CRISPR_Cas9_基因编辑技术简介
crispr cas9原理简介
crispr cas9原理简介CRISPR-Cas9基因编辑技术，是一种通过靶向剪切基因组中特定DNA序列的方法。
该技术最初源自一种天然的细菌免疫系统，可用于编辑生物体的基因组。
CRISPR（簇状规律间隔短回文重复序列，Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是细菌和古细菌基因组中的一种特殊DNA序列，以重复、间隔和短回文特点而命名。
CRISPR序列常常与Cas（CRISPR-associated protein）基因一起出现，这些Cas基因编码一类能够识别并修剪DNA的酶。
CRISPR-Cas系统中最常用的是Cas9酶，它是通过向CRISPR-Cas9复合物中引入特定的RNA分子来实现DNA靶向。
这种RNA分子称为单导RNA（sgRNA），它是一种具有20个核苷酸的短链RNA，结合了用于指引Cas9定位到特定目标序列的脱氧核苷酸。
sgRNA与Cas9酶形成复合物后，可以通过碱基互补配对与基因组DNA中的目标序列结合。
当sgRNA与Cas9复合物与目标DNA序列配对时，Cas9酶便会被激活并剪切其靶向序列。
这一过程引发DNA修复机制，使得目标序列得以重组或删除。
如果提供了外源DNA修复模板，修复机制还可以将该模板中的DNA片段插入到被剪切的部分，实现想要的基因修饰。
CRISPR-Cas9技术的优势在于其简单性和高效性。
相较于传统的基因编辑技术，CRISPR-Cas9可以更加准确地指定目标序列，并在短时间内完成基因组的编辑。
它已被广泛应用于基础科学研究、生物医学研究以及农业领域，为基因治疗和作物改良等领域带来了突破性的进展。
CRISPR-Cas9技术原理
CRISPR/Cas9概述技术原理：CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术，是一个细菌及古细菌进化出来用以抵御病毒和质粒入侵的适应性机制。
CRISPR/Cas系统的高效基因编辑功能已被应用于多种生物，包括斑马鱼、小鼠、大鼠、秀丽隐杆线虫、植物。
此系统的工作原理是crRNA (CRISPR-derived RNA) 通过碱基配对与tracrRNA (trans-activating RNA) 结合形成tracrRNA/crRNA 复合物，此复合物引导核酸酶Cas9 蛋白在与crRNA 配对的序列靶位点处剪切双链DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA (guide RNA)，足以引导Cas9 对DNA 的定点切割。
作为一种RNA导向的dsDNA 结合蛋白，Cas9 效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，它能够共定位RNA、DNA 和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。
将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9 nuclease-null)融合，并表达适当的gRNA，即可靶定任何dsDNA 序列，而RNA 可连接到gRNA 的末端，不影响Cas9 的结合。
因此，Cas9 能在任何dsDNA 序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。
CRISPR/Cas9技术特点：1）可实现对靶基因多个位点或多个基因同时敲除；2）可对基因进行定点修饰（Tag、GFP、RFP、点突、条件性敲除），效率高。
3）实验周期短，价格低；4）可应用于大、小鼠等，无物种限制。
crispr cas9工作原理
crispr cas9工作原理
CRISPR-Cas9是一种基因编辑技术，其工作原理可以分为三个主要步骤：适应、切割和修复。
1. 适应：CRISPR-Cas系统最初通过识别和适应外源DNA的
序列来开始工作。
这一步骤发生在细菌或古细菌中，它们利用Cas蛋白和一段短的RNA序列来识别和保存外源DNA序列。
2. 切割：一旦适应完成，CRISPR-Cas系统可以进行基因编辑。
在这一步骤中，细菌通过产生一种叫做sgRNA (单导RNA)的RNA分子，该分子拥有与目标基因序列相匹配的部分。
sgRNA与Cas9蛋白结合形成复合物，这个复合物可以前往细
胞核。
sgRNA和Cas9复合物会识别和结合到目标基因的特定DNA
序列上。
一旦结合成功，Cas9蛋白便会发挥剪刀的作用，切
