紫外分光光度法原理

VB12标准液浓度为30μg/ml，蒸馏水调零，用 361nm测定吸光度A，计算：测定液中VB12含量 （μg/ml）=（A样品/A标准品）×30；注射液中 VB12含量（μg/ml）=（A样品/A标准品）×30 ×n （稀释倍数）÷V（取样量,ml）
几，其数值只能＜1，从0~100%。为了方便起 见，经常用透光度的负对数－IogT来表示溶液 吸收光线的情况，并称为吸光度(ABS)、消光度 (E)、或光密度(OD或D)，这样，ABS= K·L·C
该式说明溶液的吸光度和浓度C、厚度L之间皆 成正比关系。当厚度一定时，溶液的浓度增加， 则吸光度成正比地增加，这就是比色分析的依 据。实际使用中，溶液的厚度就是比色杯的厚 度，它是相对固定的，有0.5、1、2、4cm的比 色杯，使用最多的是1cm的比色杯。
4.应用摩尔吸光系数测定浓度:一般的比色分析 中都有标准品，未知样品都是通过和标准溶液
对比分析含量。某些情况下，没有标准品，可
以用摩尔吸光系数或百分吸光系数进行测定，
直接测定溶液的吸光度，通过和该纯物质的吸
光系数比较，可以计算出浓度。这样的分析需 要经过精确校正了波长的分光光度计，紫外分 光光度计的波长一般精确到2nm，可以承担这 样的分析。如果知道分子量的话，百分吸光系 数和摩尔吸光系数之间可以互相换算，换算公 式是：百分吸光系数=10×摩尔吸光系数÷物 质的分子量。
第七章 紫外分光光度法的原理和应用
一. 比色分析的原理：光是一种电磁波，它 的波长用nm或Ǻ为单位，人的眼睛所能感觉到 的光波长约400～760 nm，这之间的光波称为可 见光。短于400 nm的叫紫外线，短于200nm的 叫远紫外线，再短的就是X射线和γ射线了。长 于760nm的叫红外线，红外线可长达5mm，再 长的就是无线电波了。
E的定义是：某波长光通过1cm杯、1mol/L或 1%浓度的某溶液时，该溶液对该波长光的吸光 度。E在特定波长、1mol/L或1%浓度、特定溶 剂条件下是该物质的一个特征常数，反映该物 质的吸光能力，资料和测定时都要标明其特征
波长或最大吸收波长，表示为Emol~nm,max,1cm或 E%~nm，max，1cm。许多物质的吸光系数在书或资料 中可以查到，如药典规定VB12应该有278±1 nm、 361±1nm、550±2nm 3个吸收峰，其E1%361nm， 1cm=207。实际工作中，1mol/L的浓度太高，可 以配成1mmol/L或1μmol/L的浓度，相应地写成
普通的日光、白炽灯光称为发射光，将这种 日光或白炽光通过棱镜可以分解为红、橙、黄、
绿、蓝、青、紫等组成的光谱，称为发射光谱。 如果在白炽灯光与棱镜之间放一个有色溶液的 玻璃皿，则通过棱镜后的光谱上会出现一处或 几处暗带，这种带有暗带的光谱称为该有色溶 液的吸收光谱，吸收光谱显示该溶液对光的选 择性吸收的特性。溶液所呈现的颜色是它的吸 收光谱中透过最多、吸收最少的那部分波长光 线的颜色，而暗带部分则是它透过最少、吸收 最多的那部分波长光线的颜色。
比色分析中有时也用透光度做单位，根据透 光度的负对数－IogT=吸光度，透光率为100% 时，吸光度=－Iog1=0，而透光率为1%时，吸 光度=－Iog0.01=2，二者间呈对数指数关系。
当然，只有溶液的浓度和吸光度之间成直线
正比关系时才能进行比色分析，如果溶液的吸 光度与浓度不成正比（不符合郎伯-比尔定律）， 则不能使用比色分析。有时，溶液的浓度只在 一定范围内和显色成直线正比关系，而浓度超 过一定限度时，失去正比关系，则不能一概地 用比色结果换算，通常都要研究测定方法中什 么浓度范围内二者成直线正比关系；或者绘制 一系列浓度和吸光度之间的标准曲线，发现浓 度增加到一定限度，标准曲线发生弯曲、变折， 说明超过该浓度时，要对溶液进行稀释才能用 来比色分析。
样条件下测定，用百分吸光系数同样可以换算。 5. 紫外吸收光谱在某种程度上反映了化合物的 性质和结构，所以可以用于有机化合物的定性 和结构分析。利用标准样品或标准图谱可以对 未知化合物进行鉴定，即控制相同的测量条件， 将未知化合物的吸收光谱与标准品或标准图谱 进行对照，如果两者吸收光谱的形状、吸收峰 的数目、位置、最大吸收波长及吸光强度完全 一致，则可说明它们分子结构中存在相同的生 色基团，初步确定它们是同一种物质，如咖啡 因的定性。
一些苯衍生物的紫外光谱特征如下
：
化合物 溶剂 吸收峰 吸收峰 吸收峰 Emolmax，1cm 苯 碳氢化合物254nm 250 204 8800
甲苯 碳氢化合物262 260 208 7900
六甲基苯
碳氢化合物 271 230 221 10000
氯苯 碳氢化合物 267 200 210 7400
苯酚 碳氢化合物 271 1260 213 6200 .
