紫外分光光度法和荧光分析法

仪器主要部件
光源 单色器 吸收池 检测器ຫໍສະໝຸດ Baidu
信号显 示系统
光
源: 常采用氘灯和钨卤灯 钨灯最适宜的使用波长范围为320～1000nm。 氘灯能发出光的波长范围一般为190～400nm 单色器：棱镜或光栅 吸收池：玻璃或石英吸收池 检测器：光电池、光电管、光电倍增管及二极管阵列检测器
仪器分类
单光束紫外可见分光光度计 准双光束紫外可见分光光度计 双光束紫外可见分光光度计
构件
光源 ： 为高压汞蒸气灯或氙弧灯，后者能发射出强度较大的连续
光谱，且在300nm～400nm 范围内强度几乎相等，故较常用 。
激发单色器 ： 置于光源和样品室之间的为激发单色器或第一单
色器，筛选出特定的激发光谱。
发射单色器：置于样品室和检测器之间的为发射单色器或第二
单色器，常采用光栅为单色器。筛选出特定的发射光谱
其他
卡尔曼滤波法
偏最小二乘法 小波变换
三波长分光光度法
系数倍率法
……
原理 与紫外-可见法异同点
应用
原理
荧光 — 分子吸收电磁波后，从其最低激发 态重新发射紫外线或可见光的现象 利用某些物质被一定波长的光照射后所产 生的，能够反映该物质特性的荧光来进行 定性定量的分析方法——荧光分析法。
①杂质的无关吸收再310~340nm的波长范围内几乎呈一条直线， 且随波长的增大吸光度下降。
②物质对光吸收呈加和性的原理，即在某一样品的吸收曲线上， 各波长的吸光度是维生素A与杂质吸光度的代数和，因而吸收曲线 也是二者吸收的叠加。
3、药物的鉴别
对比吸收光谱特征数据 对比吸收度（或吸收系数）的比值 对比吸收光谱的一致性
4.结构分析
1.判别物质的异构体，如互变异构体，
顺反异构体，开链和成环异构体，旋 光异构体，空间异构体等。反式异构 体空间位阻小，共轭程度较完全。最 大吸收峰波长，最大摩尔吸收系数， 大于顺式。 2.推测物质的共轭体系和部分骨架 一般需与色谱，红外，质谱，波谱等 多种仪器联合作物质的结构分析。
在溶液中，当荧光物质 的浓度较低时,其荧光强 度与该物质的浓度通常 有良好的正比关系,即
IF=KC
光照 分子基态 辐射跃迁 荧光 激发态
若光源是：
由荧光波长可确定物质分子 可见-紫外光源 分子荧光分析法 具有结构 由荧光强度可测物质的含量 原子特征光谱作光源 原子荧光分析 X射线作光源 X射线荧光分析
双波长紫外可见分光光度计
主要应用
1、药物的杂质检查
利用药物与杂质对光的选择性吸收性质的差异，若药物在杂质的 最大吸收波长处没有吸收，则可在此波长处测样品溶液的吸收度，通 过控制样品溶液吸收度来控制杂质的量。 例：地蒽酚中二羟基蒽醌的检查 二羟基蒽醌的三氯甲烷溶液 在432nm处有最大吸收，而 地蒽酚在该处几乎无吸收。
样品室： 通常由石英池(液体样品用)或固体样品架(粉末或片状样
品)组成。
检测器： 一般用光电管或光电倍增管作检测器。可将光信号放大
并转为电信号。
荧光分析法与紫外-可见分析法异同点
荧光分析法与紫外-可见比较： 均属于分子光谱 仪器构造 基本相似 荧光 可见-紫外
本质
灵敏度
发射光谱
10-10-10-12 g/ml
吸收光谱
10-4-10-7g/ml
选择性
高
一般
应用
硫色素荧光法测定维生素B1
维生素B1 在碱性溶液中被铁氰化钾氧化成硫色素，在紫（365nm）
照射下呈蓝色荧光（435nm）通过与对照品荧光强度比较。即可测得供试 品含量（课本260页）
荧光分光光度法测定维生素E
采用同步荧光扫描法测定血清中维生素E，有效的消除溶剂拉曼 光谱的干扰，提高灵敏度和准确性。（课本277页）
光谱分析法
一、紫外—可见光分光光度法 二、荧光分析法
基本原理
仪器主要部件
主要应用
基本原理
概述：紫外-可见分光光度法是通过被测物
质在紫外-可见光区的特定波长或一定波长 范围内光的吸收度，对该物质进行定性和 定量分析的方法。主要用于药品的鉴别、 检查和含量测定。 范围： 紫外光区（200~400nm）
例 苯磺舒：用含盐酸的乙醇[取盐酸溶液（9-1000）2ml，加乙醇制成 100ml]制成没1ml中含20ug的溶液，在225nm与249nm的波长处有 最大吸收，在249nm波长处的吸收度为0.67 。
甾体激素类药物：丙酸倍氯米松的乙醇溶液（20ug/ml），在 239nm的波长处应有最大吸收，吸光度为0.57~0.60;在239nm与 263nm波长处的吸光度比值应为2.25~2.45
差示分光光度法
普通分光光度法一般只适于测定微量组分，