割目标DNA，并形成双链断裂。
3. 修复：当DNA双链断裂发生时，细胞会尝试修复这一伤口。
通常有两种修复机制：
- 非同源末端连接（NHEJ）：这是一种快速但不精确的DNA
修复机制。
在NHEJ中，细胞会直接连接断裂的DNA末端。
这种修复方式可能会导致插入缺失或碱基改变，从而导致基因功能的改变。
- 同源重组（HDR）：这是一种较慢但更精确的修复机制。
在
HDR中，细胞会利用一个同源的DNA模板来修复断裂的DNA。
这种修复方式可用于插入、删除或修改目标基因的具体部分。
通过CRISPR-Cas9技术，我们可以精确地切割和修改基因，进而研究和改变生物体的特性和功能。
这项技术在基因治疗、农业改良和生命科学研究等领域具有广泛的应用前景。
CRISPRICas9基因编辑器及其原理简介
CRISPR/Cas9基因编辑器及其原理简介CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats），被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。
后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。
CRISPR担当细菌的防护罩CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。
前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。
重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。
重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。
Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。
通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。
该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写为Cas。
目前发现的Cas包括Cas1～Cas10等多种类型。
Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。
CRISPR技术概述
CRISPR技术概述近年来，基因编辑技术成为科学研究和医学应用的热门话题。
其中，一项被誉为“基因剪刀”的CRISPR技术引起了广泛关注。
CRISPR作为一项新兴技术，究竟是什么，有哪些应用？本文将简要介绍CRISPR技术的基本原理、应用和前景。
一、CRISPR的概念CRISPR是簇间重复序列和间隔序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）的缩写。
CRISPR/ Cas9技术是一种高效、简单、快速地剪切或修改DNA序列的工具，被视为目前基因编辑领域中最有潜力的技术之一。
CRISPR系统最初是从细菌中发现的。
细菌通过这种系统辨别、切除和保护其自身免受病毒等外源性DNA攻击。
CRISPR系统主要由两部分组成：CRISPR和Cas (CRISPR Associated protein)。
其中，CRISPR是一种短小的DNA序列，类似于细菌的免疫记忆系统，记录之前感染过的病毒序列。
Cas则是CRISPR蛋白酶复合物，能够识别和切割这些外来DNA序列。
二、CRISPR技术的原理CRISPR技术是一种基于RNA导引的基因编辑技术，其原理基于Cas9蛋白的切割功能。
Cas9蛋白在浓缩的RNA靶向分子的作用下，可精确切割DNA，从而进行基因编辑。
利用CRISPR/Cas9技术，DNA可以被准确地分为三个部分。
第一部分是PAM序列，即Cas9靶向的酶切位置。
第二部分是RNA导向序列，即能够与目标DNA序列配对的RNA分子。
最后一个部分是天然的DNA骨架。
当靶向分子与目标DNA序列配对时，Cas9蛋白质可以精确地切割DNA链。
三、CRISPR技术的应用CRISPR技术已经成为基因编辑领域前沿的重要工具之一，可用于治疗各种不同类型的疾病，如癌症、遗传性疾病、心血管疾病等。
下面将介绍CRISPR技术的几个应用实例。
1.基因疗法利用CRISPR技术，科学家可以更准确地定位需要编辑的DNA，并删除或添加特定基因。
crispr cas9技术
1.2 .CRISPR/Cas9作用机理
