
蛋白酶活力测定方法
蛋白酶活力测定方法酸性蛋白酶产品概述:蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。
由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。
包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。
蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。
蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。
工作机理蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。
在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。
酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。
本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。
它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。
酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。
从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。
这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。
（酸性蛋白酶537容易失活）简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。
1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml.2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml）特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5使用方法1、白酒工业：本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。
蛋白酶活性的测定方法及原理
③所温有度的对酶酶与活底力物的结影合响生：成在中适间宜产的物温后度，范即围使内再，增酶加促底反物应浓速度度，随中温间度产T升i物高tle浓而度增也加不，会超增过加最，适酶反促应反温应度速，度酶也活不力会将增会加下。降。
子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法 可测定蛋白酶酶活。
5
DNA-考溴马乙斯锭亮荧蓝光法分析法
• 溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使 DNA的荧光增加25倍。接近饱和的溴乙锭 (0.5µg/mL) 与DNA 混合时，其荧光增加量与 DNA的浓度呈正比。在DNA-组蛋白-溴乙锭溶 液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链 上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴 乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白 酶活性呈正比。通过测定DNA溶液的荧光增量 来计算蛋白酶的活性。
蛋白酶活性的测定方法
海熙
婷君
梅栋
2021/6/16
各种测定方法及原理
考马斯亮蓝法 甲醛滴定法
DHT-酪蛋白法 DNA-溴乙锭荧光分析法
X-光胶片法 福林酚法
考甲马醛斯滴亮定蓝法法
• 考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合， 主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是 精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料 的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶 液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测 定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
碱性蛋白酶活力分析方法研究
碱性蛋白酶活力分析方法研究张剑;赵雷敏;康林霞【摘要】通过福林法对液体碱性蛋白酶的活力进行了测定.研究比较了不同温度及pH下的酶促反应对酶活力测定方法的影响,结果显示:酶活力随反应温度的升高表现为先上升后下降,40～50℃时相对较稳定;pH降低对碱性蛋白酶活力有着负面影响.在确定出较优的适合碱性蛋白酶的活力测定方法后,进一步测试了该方法在液体洗涤剂酶活力测定中的应用,发现在洗涤剂中简单地加入酶制剂后,测定酶活力时会出现较大偏差,酶活力值不稳定.因此,在配制加酶液体洗涤剂时,应该对各种因素,例如温度、pH以及洗涤剂中各种成分与酶的相互影响等进行综合考虑.%Activity of liquid alkaline protease was measured by using Folin method. Effects of enzymatic reaction under different temperature and different pH on the enzyme activity assay were investigated and compared. Results showed that as the reaction temperature raises,the enzyme activity increases firstly and then declines j while lowering of the pH of the reaction shows negative impact of the alkaline protease activity. After the optimum conditions for alkaline protease activity assay were identified, the application of the assay method in the determination of enzyme activity of enzymed liquid detergent was further tested. It was discovered that if the enzyme was simply added and mixed with the liquid detergent, the measured enzyme activity of the detergent will appear big deviation and an unstable value. This phenomenon indicated that during the formulation of enzymed liquid detergent, many factors such as the temperature, pH,and the mutual influence of components in the detergent should be comprehensively considered.【期刊名称】《日用化学工业》【年(卷),期】2012(042)003【总页数】4页(P192-195)【关键词】蛋白酶;活力分析;福林法;液体洗涤剂【作者】张剑;赵雷敏;康林霞【作者单位】山西大学化学化工学院,山西太原 030006;山西大学化学化工学院,山西太原 030006;山西大学化学化工学院,山西太原 030006【正文语种】中文【中图分类】TQ925+.2酶由生物体中的活细胞经过各种生理活动产生，是一种具有催化作用的物质。
测定蛋白酶活力实验
测定蛋白酶活力实验一、实验目的1.加深了解酶活力的概念。
2.学习掌握测定蛋白酶活力的方法。
二、实验原理酶活力指酶催化某一特定反应的能力。
其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。
酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。
本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg酪氨酸所需的酶量。
实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。
产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。
因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。
三、仪器和试剂仪器:恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。