当待测组分含量较高时，将产生较大的误差。 需采用示差法。 即提高入射光强度，并采用浓度稍低于待 测溶液浓度的标准溶液作参比溶液。 设：待测溶液浓度为cx，标准溶液浓度为 cs(cs < cx)。则： Ax= εb cx As = εb cs ΔＡ＝Ａx －Ａs =εb(cx － cs ）=εbΔc 测得的吸光度相当于普通法中待测溶液与 标准溶液的吸光度之差ΔＡ。示差法测得的 吸光度与Δc呈直线关系。由标准曲线上查得 相应的Δc值，则待测溶液浓度cx ： cx = cs + Δc
参考文献
刘文英，药物分析. 袁观宇，生物物理学. 李昌厚，紫外分光光度计. 陈 伟,林新华.紫外-可见分光光度法新技术在药物分析中应用的进 展.Journal of Fujian Medical University .2001;35:300-303. 王 雷, 杨新建, 寇 欣. 紫外分光光度法在中药分析中的应用进展. 天 津药学.2003;第15卷第5期
双波长分光光度法
不需空白溶液作参比；但需要两个单色器获得两
束单色光(λ1和λ2)；以参比波长λ1处的吸光度Aλ1 作为参比，来消除干扰。在分析浑浊或背景吸收 较大的复杂试样时显示出很大的优越性。灵敏度、 选择性、测量精密度等方面都比单波长法有所提 高。 ΔＡ＝A λ2 －A λ1 ＝（ελ2 －ελ1 ) b c 两波长处测得的吸光度差值ΔＡ与待测组分浓度 成正比 （例子：课本366页）
时间分辨荧光光谱
• 基于不同发光体发光衰减速度不同.寿命不同. 在进行这种测量时要求带有时间延迟设备的脉 冲光源和带有门控时间电路的检测器件 ,从而 可在固定延迟时间 td 和门控时间 tg, 用发射单 色器进行扫描.可得到时间分辨发射光谱。
同步扫描
• 根据激发光和发射单色器在扫描过程中彼此间 所保持的关系
导数分光光度法
导数分光光度法在多组分同时测定、浑浊样品分析、

消除背景干扰、加强光谱的精细结构以及复杂光谱 的辨析等方面，显示了很大的优越性。 利用吸光度(或透光度)对波长的导数曲线来进行分 析： Ｉ＝Ｉ0 e-εbc 假定入射光强度Ｉ0 在整个波长范围内保持恒定： dI 0 /dλ＝0 则：dI/dλ＝－Ｉ0 bc e -εbc dε/dλ ＝－Ｉ0 bc dε/dλ （例子：课本233页）
可见光区（400~760nm）
1 Beer-Lambort 定律A=log T =Ecl *A为吸收度；
*T为透光率； *E为吸收系数（以 E *c为溶液浓度； *l为样品总厚度。
1% 1cm
表示，溶液浓度为1%（g/ml），厚度为1cm时的吸光度值）
适用条件：入射光为单色光 溶液是稀溶液 固体、 液体和气体样品在同一波长 下，各组分吸光度具有加和性
紫外分光光度测定方法
普通测定分光光度法 1.单组分的测定 通常采用 A-C 标准曲线法定量测定。 2.多组分的同时测定 ⑴若各组分的吸收曲线互不重叠，则可在各自 最大吸收波长处分别进行测定。这本质上与单组 分测定没有区别。 ⑵若各组分的吸收曲线互有重叠，则可根据吸 光度的加合性求解联立方程组得出各组分的含量。 Aλ1= εaλ1bca ＋ εbλ1bcb Aλ2= εaλ2bca ＋ εbλ2bcb
2、药物的含量测定
如巴比妥类药物的含量测定（巴比妥类药物 在碱性介质中电离为具有紫外吸收特征的结构）、 芳酸及其脂类药物含量测定、维生素A含量测定 （在325~328nm的波长范围内有最大吸收）等。
三点校正法
本方法是在三个波长处测得吸光度，根据校正公式计算吸光度 校正值后，再计算含量。其原理主要基于以下两点：