CRISPR-Cas系统的结构：CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由 不连续的重复序列R( repeat) 与长度相似的间区序列 S( spacers) 间隔排列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列CRISPR 相关蛋白基因cas。
CRISPR/cas9基因编辑技术及应 用
——— 一种来源于细菌获得 性免疫由RNA指导Cas蛋白对靶 向基因获得性修饰的技术
1. CRISPR-Cas系统简介
• 1987 年，日本课题组在K12 大肠杆菌的 碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序 列，随后发现其广泛存在于细菌和古细菌 的基因组中，2002 年，正式将其命名为 成簇的规律间隔的短回文重复序列 (CRISPR)
在一起得到sgRNA（singleguideRNA）。融合的RNA具有与
野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使
用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可
以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行
操 Ca作s9技术介导单基因细胞系敲除的实验流程（Cas9质粒建立 k1n、oc设k-计ou识t细别靶胞位系点）的一对DNA Oligos
CRISPR/技术的前景及优缺点
1CRISPR-Cas9技术的优势
而且从实际应用的角度来说，CRISPRs比TALENs更容易操作，因为 每一对TALENs都需要重新合成，而用于CRISPR的gRNA只需要替换 20个核苷酸就行。
基因组编辑技术CRISPRCas9原理及应用
基因组编辑技术CRISPRCas9原理及应用CRISPR-Cas9基因组编辑技术：原理、应用与前景引言：近年来，CRISPR-Cas9基因组编辑技术引起了广泛的关注，并被誉为“基因编辑的革命”。
由于其高效、精准、廉价、简便等特点，CRISPR-Cas9已被广泛应用于生命科学研究、疾病治疗、农业改良和生物制药等领域。
本文将首先介绍CRISPR-Cas9的原理，然后探讨其在不同领域的应用，并展望其未来发展前景。
一、CRISPR-Cas9基因组编辑技术的原理：CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种常见于细菌和古菌的基因组中存在的一类短重复序列，它们的间隔区域（spacers）存在与外源侵略元素（例如噬菌体、质粒）的序列（protospacers）相对应的片段。
CRISPR系统通过将外源侵略元素的DNA序列整合到自身基因组中，形成新的spacer，从而构建了一种免疫记忆系统。
Cas9是一种细菌来源的蛋白质，具有剪切DNA双链的能力。
当发生外源侵袭时，CRISPR系统将受到侵略元素的DNA序列转录成非编码的crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating CRISPR RNA），以及一个编码Cas9的mRNA。
这些RNA分子最终会结合形成成熟的gRNA （guide RNA），并与Cas9蛋白质形成复合体。
gRNA通过与目标DNA序列的互补配对，引导Cas9蛋白质与目标DNA序列结合，并且Cas9蛋白质的核酸酶活性将目标DNA双链切割成两段。
二、CRISPR-Cas9技术在生命科学研究中的应用：1.基因功能研究：通过CRISPR-Cas9技术，可以有效地靶向特定基因的编码区域进行敲除、靶向特定位点进行基因突变，从而揭示基因在生物系统中的功能和调控机制。
这种基因编辑技术的高效性和精确性，使得科学家们能够更加准确地研究基因与表型之间的关联，有助于解析复杂疾病的发病机制。
基因编辑技术CRISPRCas9的应用方法总结
基因编辑技术CRISPRCas9的应用方法总结CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种革命性的生物工程工具，它利用细菌体内天然存在的免疫系统来精确修改基因。
自从2012年首次引入以来，CRISPR-Cas9已经被广泛用于改变生物学研究和医学治疗的方式。
本文将介绍CRISPR-Cas9的原理、应用方法，并总结其在不同领域的应用。
