基因重组技术在工业微生物菌种选育中应用的研究进展

1998 年 STEMMER 等 提 出 了 基 因 重 组（Genome shuffling），该方法是通过传统诱变与原生质体融合技术 相结合，对微生物细胞进行基因组重排，从而大幅度提高 微生物细胞的正向突变频率及正向突变速度，使人们能 够快速选育出高效的正向突变菌株。由于 Genome shuffling 技术为一些经过多年诱变、对理化诱变因素已不太 敏感及不便于利用 DNA 重组等技术改进的工业菌株提 供了新的改良方法，因此有学者认为该技术的建立与成 熟“将引起传统工业微生物育种及发酵生产的一场革命”[1]。 实践表明，该技术能优化大多数工业微生物的代谢途径 和表型，极大地改良菌种的生产性状，并缩短了育种周期。 目前，该技术应用于工业微生物菌种的改造和改良已经 有了一些成功例子，其在菌种选育过程中呈现出良好的 应用发展前景。 1 Genome shuffling 技术的原理和方法
菌
株
（第n轮多亲
性
（第二轮多亲 本融合改组）
状
本融合改组）
或
产 （首轮多亲本
量 融合改组）
母（诱变） 本
改组进程 附图 基因重组技术示意图 Attached figure. Technical schematic diagram of genome shuffling
2 Genome shuffling 技术在工业微生物菌种选育中的特点 在工业微生物育种过程中，常用到的方法包括 传统
Genome shuffling 是一项对整个微生物全基因组进行 重排的定向育种技术，它 把 传 统 微 生 物 诱 变 育 种 技 术 与 细胞融合技术结合，通过诱变手段获得若干正性突变株， 并采用细胞融合方式使之全基因组发生重组，经过递推 式多次融合，使基因组在较大范围内发生交换和重排，将 引起正性突变的不同基因重组到同一个细胞株 中，最 终获得具有多重正向进化标记的目标菌株。
的自然选育和诱变育种，20 世纪 70 年代发展起来的原生 质体融合育种及较新也较有前途的基因工程育种和代谢 工程育种等。与这些方法相比，Genome shuffling 技术用于
收稿日期：2008-06-24 基金项目：湖北宜昌市科技局项目（A2007103-06） 作者简介：李义勇（1983-），男，硕士研究生，研究方向为微生物生物技术；张亚雄 *，副教授，通讯作者。
朱惠等[14]在 改 组 纳 他 霉 素 产 生 菌 褐 黄 孢 链 霉 菌 （Streptomyces gilvosporeus）SG-1 的过程中，对常规的改组 技术操作路线作了改进。将第 1 轮 shuffling 再生菌落（包 括融合体和亲本）不经过筛选，而直接用于制备原生质体 后进行下一轮 shuffling。最终仍筛选得到 14 株高产改组 菌株，其中 1 株 S.gilvosporeus GS-74 的纳他霉素产量为 3574mg/L，是产量最高的亲本菌株的 1.5 倍，比原始出发 菌株 SG-1 提高 1.17 倍。改进后的技术路线既高效可行， 又节省了时间和工作量，值得推广。徐波等[15]采用替考拉 宁平板培养基（含梯度剂量耐受物质丁酸钠、乙酸钠、甘氨 酸和二甲胺）筛选法，从替考拉宁产生菌 SIIA 01-11-25 的 改组菌株中筛选出 1 株对乙酸钠、甘氨酸和二甲胺 3 种底 物均有耐受性的重组子菌株 SIIA 05-03-136，其产量比原 始菌株提高 65.3%（3016μg/mL），且稳定性好，已应用在替 考拉宁的中试生产中说明结合有效的突变株筛选方法，基 因组改组技术用于菌种改造是高效可行的。HIDA H 等[16] 运 用 Genome shuffling 技 术 改 造 异 亚 硝 基 酸 产 生 菌 （Streptomyces sp.）U121，获得了 4 株异亚硝基酸高产菌 株，其 HCA 产量分别达到 145mg/L、165mg/L、186mg/L和 194 mg/L，是野生型菌株的 5~6 倍，使该菌株在短期内实 现了 HCA 产量的大幅度提高，这是Genome shuffling 技术 成功应用于放线菌改造的又一个典型。 3.3 Genome shuffling 技术改组酵母菌