不同分子的原子团和原子，它的发射光谱和 吸收光谱不同。因此可以根据其光谱的特征和
强度研究化合物的结构和测定其含量，称为光 谱分析法，这也是比色分析的原理。根据发射 光谱分析的如火焰发射光谱法（又称火焰光度 法，分析钠、钾、钙），荧光光度和荧光分光 光度法（根据荧光的发射强度进行分析）。
根据吸收光谱分析的方法又称吸光光度法， 如应用可见光的吸收光谱进行分析的普通的分 光光度计和分光光度法；用紫外光的吸收光谱 进行分析的叫紫外分光光度计和紫外分光光度 法；用原子的吸收光谱进行分析的方法叫原子 吸收分光光度计和原子吸收分光光度法。
硒-邻苯二胺络合物的吸收光谱特征吸收峰332.5nm
氧化钬的吸收光谱
二. 郎伯-比尔定律：当一束单色入射光[ I0]通过 厚度为L、浓度为C的有色溶液后，所透过光的
强度[ I1 ]与溶液厚度L及浓度C成负指数乘积的
关系：I1=I0·10－K·L·C 如果物质在溶液中的浓度
和显色强度成正比，则可以应用郎伯-比尔定律
可见光、紫外、荧光分析都要求溶液必须透 明，否则引起对光的吸收，影响分析的准确度。 对特殊的均匀的浑浊液也可以进行比色分析,称 为比浊法，比如应用于红细胞计数、细菌计数 的比浊测定。
光线通过透明的溶液时，还有少量的光线在 玻璃、溶液的表面被反射或散射，影响到吸光 度，所以要用一个空白管进行校正，除去反射、 光、散射光、试剂中杂质、非反应物的影响， 即用空白试剂溶液进行调零的原因。普通玻璃 对紫外线也有吸收，所以在普通分光光度计上
，测定其吸收光谱，乙醇在210 ~600nm之间无 吸收峰，而苯在250、254 nm有吸收峰，以纯无 水乙醇为参比，对样品进行光谱分析，如果在 250、254nm处出现吸收峰，则说明有苯残留。
3.检查含量（纯度）:如药典规定VB12的E1%max， 361nm，1cm=207，上述VB12注射液原标示浓度为 0.05%，求实际浓度，方法：药液用重蒸水精确 稀释20倍，水做参比，用361nm测定的吸光度 为0.512，其含量为：1%∶207=x%∶0.512 ， x%=0.00247%，浓度= 0.00247%×20=0.049%
比如血红蛋白是4个亚基组成的蛋白质，单个 亚基的平均分子量是16114.5。每个亚基都在高 铁氰化钾[K3Fe(CN)6]和氰化钾[KCN]溶液中形 成单体氰化高铁血红蛋白（HiCN），它的特征
（最大）吸收峰在540nm处，摩尔吸光系数是 11000，表示为Emolmax,540nm,HiCN=11000。 测定样品在同样条件下的吸光度，就可以计算
咖啡因样品用紫外光谱定性和定量，上：标准 品；下：样品
（二）吸光系数：郎伯-比尔定律中的K称为吸 光系数。因比色杯的直径用cm为单位，因此K 的单位决定于浓度c用什么单位，如c以mol/L为 单位时K称为摩尔吸光系数，用Emol或εmol表示； 如果物质的分子量未知，浓度可用%为单位，K 称为百分吸光系数，用E%表示。
由于大多数有机化合物的紫外光谱比较简单， 缺乏精细的结构特征，而且很多生色团的吸收 峰几乎不受分子中其它非吸收基团的影响，因 此，仅根据紫外光谱鉴定有机化合物有很大局 限，一般必须与红外光谱、质谱、核磁共振波 谱等相配合，才能进行精确的鉴定。
6. 溶剂对紫外光谱的影响：在测定有机物的 紫外可见吸收光谱时，在溶解度容许范围内， 应尽量选择非极性溶剂或极性较小的溶剂（烷、 烯烃，如正己烷、正庚烷），以获得吸收光谱 的精细结构。与标准样品或标准图谱进行对比
Emmol（μmol）~nm，max，1cm。根据吸光系数的特性 ，它有3项用途：