### CRISPR-Cas9的原理CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种存在于细菌和古生菌基因组中的DNA序列，它记录了它们所受到的外来病毒基因组的片段。
Cas9是CRISPR系统中的一种蛋白质，具有剪切DNA 的能力。
利用这种系统，科学家们成功将CRISPR-Cas9技术应用于编辑生物体的基因。
CRISPR-Cas9系统的工作原理如下：1. 选择目标基因：确定需要编辑的特定基因序列，并设计与其互补的RNA引导分子（sgRNA）。
2. sgRNA的结合：通过合成互补基因组DNA片段成为单链RNA，与Cas9蛋白结合成一个复合物。
3. 定位到基因组：CRISPR-Cas9复合物进入靶细胞，通过与目标基因的序列互补对应，定位到特定的基因位点。
4. 剪切DNA：Cas9蛋白通过剪切DNA的方式精确修改目标基因，形成双链断裂。
5. 修复机制介入：细胞自身的DNA修复机制介入，通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）方式修复双链断裂。
6. 基因修复：通过修复机制，引入目标基因的缺陷或修复，实现基因编辑。
### CRISPR-Cas9的应用方法CRISPR-Cas9技术的应用方法主要包括基因敲除、基因敲入和基因打靶等。
下面将详细介绍这些方法：#### 1. 基因敲除基因敲除是指通过CRISPR-Cas9技术使目标基因完全失活。
其步骤如下：- 设计sgRNA：选择目标基因的外显子序列，设计与之相互配对的sgRNA。
基因编辑技术CRISPRCas9的使用指南
基因编辑技术CRISPRCas9的使用指南CRISPR-Cas9 基因编辑技术的使用指南引言：CRISPR-Cas9 基因编辑技术是一项革命性的生物技术，它能够准确地修改细胞或组织中的基因序列。
这项技术的发展开辟了新的研究领域，并有望推动医学、农业和生命科学领域的革新。
本文将详细介绍 CRISPR-Cas9 基因编辑技术的原理和步骤，以及一些常见的应用和未来的发展方向。
一、原理和步骤1. CRISPR-Cas9 系统原理CRISPR-Cas9 系统来源于大肠杆菌的抗病毒防御机制，其中CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）位于基因组中，Cas9 是一种核酸酶。
CRISPR-Cas9 基因编辑技术利用 CRISPR 导向 Cas9 酶精确切割靶基因的 DNA 序列，然后通过细胞自身的修复机制来修改该基因。
2. CRISPR-Cas9 基因编辑步骤（1）设计CRISPR RNA（crRNA）和转导RNA（tracrRNA）：crRNA 导向 Cas9 酶与靶基因结合，tracrRNA 与 crRNA 组成双RNA复合物。
（2）构建 CRISPR-Cas9 表达载体：将 tracrRNA 和 crRNA 序列合并，并插入携带 Cas9 基因的质粒，以构建 CRISPR-Cas9 表达载体。
（3）转染细胞：将CRISPR-Cas9 表达载体转染到目标细胞中。
（4）选择靶基因序列：根据研究需求，选择靶基因序列进行编辑。
（5）CRISPR-Cas9 基因编辑：Cas9 酶与 crRNA 引导的tracrRNA 结合后，结合到靶基因序列上，并切割目标DNA 序列。
（6）修复过程：细胞利用自身的修复机制修复被切割的DNA，可能通过非同源末端连接、同源重组或NHEJ机制来修复。
二、常见的应用1. 功能研究CRISPR-Cas9 技术可以通过靶向关键基因，在不同细胞类型中进行基因敲除、基因静默或基因突变，从而帮助科学家们研究基因功能的作用和机制。
基因编辑——CRISPR-Cas9技术的革命性影响
基因编辑——CRISPR-Cas9技术的革命性影响一、CRISPRCas9技术概览CRISPRCas9，全称“成簇规律间隔短回文重复序列CRISPR相关蛋白9”，是一项革命性的基因编辑技术，它使得科学家能够准确地定位并修改DNA序列，从而改写生物的遗传蓝图。
1.1 技术原理与根基CRISPRCas9系统起源于细菌和古菌的天然防御机制，它们用此来抵挡病毒侵袭。
系统的核心由CRISPR RNA（crRNA）和Cas9酶组成。
crRNA携带一段与目标DNA互补的序列，而Cas9酶则具备剪切DNA的能力。
一旦crRNA与目标DNA配对，Cas9酶会精准地切割DNA双链。
接着，细胞的自然修复过程可能导致突变，或者研究人员可以通过提供修复模板来引导特定的基因修改。
1.2 应用广度与影响力CRISPRCas9技术的诞生极大地推进了生命科学的研究进程，其应用无处不在：1.2.1 疾病研究与治疗CRISPR已应用于研究和治疗一系列遗传疾病，如囊性纤维化、镰状细胞病，甚至某些类型的癌症。
