第七章生物药物的提取纯化技术(1)

•
第一节 概 述
• 一、生物药物的特点
• 许多生物药物具有生物活性，其稳定性受pH、 温度、离子强度、提取过程所使用的溶剂和表面
活性剂、金属离子等方面的影响。生物药物对剪
切力很敏感，分子量越大，其稳定性就越差，在
分离纯化过程中，条件就应当越温和。一些组分
的浓度非常低。但是生物药物产品的纯度却要求 很高，含量要达到95％甚至98％以上。结晶态产 品最好，药物还应具有正常的颜色、稳定性和溶 解速率。
• 层析(色谱)技术是最近几十年来发展最快的纯化 技术。层析装置的种类很多，且分离纯化机理也 各不相同，适应于许多药物产品的分离纯化。离 子交换色谱是应用最广，且易于实现大规模生产 的方法。应用于抗生素、氨基酸、核苷酸、蛋白 质的提取和纯化。分子筛层析根据分子量大小不 同的原理，适应于蛋白质类药物的纯化。层析分 离技术的最高层次当局基于分子识别的技术，如 亲和层析。高效液相色谱法本来是分析化学的常 用手段，现已将其扩展到生物药物的分离纯化的 应用中。有些设备不仅可进行分析，也可进行分 离纯化，在新药开发的过程中，缩短了分离纯化 所需时间。
• 四、离心(Centrifugation)
• (一)离心技术分类
• 离心分离过程可分为离心过滤、离心 沉降、离心分离3种类型，所使用的设 备有过滤式离心机、沉降式离心机和 离心机 离心技术在生物制药研究及生
产中应用极广，如从培养液中分离收 集细胞，去除细胞碎片，收集沉淀物， 从含蛋白质的液体中除去蛋白质吸附 刘，也包话用超速离心法分离溶解的 大分子
• 生物药物提取纯化技术的另一特点 是注重新材料的研制开发，如膜分 离介质，层析介质，亲和配基，新 型萃取剂等在最近几十年来发展非 常快。提取纯化设备方面推陈出新， 在设备的计算机控制及生产自动化、 连续化及GMP规范化等方面取得了 很大的成就。
• 膜过滤技术发展很快，分为微滤、超滤和纳滤， 不仅用于细胞的分离，还用于蛋白质的浓缩。超 滤技术的主要特点是节能，对生物大分子类药物 无破坏作用。液—液萃取广泛应用于抗生素及小 分子量药物的提取。溶剂选择的余地大，且易实 现大规模生产。高速离心式液体萃取机是目前效 率最高，使用最广的装置。液—液萃取技术还衍 生出许多新的萃取技术，如双水相萃取，亲和萃 取，超临界萃取等。双水相苯取蛋白质类药物是 大规模提取高纯度蛋白质类药物的有效技术。面 超临界萃取利用超临界流体的物理特件，即通过 压力和温度的改变控制溶质在溶剂中的分子扩散 能力．控制溶质的溶解度，从而实现分离。
• 与层析技术同步发展的各种分离介质是层 析分离的技术保障，商品化的预装柱、缓 冲剂、计算机程序控制还使操作变得简单 易学。置换层析与洗脱层析不同，是指吸 附在层析柱上的一种组分被另一种置换剂 (与层析上的介质的亲和力大于原被吸附的 组分)置换出层析柱的层析技术。该技术有 上样量高，分辨率高的特点。被分离的样 品在分离过程中还有浓缩作用。总之，随 着科技的发展，新的分离、提取、纯化技 术还将不断得到改进。
• 对环境的污染。该离心机又如一个密闭的压力容器，可 在121℃温度下进行蒸汽灭菌，该离心设备没有环绕离 心机转简的冷却夹套，对悬浮液和浓缩的固体都能进行 充分的冷却，并能有效地控制温度，这对于生物药品是 非常重要的。
• 有人研制了一套直接提取抗生素的中 试装置，该装置的主要特点是在一根 专门设计的柱子中自上而下分为10个 等距的区间，每一层都装有导流板， 相邻两层的导向相反，这便于产生祸 流，柱外由压缩空气驱动的脉冲式发 生器提供搅拌动力。这样，就可得到 高效传质，低压降的流化床条件。装 置如图7—2所示。
• 图7—2 直接提取抗生素装置
图7—2 直接提取抗生素装置
• 用上述方法，对庆大霉素而言，可 不必再对产品脱色，也无需去除无 机盐。目的产物的洗脱和吸附剂的 再生方法与常规方法相同，而且提 取的放大也不成问题。