原料枯草杆菌蛋白酶：称取1g枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。
使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。
试剂1.Folin-酚试剂：在2L磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4.2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4.2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。
再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。
冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。
使用前用标准NaOH溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。
2. 0.2mol/L盐酸溶液3.0.04mol/L氢氧化钠溶液4.0.55mol/L碳酸钠溶液5.10%三氯乙酸溶液6.0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4.12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B液)。
碱性蛋白酶活力的测定
碱性蛋白酶活力的测定1、实验原理蛋白酶在一定的温度与pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
2、实验试剂2.1 福林试剂的制备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）25g、水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（Li2SO4）50g、水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1 000mL。
混匀，过滤。
制得的试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：1份福林试剂与2份水混合，摇匀。
2.2. 碳酸钠溶液（Na 2CO3）=0.4mol／l 称取无水碳酸钠42.4g，用水溶解并定容至1 000mL。
2.3. 三氯乙酸c（CCl 3·COOH）＝0.4mol／l 称取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1 000mL。
2.4. 氢氧化钠溶液（NaOH）＝0.5mol／l2.5. 盐酸溶液（HCl）＝lmol／l及0.lmol／l2.6. 硼酸缓冲溶液（pH10.5）甲液称取硼酸钠（硼砂）19.08g，加水溶解并定容至1 000mL。
乙液称取氢氧化钠4.0g，加水溶解并定容至1 000mL。
使用溶液：取甲液500mL、乙液400mL混匀，用水稀释至1 000mL。
上述各种缓冲溶液，均需用pH计校正。
2.7. 10g／L酪素溶液称取酪素1.000g，精确至0.001g，用少量0.5mol／L氢氧化钠溶液湿润后，加入适量的各种适宜pH值的缓冲溶液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL容量瓶中，用适宜的pH值缓冲溶液稀释至刻度。
碱性蛋白酶活力的测定
实验四碱性蛋白酶活力的测定一、实验原理以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。
溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。
因而采用Folin法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。
二、试剂和仪器试剂：0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）、5%三氯醋酸、1%酪蛋白溶液（称取5g酪蛋白置于500mL 0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）中，加热使其溶解）、0.4mol/L碳酸钠溶液、100μg/mL酪氨酸溶液、Folin试剂，稀释3倍使用仪器：水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器三、实验步骤1、酶液的萃取称取1g粗酶制剂置于研钵中，加少量缓冲液一起研磨，然后定容至100mL，从容量瓶中取出5mL酶液（视酶活而定）再定容至100mL，稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。
2、酶活力的测定样品管：取不同量的酶液（0.1~1.0mL：0.2mL、0.4mL、0.6mL），用0.1mol/L 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）（对应为0.8mL、0.6mL、0.4mL）补足体积到1.0mL，然后在每个样品管中再加入1mL预先在40℃保温的1%酪蛋白溶液，混匀，在40℃准确保温10min，加入2mL 5%三氯醋酸溶液，迅速摇匀，于室温静置半小时。
空白管：先在每支试管中各加入1.0mL 1%酪蛋白溶液和2.0mL 5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再加入1.0mL的酶液，酶液浓度分别与对应的样品管相同，在40℃下准确保温10min，以下操作同样品管。
将酶反应混合物过滤后收集滤液，在1mL滤液中加5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液和1mL Folin试剂，摇匀后在40℃恒温水浴中显色20 min，以相应的空白管中的反应液为对照，在680nm下测定样品管中反应液的吸光度。
碱性蛋白酶(AKP)活性检测试剂盒说明书__可见分光光度法UPLC-MS-4478
碱性蛋白酶（AKP）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：UPLC-MS-4478规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体35mL×1瓶4℃保存试剂一粉剂×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1瓶4℃保存试剂三液体50mL×1瓶4℃保存试剂四液体10mL×1瓶4℃保存标准品液体1mL×1支4℃保存溶液的配制：1、试剂一：临用前加入10mL蒸馏水，充分溶解；2、试剂二：临用前加入10mL提取液，沸水浴中搅拌溶解。
3、标准品：20μmol/mL标准酪氨酸。
产品说明：AKP是指在碱性条件下催化蛋白质肽键水解的酶类，属于丝氨酸蛋白酶。
此外，该酶还能够水解酯键、酰胺键，具有转酯及转肽的功能。
该酶是主要工业用酶之一，广泛应用于制药、丝绸、食品、制革等行业。
在碱性条件下，AKP水解酪蛋白生成酪氨酸；在碱性条件下，酪氨酸还原磷钼酸生成钨蓝；钨蓝在680nm有特征吸收峰，测定680nm吸光度增加速率，来计算AKP活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：研钵/匀浆器、台式离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 mL EP管、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）称约0.1g组织，加入1mL提取液，冰上充分研磨，10000rpm4℃离心10min，取上清，即粗酶液，置冰上待测。
或直接称取0.1g酶制品，加入1mL提取液，置冰上待测。
二、测定步骤1、分光光度计预热30min以上，调节波长至680nm，蒸馏水调零。
2、试剂一、试剂二和试剂三置于40℃水浴保温30min以上。
3、标准溶液的配制：临用前将20μmol/mL标准液用蒸馏水稀释80倍至0.25μmol/mL标准溶液使用，现用现配。
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实验三. 碱性蛋白酶活力测定【实验目的】1. 掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。
2. 学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。
【实验原理】酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。
酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。
测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。
酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。
由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。
碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。
酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。
（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。
）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。
【实验材料】1.实验器材电热恒温水浴槽；分析天平；容量瓶；移液管；721分光光度计2.实验试剂(1)福林试剂：在1L容积的磨口回流瓶中加入50g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、125g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、350ml蒸馏水、25ml 85％磷酸及50ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。
回流完毕，再加25g硫酸锂、25ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到500ml。
过滤，置于棕色瓶中暗处保存。
使用前加4倍蒸馏水稀释。
(2)1%酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内。
(3)pH10缓冲溶液：甲液（0.05mol/L硼砂溶液）：取硼砂(Na2B4O7·10H2O) 19克，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。
乙液：0.2mol/L氢氧化钠溶液配制pH10硼砂氢氧化钠溶液：吸取甲液50ml，再加入乙液21ml，用蒸馏水定容至200ml。
(4)标准酪氨酸溶液：精确称取酪氨酸50mg，加入1ml 1mol/L盐酸溶解后用蒸馏水定容至50ml，即得1mg/ml酪氨酸标准溶液。
(5)0.4mol/L碳酸钠溶液,0.4mol/L三氯醋酸溶液。
【实验操作】1.制备酪氨酸标准曲线(1) 取7支试管，编号，按下表配制不同含量的酪氨酸溶液。
（见下页）(2) 在上述7支试管中，分别加入1%酪蛋白溶液1ml，于40℃水浴中保温15分钟，取出后，加入0.4mol/L三氯醋酸3ml，充分摇匀，各管分别用滤纸过滤。
(3)分别吸取滤液1ml放入另7支试管中，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，充分摇匀，于40℃水浴中保温15分钟，然后于每管中各加入3ml蒸馏水，充分摇匀。
(4) 用721型分光光度计，以0号管作对照，在680nm处测定光密度。
(5) 以光密度为纵坐标，酪氨酸含量（微克数）为横坐标，绘制标准曲线。
2.样品测定(1)精确称取干酶粉2克，加入10ml pH10缓冲溶液，在小烧杯中溶解，并用玻璃棒搅拌，静止片刻后，将上层液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复搅拌溶解4次，最后全部移入200ml容量瓶中。
用缓冲溶液定容至刻度，充分摇匀，用二层纱布或四层纱布过滤，吸取滤液5ml，，移入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，所得液为稀释2000倍的酶液。
(2)取3支干燥的试管，按下表编号，并严格按照表中顺序加入试剂和操作。
摇匀后，各管分别过滤，吸取滤液1ml，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5ml，福林试剂1ml，充分摇匀，于40℃水浴保温15分钟，然后每管各加入3ml蒸馏水，摇匀。
用721型分光光度计在波长680nm处，以对照管为对照，测定两管的光密度。
【实验结果】1.本实验中碱性蛋白酶活力单位的定义：1克碱性蛋白酶粉在pH10，40℃的条件下，每分钟水解酪蛋白能产生1微克酪氨酸，定为一个酶活力单位。
2. 本实验中碱性蛋白酶活力单位的计算：每克碱性蛋白酶的活力单位= m / t ×fm：样品所测定的光密度值，经查标准曲线求得的酪氨酸量（μg）t：酶促反应的时间f：酶的稀释倍数，本实验中f = 2000【思考题】1.什麽是酶活力？酶活力是怎样计算的？2. 酶活力测定过程中应注意哪些问题？Experiment 3. Activity Assay of Alkaline Protease【Purpose】1.To grasp the principle of alkaline protease activity assay and the computation method ofprotease activity.2.To learn the approach and the basic operation of enzyme-catalyzed reaction speed assay.【Principle】Enzyme activity is the capability of catalyzing some chemical reaction. The value of enzyme activity may be expressed by the speed of some chemical reaction that catalyzes under certain conditions. Enzyme activity assay is to assay the speed of chemical reaction catalyzed by enzyme in reality.The speed of enzyme-catalyzed reaction may be expressed with the decrease of reaction substrate or the increase of product in unit time. Usually, assaying the resulting volume of the derivatives within per unit time is applied for the sake of sensitivity. Since enzyme-catalyzed reaction speed may be reduced along with time, we must assay the initial speed of enzyme-catalyzed reaction so as to assay enzyme activity correctly.Alkaline protease may catalyze casein to hydrolyze and generate tyrosine under the alkaline conditions. Tyrosine is aminophenol which contains phenolhydroxyl and may cause Folin-phenol reaction with Folin reagent (a mixture of phosphowolframate and phosphomolybdate). (Folin-phenol reaction: Folin reagent is very unstable under alkaline conditions; it is apt to be deoxidized by phenol combinations quantifica-tionally and creates a mixture of wolfram blue and molybdenum blue that wears various shades of blue.) By way of colorimetry, the formation volume of tyrosine can be assayed. Express enzyme activity with the amount of tyrosine derived from hydrolyzed casein.【Materials】1. ApparatusElectric-thermostatic water bath trough, Assay scale, Volumetric flask, Tubes for solution transfer, Tubes and tube shelf, Glass funnels, 721 spectrophotometer2. Reagent(1) Folin reagent: Add 50g of Na2WO4• 2H2O, 125g of Na2MoO4• 2H2O, 350ml of distilled water, 25ml of 85% H3PO4 and 50ml of concerntrated HC1 into a 1L round- bottom stoppered flask, mix well and reflux l0h. After refluxing, add 25g of Li2SO4, 25ml of distilled water, several drops liquid Br2, boil 15min without cap to get rid of excessive Br2. After cooling, dilute to a constant volume of 500ml by volumetric flask, filtrate, keep the filtrate in brown flask in darkroom. Add 4 times diluted water before using.