通过修复或关闭致病基因，科学家期待开辟新的治疗途径。
1.2.2 农业生物科技在农业领域，该技术被用来增强作物的抗虫、抗病和耐逆性，提升产量和营养价值。
1.2.3 生物工程与工业生产CRISPR也被用来改造微生物，以制造生物燃料、药品以及其他有价值的化学品。
1.2.4 基础科学研究在基础生物学研究中，CRISPRCas9是揭示基因功能、探索细胞调控机制和阐明疾病发病机制的不可或缺的工具。
然而，伴随着CRISPRCas9的巨大潜力，也引发了关于伦理和社会的深刻讨论，如基因编辑可能造成的不可逆影响以及公平性问题。
因此，全球科研社群正致力于构建相应的伦理准则和监管框架，以保障这项技术的安全和负责任使用。
二、医疗领域的应用科技进步在医疗领域中扮演着日益重要的角色，尤其是在遗传疾病治疗方面，科学家们正以前沿的技术和创新方法开辟新的治疗路径。
2.1 遗传疾病治疗的革新遗传疾病源于基因突变，它们可以由父母遗传，也可能在个体的生命过程中自发产生。
CRISPRCas9技术介绍
CRISPR/Cas9技术介绍一、CRISPR/Cas9系统的构成CRISPR(clustered,regularly interspaced,short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。
在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR/Cas9系统应用最为广泛。
Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。
Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
研究人员为了将CRISPR/Cas9技术发展为高效的基因打靶工具，又进行了优化和改造。
Cong, L.等人[1]在不影响系统效率的情况下，将crRNA和tracrRNA融合为一条RNA。
通过这种简化，CRISPR/Cas9系统现仅包括两个元素：Cas9蛋白和sgRNA（single guide RNA）。
因此现在人们将CRISPR/Cas9技术也称为Cas9/sgRNA技术。
二、CRISPR/Cas9技术的基因编辑机制CRISPR/Cas9通过对预设的DNA位点进行切割，造成DNA双链断裂（DSB, double strand break）。
这种DNA的损伤可以启动细胞内的修复机制，主要包括两种途径：一是低保真性的非同源末端连接途径（NHEJ，Non-homologous end joining），此修复机制非常容易发生错误，导致修复后发生碱基的缺失或插入（Indel），从而造成移码突变，最终达到基因敲除的目的。
NHEJ是细胞内主要的DNA断裂损伤修复机制。
CRISPR-Cas9 基因编辑技术的原理和应用
CRISPR/Cas9 基因编辑技术的原理和应用引言基因编辑（gene editing）是指利用人工设计的核酸酶或核酸分子，对目标DNA 序列进行特异性的切割、修复或替换，从而实现对基因组的精确操作和改造。
基因编辑技术可以用于研究基因功能、调控基因表达、修复遗传缺陷、改善农业生物性状、开发新型生物制品等方面，具有广阔的应用前景。
CRISPR/Cas9 是一种基于细菌CRISPR-Cas 系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins）的基因编辑技术，它利用RNA 引导的DNA 酶Cas9 切割目标DNA 序列，并借助细胞自身的DNA 修复机制，实现对基因组的序列特异性编辑。
CRISPR/Cas9 技术具有操作简单、效率高、成本低、适用范围广等优点，已经在多个领域得到了广泛的应用。
本文将介绍CRISPR/Cas9 基因编辑技术的原理和应用，包括Cas9 的结构和功能、sgRNA 的设计和合成、Cas9 介导的基因编辑的步骤和机制、Cas9 介导的基因编辑的应用和展望等方面。
Cas9 的结构和功能Cas9（CRISPR-associated protein 9）是一种来自细菌CRISPR-Cas 系统的核酸酶，能够在单链RNA（sgRNA）的引导下，特异性地识别并切割目标DNA 序列。
Cas9 的结构可以分为两个部分：α 螺旋识别部分（REC）和核酸酶部分（NUC）。
REC 部分负责识别sgRNA 和靶标DNA 杂合的区域和sgRNA 骨架。