三细胞破碎(Cell disruption)
(一)细胞破碎方法分类
细胞破碎可分为两大类：机械破碎和非机械方法破 碎。对液相物料，机械破碎法有：超声波、机械 搅拌、压力法。对固相物料，机械破碎法有：研 磨和压力法。非机械破砰法分为脱水(空气干燥、 真空干燥、冷冻干燥和有机溶剂干燥)和裂解(物 理法、化学法和酶法)两类。裂解物理法又分为 渗透压突变法、冷冻和解冻法等。化学法有阴阳 离子洗涤剂处理法、抗生素处理法和甘氨酸处理 法。酶法可用溶菌酶等有关的酶制剂处理，或用 噬菌体裂解、抗生素处理等。
• 包涵体大小一般为0.5－1um，比较坚 硬，在水溶液中很难溶解，只有在变 性剂溶液中(如盐酸和尿素等)才能溶解。 在变性剂中，重组蛋白质呈变性状态， 但其一级结构不被破坏，除去变性剂 后，重组蛋白质H可自动折叠成具有活 性的天然构型，这称为蛋白质的复件。 包涵体中除了含有重组蛋白外，还含 有宿主细胞蛋白以及膜蛋白片断，也 还贪有DNA、RNA和质粒编码蛋白以 及脂多糖。
• 六、纯化工艺过程的质量控制
• 生物药物纯化工艺要求高，应尽可能选用高质量 的设备，并要求有清洁的各级GMP厂房。纯化方 法的设计应考虑到尽可能去除污染病毒、核酸、 宿主细胞杂蛋白、糖及其他杂质，要防止纯化过 程中带入有害物质。如采用柱层析技术纯化应提 供填料的质量认证证明(1S09001证书)，并证实 从柱上不会掉下有害物质。样品上样前应除热原 质等。若用亲和层析技术(以单克隆抗体品作为 配基)，应有检测可能污染此类外源性物质的方 法，不应含有可测出的异种免疫球蛋白，柱层析 配制溶液用水一律用超纯水(Milli Q水)。
• （二）新型离心装置
• 在生物制药领域采用的离心机系统，除了应具备离心机 的一般要求外，还应满足药品生产的技术要求，这包括 灭菌、冷却、密封，以保证产品不受污染并不污染环境。 现代离心机装置包括以下3个步骤，并进行程序控制： 离心、离心系统的灭菌及就地清洗。如阿法拉伐公司离 心机产品的装置，具有双重轴向密封，密封由装在转筒 主轴上下的碳化硅动环和固定环组成，密封由水连续冷 却和润滑，可防止产品被污染，也可防止生产过程中排 人的废物
• 二.提取纯化的单元操作和基本工艺流 程
• 生物药物的提取和纯化可分为5个主要 步骤：预处理、固液分离、浓缩、纯 化和产品定型(干燥，制丸，挤压，造 粒，制片)。
• 每一步骤都可采用各种单元操作。在 提取纯化过程中，要尽可能减少操作 步骤，因为每一操作步骤都不可避免 带来损失。操作步骤多，总收率就会 下降。
• 关于纯度的要求，可视产品的来源、 用途和用法而制定，例如经反复多次 使用的真核细胞表达的制品，要求纯 度达到98％以上；多次使用的原核细 胞表达的制品要达95％以上；外用制 品的纯度可降低要求。用于健康人群 或用于重症患者，对纯度要求各不相 同。
• 纯化工艺的每一步均应测定纯度， 计算提纯倍数收率等。纯化工艺过 程中应尽量避免加人对人体有害的 物质，若不得不加入，应设法除尽； 并在最终产品中检测残留量，残留 星应远远低于危害剂量，还要考虑 到多次使用的积蓄作用。
• 三.提取纯化单元操作技术的特点
分离纯化技术的特点之一是各种技术 相互交叉，新型的分离纯化方法不 断涌现。如沉淀技术和亲和技术相 结合，形成了亲和沉淀技术；超滤 和亲和技术相结合．形成了亲和超 滤技术；萃取与载体膜相结合，形 成了液膜载体萃取法。这些新方法 取长补短，使分离纯化过程更加科 学合理、快速有效、经济实用。
• 许多重组蛋白产物(如干扰素r白细胞介 素、人生长激素等)在原核细胞内凝集 成没有活性的不溶性固体颗粒，这称 为包涵体。包涵体基本上出蛋白质构 成，其中大部分(占50％以上)是克隆基 因的表达产物。这些产物的一级结构 是正确的，但由于种种原因，其立体 结构却与大然产物有很大的差别，因 而没有生物活性。