(2) 1% casein solution: Weigh 1g casein in a mortar. Make it humid with a dollop of distilled water. Then add slowly 0.2 mol/L NaOH 4ml and grind it adequately. Wash it out into a volumetric flask. Put it into water tub and boil it 15 minutes. When it is cooled off, set the volume at 100ml and then store it into a refrigerator.(3) pH10 buffering solution:Solution A (0.05 mol/L borax solution): Weigh 19g borax (Na2B4O7•10H2O). Dissolve it in distilled water and set the volume at 1000ml.Solution B :0.2 mol/L sodium hydroxide solutionDecoct pH10 borax sodium hydroxide solution: Sip 50ml of Solution A Add in 21ml SolutionB. Set the volume at 200ml with distilled water.(4)Standard tyrosine solution: Weigh 50mg tyrosine precisely and add 1ml 1mol/L hydrochloric acid. When it is dissolved, set the volume at 50ml. Then we have 1mg/ml standard solution of tyrosine.(5) 0.4mol/L sodium carbonate solution, 0.4mol/L trichloroacetic acid solution. 【Procedures】1. Standard curve of tyrosine preparation(1) Prepare 7 tubes, number them, and then decoct tyrosine solution of various contents:(2) Add 1% 1 ml casein solution into the above-mentioned 7 tubes. Keep it in water bath at 40ºC for 15 minutes to preserve heat. After taking it out, add 0.4mol/L trichloroacetic acid 3ml, and shake it well. Each tube should be filtered with filter paper.(3) Sip 1ml filtered solution for each of the 7 tubes, respectively. Add 5ml 0.4mol/L sodium carbonate solution, 1ml Folin reagent, and shake well. Keep it in water bath at 40ºC for 15 minutes to preserve heat. Then add 3ml distilled water in each of the tubes and shake it well.(4)Assay the optical density at 680nm with 721 spectrophotometer as contrasted with Tube 0.(5) Draw standard curve by taking optical density as vertical ordinate and the tyrosine content (in microgram) as abscissa.2. Sample assay(1)Weigh 2 grams of dry enzyme powder, add in 10ml pH10 buffering solution. Let it dissolve in a small beaker, stir it with a glass rod. After moments of its slack, dump the upper layer of solution into the volumetric flask carefully. Add a touch of buffering solution to the residue. Stir the solution four times as such. Remove all of it into the 200ml a volumetric flask at last. Set the solution to the mark with buffering solution, shake it well, filter it with 2-layer or 4-layer gauze, imbibe 5ml filtrate solution, and transfer it into 100ml volumetric flask. Dilute it with distilled solution and then what we have is enzyme solution that has been diluted 2000 times.(2)Take out 3 dry tubes. Number them in line with the following table. Add reagent and operate in strict accordance with the order in the table.Shaking it well, filter each tube respectively. Imbibe 1ml solution, add 5ml 0.4mol/L sodium carbonate solution, 1ml Folin reagent, shake it up forcefully. Keep it in the water bath at 40ºC for 15 minutes to preserve heat. Afterwards, add 3ml distilled water into each tube, shake it well. Assay the optical density of the two tubes at wavelength 680nm with 721 spectrophotometer inantithesis to the contrasted tub e.【Results】1. The definition of the activity unit of alkaline protease of this experiment:1g alkaline protease under the conditions of pH10, 40ºC, and hydrolyzed casein may produce 1mg tyrosine each minute that is defined to be 1 enzyme activity unit.2. The computation of the activity unit of alkaline protease of this experiment:Activity unit of each gram of alkaline protease = m / t × fm: the value of the optical density assayed from the sample. Check the standard curve and we have the volume of tyrosine (μg).t: time for enzyme-catalyzed reactionf: the dilution multiple of enzyme. In this experiment, f = 2000【Questions】1. What is the activity of enzymes? How to computate the activity of enzymes?2. What are the attentions in the alkaline protease activity assay?。