NUC 部分包含RuvC-like 核酸酶结构域、HNH 核酸酶结构域、识别PAM 的PI 结构域以及进化上趋异的WED 结构域。
HNH 结构域和RuvC 结构域分别负责切割靶标DNA 双链的不同链。
PI 结构域通过碱基特异性相互作用和PAM 区结合，保证了Cas9 靶向的特异性。
CRISPR及Cas9基因编辑技术具体步骤及方法
CRISPR/Cas9基因编辑技术具体步骤及方法CRISPR/Cas9 是一种能够对基因组的特定位点进行精确编辑的技术。
其原理是核酸内切酶Cas9蛋白通过导向性RNA（guide RNA, gRNA）识别特定基因组位点并对双链DNA进行切割，细胞随之利用非同源末端连接(Non homologous End Joining，NHEJ）或者同源重组（Homologous Recombination, HR）方式对切割位点进行修复，实现DNA水平基因敲除或精确编辑。
CRISPR基因敲除利用CRISPR / Cas9 进行单基因敲除目前研究最透彻、应用最广泛的II 型-CRISPR/Cas9 系统由两部分组成：1. 单链的guide RNA（single-guide RNA，sgRNA）2. 有核酸内切酶活性的Cas9 蛋白CRISPR/Cas9 系统利用sgRNA 来识别靶基因DNA，并引导Cas9 核酸内切酶剪切DNA（图1）。
当基因组发生双链DNA 断裂后，细胞通过非同源性末端接合(Non-homologous end joining, NHEJ) 将断裂接合，在此过程中，将随机引入N 个碱基的缺失或增加，若N 非3 的倍数，则目的基因发生移码突变，实表1 CRISPR/Cas9 基因敲除与RNAi 比较CRISPR过表达利用CRISPR / Cas9 进行单基因过表达通过修饰CRISPR/Cas9 系统中的一些元件，形成一种蛋白复合物-协同激活介质（SAM），可实现对多数细胞内源基因的特异性激活。
该系统灵活方便，为研究基因功能提供了极为便利的工具。
CRISPR-SAM 系统由三部分组成：1. 失去核酸酶活性的dCas9（deactivated Cas9）-VP64 融合蛋白2. 含2 个MS2 RNA adapter 的sgRNA3. MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白CRISPR-SAM 系统中的MS2-P65-HSF1 激活辅助蛋白就是SAM，全称为SynergisticActivation Mediator( 协同激活调节器)，这也就是CRISPR-SAM 的命名由来。
CRISPR–Cas9 系统的原理和应用
CRISPR–Cas9 系统的原理和应用引言CRISPR–Cas9 系统是一种基于RNA 的可编程的基因组编辑技术，它源自细菌和古菌的一种自我防御机制。
CRISPR–Cas9 系统由两个主要组成部分构成：一个Cas9 核酸内切酶，它可以识别并切割特定的DNA 序列，以及一个单链导向RNA（sgRNA），它可以将Cas9 导向目标DNA 序列。
CRISPR–Cas9 系统具有高效、精确和灵活的特点，使其成为一种强大的基因组编辑工具，可以用于多种生物学应用。
Cas9 的结构和功能Cas9 是CRISPR–Cas9 系统中的核心蛋白，它负责识别和切割目标DNA 序列。
Cas9 的结构由两个核酸内切酶结构域（HNH 和RuvC-like）和两个RNA 结合结构域（REC 和PI）组成。
Cas9 通过与sgRNA 的crRNA 和tracrRNA 部分结合，形成一个复合物，可以在目标DNA 上形成一个双链RNA-DNA 夹层。
Cas9 识别目标DNA 序列的依据是两个因素：一是sgRNA 与目标DNA 的互补碱基配对，二是目标DNA 旁边的一个短序列，称为原发动机相邻位点（PAM），它是Cas9 的活性所必需的。
当Cas9 与目标DNA 结合时，它的两个核酸内切酶结构域会在与sgRNA 结合的位置切割双链目标DNA 的一条链，从而产生一个双链断裂（DSB）。
Cas9 的变体和功能调控通过对Cas9 的结构或功能进行改造，可以产生不同的Cas9 变体，以实现不同的基因组编辑目的。
例如，当其中一个核酸内切酶结构域发生突变时，Cas9-sgRNA 复合物就变成了一个序列和链特异性的镍酶（Cas9n）。
当使用两个靠近并且靶向相反DNA 链的sgRNA 时，这种“双”Cas9 镍酶就能产生具有定义过hangs的双链断裂（DSB）。
最常用的Cas9n 是D10A，其中RuvC 结构域发生突变，产生5′ 过hangs 。
CRISPR-Cas9技术优化
▪ CRISPR-Cas9在农业领域的应用