1.可作为物质定性的参考：被测物质的光谱
特性和标准物如果一致，可粗略定性。如检查
VB12注射液是否变质，测定其光谱，结果为279
±0、361.5±0、550.7±0.3nm3个吸收峰，完全
一致，可以判定该物质为VB12（未变质）。
1.单一物质测定：先测定溶质的吸收光谱，一 般用最大吸收波长进行比色。常用方法有2种。 （1）标准曲线法：用标准液制作一系列标Βιβλιοθήκη Baidu管 的标准曲线，样品测定结果查标准曲线求知。
（2）对照管法：制作标准测定管和样品测定管， 在特征吸收峰（或最大吸收峰）处测定吸
吸光度进行比较，可直接求出样品含量。如VB12 含量测定：精确吸VB12注射液Vml，加重蒸水稀 释n倍，使每含的标示量为30μg/ml，另外配
氯仿
>245 .
水
>210
乙酸乙酯 >260 .
96%硫酸 >210
苯
>280 .
乙醚 >215
甲苯
>285 .
（三）作为光度计使用：有色的反应液可以用 普通的分光光度计（721、722、浓度计），也 可以用紫外分光光度计比色。某些溶液、反应 液无色，在200～400nm之间有特征性光吸收,就 只能用紫外分光光度计。
出含量。如：将血液0.02ml加入到5.0ml氰化高 铁试剂中，用540nm测定的吸光度为0.35，求血 液中Hb的含量(g/L)。第一步，计算血液稀释倍 数：5.02÷0.02=251（倍）；第二步，计算： 1mol∶11000=x mol∶0.35，x=0.35÷11000 mol/L，乘以分子量和稀释倍数变为g， x=0.35÷11000×16114.5× 251=128.7（g/L）。 如果有些物质不知分子量，用它的1%溶液在同
通过比色方法从显色强度求浓度，这是比色分
析的原理。
入射光强度I0
透过光强度I1 溶液厚度L（比色杯直径）
I1=I0·10－K·L·C移项成：I1/I0=10－K·L·C 式中K为常 数，可因物质的吸光特性和采用单色光的波长
不同而有所不同，与溶液的厚度和浓度无关。
上式写成以10为底的对数，Iog(I1/I0)=－K·L·C， 再 以 透 光 度 T=I1/I0 时 ， 则 上 式 成 为 IogT= － K·L·C或者－IogT=K·L·C。I1/I0称为透光度或透 光率，表示透过光强度是入射光强度的百分之
2.检查纯度：紫外光谱法检查纯度是一种简 便有效的方法，用于许多化合物检测。如阿司 匹林在空气中容易吸收水分产生水杨酸，阿司 匹林在280nm处有强吸收峰，而水杨酸的吸收 峰迁移到312nm，只要检测在312nm处是否有吸 收峰，即可判断有无水杨酸。再如无水乙醇精 制过程中要用苯，测定无水乙醇中是否残留苯
使用普通玻璃比色杯，而在紫外分光光度计上 必须用对紫外线无吸收的石英玻璃比色杯。
三. 可见—紫外分光光度计的应用 （一）光谱分析：有时候需要研究某物质在某 溶剂中的光谱特性，如Vc的乙酸溶液在252.0 nm和237.5nm处有吸收波峰。
大多数情况下，比色分析都提供了使用光的 波长（一般是最大吸收峰波长）。如果没有提 供使用波长的话，可以用紫外分光光度计从 200～1000nm范围内扫描吸收光谱，搜索到吸 收峰，再用吸收峰波长来比色分析。
时，必须用相同的溶剂。所选择的溶剂在所研 究的光谱区域内应该没有明显的吸收；并且不 含有其它干扰物质；与溶质没有相互作用。否 则会使光谱线产生移动，低于此波长时，溶剂 的吸收不可忽略。
常用溶剂的波长范围如下：
.
溶剂 使用波长范围 溶剂 使用波长范围
甲醇 >210
二氯甲烷 >235 .
乙醇 >215