实用性强等特点，近年来不断被应用于各种工业微生物菌种的改良研究中。文中介绍了Genome shuffling技术在一系列菌种改良实
例中应用现状，为该技术进一步的推广应用奠定基础。
关 键 词：基因重组；菌种选育；研究进展
中图分类号：Q784
文献标识码：A 文章编号：0254－5071（2009）01-0011-03
明其中转入了淀粉酶功能基因片段，证明基因组改组使遗 传信息发生了转移和重组。梁惠仪等[13]从豆豉里面筛选得 到 1 株具有纤溶酶活性的枯草芽孢杆菌 DC-12，进行 2 轮 基因组改组。从第 1 轮改组菌株中获得 6 株正突变株， 与原始菌株 DC-12 一起作为亲本，进行第 2 轮改组（因为 选择一些诱变次数少、甚至是野生型的菌株作为亲本有利 于消除负突变基因对重排效果的影响），筛选获得5 株 酶 活在 1600U/mL 以上（最高酶活 2600U/mL）的正突变株， 较亲本菌株提高了 4~5 倍。表明在基因组改组过程中，结 合原始菌株进行下一轮改组能获得很好的效果。 3.2 Genome shuffling 技术改组放线菌
目前，Genome shuffling 技术在细菌、放线菌、酵母菌 和霉菌等多种类的工业微生物中都有应用的实例，且呈 现出日益增加的良好发展趋势[7-9]。 3.1 Genome shuffling 技术改组细菌
在乳酸发酵生产中，乳 酸 菌 同 时 具 有 底 物 抑 制 和 产 物抑制的发酵特征，因 此 通 过 提 高 乳 酸 菌 的 耐 糖 性 和 耐 酸性，进而提高乳酸产量是乳酸生产中的一个重要研究 方向。于雷等[10]对鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus） MEE539 进行 2 轮基因组改组，获得 1 株改组菌株 F2-2， 在含 15%葡萄糖的 YE 培养基中摇瓶发酵 36h 产酸能达 到 135.6g/L，表明该改组菌在高糖条件下仍能有较高的产 酸量 ，表 现 出 很 好 的 葡 萄 糖 耐 受 性 。王玉华等[11]通过基 因组改组技术提高干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）的耐 酸性，使 改 组 菌 株 能 够 在 原 始 菌 株 无 法 生 存 的 条 件（pH 3.4）下生长，且产酸量达到野生型菌株的 2.4 倍。乳酸发 酵过程中存在的另一个问题是葡萄糖消耗量大，提高了生 产成本。JOHN R P 等[12]以德氏乳杆菌突变株 NCIM 2025 和淀粉酶产生菌（Bacillus amyloliquefaciens）ATCC23842 作为亲本出发菌株，进行 3 轮基因组改组，得到 4 株能直 接利用不同来源的淀粉生产乳酸的改组菌株，通过优化 培养基组成和发酵工艺，最终乳酸发酵产量为 40g/L，淀 粉转化率为 96%。对改组菌株作 16S rRNA PCR 分析，表
最近的研究表明，酵母菌耐高温和耐酒精的生化机理 十分复杂，涉及到大量的基因产物及其相关的代谢途径[17]， 因此用基因工程等正性育种手段，很 难 同 时 提 高 酵 母 菌 的耐高温和耐乙醇性能。王灏等[18]以 3 株酿酒酵母菌 f4、 f5、f6 作为出发菌株，分别进行原生质体紫外诱变，通过在 不同温度含不同乙醇浓度的一系列平板筛选，获得耐高温 或耐乙醇性状有较大提高的 7 株正突变菌株。以这些菌 株作为出发菌株，进一步用硫酸二乙酯诱变，获得了 2 株 乙醇耐受性能较高的菌株。以上述 9 株优势菌为出发菌 株，进行 2 轮 shuffling。筛选获得 14 株耐高温和耐乙醇浓 度都较出发菌株有了较大提高的菌株，其中 R24 株在 35℃
专论与综述
中国酿造
2009 年 第 1 期
总第 202 期 ·11·
基因重组技术在工业微生物菌种选育中应用的研究进展
Fra Baidu bibliotek
李义勇，张亚雄 *
（湖北省天然产物研究与利用重点实验室，三峡大学 化学与生命科学学院，湖北 宜昌 443002）
摘 要：全基因组改组（Genome shuffling）技术作为一种新型的菌种选育方法，与常见的育种方法相比，具有快速有效、简单易行和