1.CRISPR-Cas9技术可以用于改良农作物，提高作物的抗病性 、抗虫性和抗旱性。 2.通过CRISPR-Cas9技术，研究人员可以精确地编辑作物的基 因，以提高作物的营养价值或改善作物的品质。 3.目前，CRISPR-Cas9已经在一些农作物中展示出良好的改良 效果，如改良水稻、小麦等粮食作物。
CRISPR-Cas9技术的应用领域
▪ CRISPR-Cas9在生物研究中的应用
1.CRISPR-Cas9技术可以用于快速、高效地构建基因敲除或基 因过表达的细胞或动物模型。 2.通过CRISPR-Cas9技术，研究人员可以精确地编辑细胞或动 物的基因，以研究基因的功能和疾病机制。 3.目前，CRISPR-Cas9已经成为生物研究中最常用的基因编辑 工具之一。
CRISPR-Cas9技术简介
▪ CRISPR-Cas9技术的优势
1.CRISPR-Cas9技术具有操作简便、效率高、成本低等优点。 2.与传统的基因编辑技术相比，CRISPR-Cas9技术更加精准， 错误率更低。 3.CRISPR-Cas9技术可以广泛应用于生物学、医学、农业等领 域。
▪ CRISPR-Cas9技术的应用领域
CRISPR-Cas9技术优化
目录页
Contents Page
1. CRISPR-Cas9技术简介 2. CRISPR-Cas9的工作原理 3. CRISPR-Cas9技术的优势 4. CRISPR-Cas9技术的应用领域 5. CRISPR-Cas9技术存在的问题 6. 优化CRISPR-Cas9的策略和方法 7. 优化后的CRISPR-Cas9应用案例 8. CRISPR-Cas9技术的未来展望
CRISPR-Cas9的优化策略
CRISPR_Cas9_基因编辑技术简介
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
4.CRISPR/Cas9系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA 链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明, 这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用 的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
Cas9蛋白不具特异性
CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1012bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
6.降低脱靶效应
Cas9切口酶
通过点突变的方 法，使Cas9只有 单链切割活性， 类似于切口酶
沈彬，2015
7.视频：基因编辑CRISPR-Cas9原理
知识回顾 Knowledge Review
祝您成功！
?crisprcas系统活性的发挥或外源遗传物质的干扰?crrna结合相关的cas蛋白后形成crrnacas蛋白复合体通过碱基互补配对精确地与目标dna相结合随后cas蛋白对目标dna进行断裂和降解
基因编辑技术CRISPR/Cas9
1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编 码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近 存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究 发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
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1.CRISPR/Cas系统概述
1987年，日本大阪大学（Osaka University） 在对一种细菌编 码的碱性磷酸酶基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近 存在一小段不同寻常的DNA片段，但一直不清楚功能。后来的研究 发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。
2002年才正式命名为成簇的规律间隔性短回文重复序列 CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats).