• (二)破碎技术(微生物细胞破碎)
• 高压均质器法：将细胞悬浮液在高压下通入一个 孔径可调的排放孔中，菌体从高压环境转到低压 环境，细胞就容易破碎。高压均质器的操作参数 较为简单，主要是操作体力、温度以及通过高压 均质器的次数。
(三)重组蛋白质的包涵体处理技术
• (三)重组蛋白质的包涵体处理技术
四、提取纯化的工艺论证
• 我国1992年修订了GMP，要求从1993年3 月1日以后新建或改建的药厂，均要符合 GMP的要求。1994年开始了各项验证， 其中工艺论证是关键的一个不可缺少的 组成部分。产品的纯化是生产过程中关 键的一步。
• 这涉及到药物的质量。所谓工艺验证，就 是通过系统的方法得到关于生产工艺的书 面材料，证明并保证生产过程能始终如一 地生产出特定的高质量的产品。提取纯化 处理工艺验证的范围包括：厂房设施、工 程仪表、机械设备、生产环境、工艺条件、 计算机软件、介质、原材料、半成品、成 品、操作人员素质和测试方法等。以上各 个部分都要有验证材料或试验数据，根据 这些材料和数据写出验证报告。
•
•
• 10－4 10－3 10－2 10－1 1
10
102
•
病毒
酵母菌
•
细菌 血红球细胞
•
血红蛋白
•
蔗糖
真菌
•水
植物细胞
•
氨基酸
•
溶菌体
动物细胞
•
血清
103um 絮凝物
•
• 二直接从发酵液中提取产品(以抗生素 为例)
• 直接从发酵被中提取产品，意指发酵 液不经预处理，或仅通过简单的预处 理。早在50年代，就开展过直接从发 酵液中提取抗生素的工作。如树脂吸 附法，直接从发酵液中提取链霉素、 庆大霉素等。也有采用柱式硫化床吸 附链霉素的报道。由于可不必预先分 离菌丝体和固形物，因而可简化分离 过程，提高产品收率，减少吸附剂的 损耗，缩短操作时间。
第二节 预处理及固液分离技术
• 一、概 述 • 生物制药工业的下游技术中涉及大量
的组分分离操作，这些 • 组分从最小的离子状态到租粒子状态，
大致可分为5个区域，如表 • 7—2所示。
• 表7—2 生物药物组分的存在状态
ห้องสมุดไป่ตู้
•
• 电子显微镜
• 离子范围 粗离子范围
光学显微镜
肉眼可见
大分子范围
微离子范围 细离子范围
五、生物药物生产的屏蔽防护 技术(Containment technology)
• 一些药物，如抗癌药，往往对生物活细 胞具有毒性，因此必须对中试或大生产 的全过程设置屏蔽防护装置。
• 1984年，F1ickinger等就提出了中试和 生产规模细胞毒素剂的安全生产装置 的设计概念，其基本要求是：人员进 出口要加以控制；在工作场所保持负 压（一级、二级或三级生物密封室）； 空气的排放必须通过HEPA过滤器；对 有烟雾产生的设备要有附加的屏蔽防 护装置；有适当的个人防护措施；生 产过程中所排放的废物要有生物学或 化学的除污方法；对工作人员进行医 疗监测环境监测。
• 当工艺的某一部分有较大变动时(如大 修、工艺条件变化)，要进行重新验证， 即再验证。再验证是针对某一部分的 行动，而不是整个工艺过程的验证， 因此比较简单、快速、易行。验证的 实施过程包括以下步骤：提出验证要 求，组织验证小组，制定验证方案， 实施验证试验，写出验证报告，再验 证等。
• 高科技生物药物的生产工厂，已有“交钥 匙工程“。所谓交钥匙工程，就是将整个 工厂组装在高强度的，便于运输的钢制建 筑结构内，整个建筑要达到洁净标准，所 有的生产设备和公用设施都已安装到位。 在用户在场的情况下，要对整个工厂进行 发货前的试运转及鉴定。然后，整个工厂 的生产设备和公用设施直接运输到用户的 厂址，在各车间组装后，与当地酌水、电、 下水道等系统及仓库对接，立即就可以投 入生产。