2009 No．1
·12· Serial No．202
China Brewing
Forum and Summary
菌种选育起步较晚，但由于其自身具有一些明显的优点， 发展迅速且应用日益广泛。实践表明，Genome shuffling 技 术育种具有以下特点：（1）比 传 统 诱 变 选 育 更 快 速 有 效 。 传统诱变通常是将每一轮产生的突变体库中筛选出的最 优的 1 株菌作为下一轮诱变的出发菌株，而 Genome shuffling 则是将一次诱变获得的若干正性突变株共同作为出 发菌株，经过递推式的多轮融合实现较大范围内的基因 重组，效率更快更高，并可以基本避免诱变选育中因多次 诱变导致的“钝化”反应和“饱和现象”，在一定程度上克服 了诱变选育存在的缺点[3]。（2）能提高子代菌株的遗传多 样性。基因组改组技术源于原生质体融合技术，但两者最 大区别在于基因组改组技术使用多亲本，而非双亲本，并 且进行多轮递推式融合，能产生各种各样的突变组合，这 将大大增加子代筛选群体内遗传多样性，从而提高了获 得优良性状的菌株的几率[4-5]。（3）该技术简单实用，容易 推广。应用该技术对设备要求不高，费用较低（一轮基因 组改组的费用略相当于一轮理化诱变的费用），同时该技 术易于实施，不需要对工业微生物基因的结构和功能作 详细了解，也不需要以工业微生物的代谢路线图及其代 谢调控机制等理论作基础[4，6]，因此，普通的育种工作人员 在一般实验室条件下就可以运用该技术开展相关实验， 容易广泛推广。 3 Genome shuffling 技术在工业微生物菌种选育中的应用
Abstract: Genome shuffling is demonstrated as an effective new approach for microbial screeening. Compared to several common breeding methods, genome shuffling is quick, effective, simple, straightforward and practical. Hence, it is frequently used in the improvement of industrial microbial strains in recent years. The application situation of genome shuffling in the examples of strain improvement is introduced in this paper, which is helpful to promote the application and improvement of this technique. Key words: genome shuffling; strain screening; research progress
其具体操作过程是通过对原始出发菌株（母本）进行
诱变获得初始突变体库，从 中 筛 选 出 若 干 性 能 优 良 的 突 变株（正性突变株），以之作为亲本进行原生质体的制备， 并选择合适的方式和条件进行原生质体融合和再生，长 成菌落即为 F1，再从 F1 代中筛选出具有若干优良性状的 融合株，制备成为原生质体，用同样的方法进行融合再生， 依此类推，开展递推式的多轮融合（一般为 3~5 轮），最终 使引起正性突变的不同基因重组到同一个细胞株中，获 得优良菌株，从而达到改良菌种的目的，其示意图见附图[2]。
Research progress of genome shuffling applied in the screening of industrial microbial strains
LI Yiyong, ZHANG Yaxiong*
(Hubei Key Laboratory of Natural Products Research and Development, College of Chemistry and Life Science, Three Gorges University, Yichang 443002, China)