2013年之后，研究者们在《science 》和《nature》等国际著 名杂志上发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，并且已成功在人类、 小鼠、斑马鱼等物种上实现精准的基因修饰。
6.降低脱靶效应
添加同源臂(homology arm,HR)
Y效应
FoKI-dCas9
Nicolas Wyvekens et al.2015
6.降低脱靶效应
CRISPR/Cpf1系统
Cpf1系统更简单一些，它只需要一条 RNA。Cpf1酶也比标准SpCas9要小， 使得它更易于传送至细胞和组织内。
1.CRISPR/Cas系统概述
1.2CRISPR系统获得：
CRISPR/Cas系统是很多细菌和大部分古细菌的天然免疫系 统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别，利用Cas蛋白 进行切割，从而达到对自身的免疫。
2.CRISPR/Cas系统结构
2.1CRISPR/Cas 主要由两部分组成：
2.CRISPR/Cas系统结构
4.CRISPR/Cas9系统
酿脓链球菌
4.CRISPR/Cas9系统
4.CRISPR/Cas9系统
gRNA 在线设计工具：
CRISPR Design Tool: / E-CRISPR: ZiFiT: / Cas9 Design: http://cas9 /index.jsp Cas-OFFinder: /cas-offinder/ CCTop: http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/
4.CRISPR/Cas9系统
Jinek等创造性的把crRNA和部分tracrRNA融合成一条嵌合的RNA 链,使其同时具有crRNA和tracrRNA的特性,随后的切割实验表明, 这条嵌合的RNA同样可以引导Cas9切割目标DNA。现在普遍使用 的都是crRNA和全长tracrRNA 融合体,简称 sgRNA (single guide RNA)
Cas9蛋白不具特异性
CRISPR/Cas9与靶位点识别的特异性主要依赖于gRNA与靠近PAM处1012bp碱基的配对，而其余远离PAM处8-10bp碱基的错配对靶位点的识 别影响不大。
6.降低脱靶效应
Cas9切口酶
通过点突变的方 法，使Cas9只有 单链切割活性， 类似于切口酶
沈彬，2015
4.CRISPR/Cas9系统
4.CRISPR/Cas9系统
CRISPR/Cas 作用： 基因敲除或 脱靶效应
2013年，研究者们发表多篇文章介绍CRISPR/Cas9系统，但CRISPR/Cas9 目前仍存在一个很严重且无法避免的问题，即潜在的脱靶效应不可消 除。
2.CRISPR/Cas系统结构
2.3Cas家族：
Cas(CRISPR associated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链 DNA核酸酶，能在guide RNA 引导下对靶位点进行切割。它与 fokI酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。
3.CRISPR/Cas9系统作用机制
tracrRNA会与crRNA形 成二聚体指导Cas对 双链DNA的切割。
4.CRISPR/Cas9系统
Cas9是一种核酸内切酶,其具有：RuvC和HNH两个内切酶活性中心 Jinek等发现Cas9在细菌和试管里对双链DNA具有强烈的切割能 力,但是这种切割能力需要的crRNA和tracrRNA介导。
Cpf1以一种不同于Cas9的方式切割DNA。 Cas9切割留下“平端”（blunt ends）。
Cpf1复合物生成的两条链切口是偏 移的，在裸露端留下了短悬端 （overhang）。这预计有助于精确 插入。
Cpf1切口远离识别位点。
Feng Zhang et al. 2015
Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System
CRISPR基因座的表达（包括转 录和转录后的成熟加工）
当该噬菌体再次入侵细菌时， CRISPR簇首先转录为长的 crRNA前体，然后逐步加工成 小的成熟的crRNA.
CRISPR/Cas系统活性的发 挥或外源遗传物质的干 扰
crRNA结合相关的Cas蛋白后， 形成crRNA-Cas蛋白复合体， 通过碱基互补配对精确地 与目标DNA相结合，随后 Cas蛋白对目标DNA 进行断 裂和降解。
2.2CRISPR结构：
CRISPR是一种特殊的DNA 重复序列家族，广泛分布于细菌 和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序 列(repeats)组成，重复序列的长度通常为21--48bp，重复序列之 间被26--72bp间隔序列(spacer)隔开。CIRSPR通过这些间隔序列 (spacer)与靶基因进行识别。
7.视频：基因编辑CRISPR-Cas9原理
知识回顾 Knowledge Review
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4.CRISPR/Cas9系统
Type Ⅱ 因其简单性及可操作性，被改造成有力的基因工程工具--
CRISPR/Cas9。现在广泛使用的CRISPR/Cas9系统来源于酿脓链球菌。
Type II系统具有以下特点：
在CRISPR/Cas基因座 上游会表达tracrRNA;
tracrRNA会参与 crRNA的加工，这个 工程亦需要RNaseIII 的参与；
1.CRISPR/Cas系统概述
1.1CRISPR的分布与分类：
已测序的接近90%的古细菌和40%的细菌的基因组或是质粒 中至少存在CRISPR 基因座。
根据Cas 基因核心元件序列的不用，CRISPR/Cas 免疫体统分 为3中类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas免疫系统 需要多个Cas蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas9 免疫系统只需要一个Cas9蛋白来切割DNA双链，目前Ⅱ型系统是 被改造的最成功的人工核酸内切酶。