质谱分析方法开发及优化版

液质联用分析方法开发及条件

优化

一、概述

• LC-MS 的实验目的 •电离方式的选择 ESI 或APCI 正离子或负离子 •色谱柱因素

直径和流速

管路连接（Plumbing ） •流动相因素 pH 溶剂 其他

•液质联用应用实例

二、样品的预处理

•认为LC/MS/MS 不需要样品预处理的理解是片面的 •LC/MS/MS 分析方法的现实情况

•由于MS/MS 有很好的选择性, 用户很少能够“看到”基质 MS/MS 模式下，成百上千的基质谱峰是“看不见”的 •

MS/MS 用户希望有最低的检测限, 因此他们可能会进更多的样品到LC/MS/MS 系统当中

“看不见” 的基质谱峰会变得更加严重

•许多后流出化合物并不是完全适合色谱分析，因此色谱柱当中会有残留物产生

– 这些残留物会随着不断的进样而渐渐增多

– 样品分析的越多，基质之间的互相干扰也越严重 •大量的基质会使离子源污染得更快并且损失灵敏度

(一)、样品的预处理目的

为什么需要液相分离

串联质谱具有高选择性，为什么需要液相分离 –离子化过程中的基质效应

基质物质与分析物共同流出喷雾针时，可影响待分析物的雾化、挥发、裂分、化学反应及带电过程，导致进入质谱的离子减少（离子抑制）或增多（离子增强），从而影响定量结果的可靠性和准确性，以及方法的重现性及线性

–改善线性和准确性–提高灵敏度 –更好的专属性

基质干扰：Loop 进样

基质干扰 : 用色谱柱将基质和分析物分离

二、样品的预处理

•从保护仪器角度出发，防止固体小颗粒堵塞进样管道和喷嘴，防止污染仪器，降低分析背景，排除对分析结果的干扰 •从ESI 电离的过程分析

ESI 电荷是在液滴的表面，样品与杂质在液滴表面存在竞争，不挥发物（如磷酸盐等）防碍带电液滴表面挥发，大量杂质防碍带电样品离子进入气相状态，增加电荷中和的可能

(一)样品的预处理目的

（二）样品基质影响

质谱检测器可耐受挥发性缓冲盐的使用

然而…

缓冲盐的类型和浓度干扰离子化过程

（二）样品基质影响

（三）样品的预处理常用方法

•超滤

•溶剂萃取／去盐 •固相萃取

•灌注（Perfusion ）净化／去盐 •色谱分离

反相色谱分离 亲和技术分离 •甲醇或乙腈沉淀蛋白 •酸水解，酶解 •衍生化

三、LC-MS 分析条件的选择

（一）、接口的选择

•ESI 和APCI 在实际应用中表现出它们各自的优势和弱点

•这使得ESI 和APCI 成为了两个相互补充的分析手段

•概括地说，ESI 适合于中等极性到强极性的化合物分子，特别是那些在溶液中能预先形成离子的化合物和可以获得多个质子的大分子（蛋白质）

•只要有相对强的极性，ESI 对小分子的分析常常可以得到满意的结果

1、液质联用技术的相对适用范围

2、接口的选择

•APCI 不适合可带有多个电荷的大分子，它的优势在于非极性或中等极性的小分子的分析

•ESI 对高分子量生物大分子和聚合物电离会生成多电荷离子，而APCI 在任何化合物电离中不能产生多电荷离子，并以（准）分子离子为主 •ESI 多适合反相液相色谱

•APCI 要比ESI 更适合正相液相色谱

（1）ESI 和APCI 的比较

比较项目 ESI

APCI

可分析样品 蛋白质、肽类、低聚核苷酸；儿茶酚胺、季铵盐等；含杂原子化合物如氨基甲酸酯等，可用热喷雾分析的化合物 非极性／中等极性的小分子，如脂肪酸，邻苯二甲酸等；含杂原子化

合物如氨基甲酸酯、脲等，可用热喷雾、粒子束技术分析的化合物 不能分析

样品 极端非极性样品

非挥发性样品，热稳定性差的样品

基质和流动相的影响

对样品的基质和流动相组成比APCI 更敏感；对挥发性很强的缓冲液也要求使用较低的浓度；出现Na +，K +．Cl -，CF 3COO -等离子的加成 对样品的基质和流动相组成的敏感程度比ESl 小；可以使用稍高浓度的挥发性强的缓冲液；有机溶剂的种类和溶剂分子的加成影响离子化效率和产物

2、接口的选择

（1） ESI 和APCI 的比较

比较项目 ESI

APCI

溶剂

溶剂pH 对在溶剂中形成离

子的分析物有重大的影响，溶剂pH 的调整会加强在溶液中非离于化分析物的离子化效率

溶剂选择非常重要并影响离子化过程；溶剂pH 对离子化效率有一定的影响

流动相流速 在低流速(<100µL)下工作良好；高流速下(>750µl)比APCI 差 在低流速（<100µl)

下工作不好；在高流速下（>750µl ）好于

ESI

碎片的产生 CID 对大部分的极性和中等极性化合物可产生显著的碎片

比ESI 更为有效并常有

脱水峰出现 （2）ESI vs. APCI

电离方式 流速

(mL/mi n)

样品类型 MW 范围

ESI

0.001-1.0 多电荷离子 MW >1000 Da

<200,000 Da (M+H)+, (M-H)-及其碎片

~̴103Da APCI

0.2-2.0 (M+H)+, (M-H)-及其

碎片

<1000 Da

（3）离子化模式的选择

Yes

化合物是否是极性的?

化合物 热稳定吗?

化合物是酸性、碱性还是中性?

APCI 或 APPI

No

Yes

ESI 中性 碱性

酸性 ESI (正)

ESI (负)

APCI

No

（4）正、负离子模式的选择

•一般的商品仪器中，ESI 和APCI 接口都有正负离子测定模式可供选择。选择的一般性原则为： ●(1)正离子模式 适合于碱性样品

可用乙酸(pH=3～4),甲酸(pH=2 ～ 3)或三氟乙酸对样品加以酸化。如果样品的pK 值是已知的，则pH 要至少低于pKa 值2个单位

•适合于碱性样品，肽和蛋白、弱极性化合物、环境污染物，例如农药和污染物、毒品、违禁物及其代谢产物

有杂原子(N 2> O 2)可接受H +、Na +、NH 4+，如NH 2、N 、NH 、CO 、COOR

样品中含有仲氨或叔氨基时可优先考虑使用正离子模式