虫草头孢菌粉中16种氨基酸的含量测定_石云峰

中图分类号 R286； R927． 2
文献标识码 A
文章编号 1004－0781（ 2012） 12－1624－04
Determination of 16 Amino Acids in Cordyceps Mycelium Powder by RP-HPLC
SHI Yun-feng1 ，LIN Li-qin2 ，WANG Jin-lan1 （ 1． Zhejiang Institute for Food and Drug Control，Hangzhou
10 mL，加 0． 02 mol·L－1 盐酸溶液定容，摇匀，作为样 品溶液。取上述样品溶液 2． 0 mL，按“2． 2． 2”项下“加 入 1 mol·L－1 三乙胺乙腈溶液 1． 0 mL”起操作，即得。 2． 2． 4 空 白 溶 液 取 0． 02 mol · L－1 盐 酸 溶 液 2． 0 mL，按“2． 2． 2”项下“加入 1 mol·L－1 三乙胺 乙腈溶液 1． 0 mL”起操作，即得。 2． 2． 5 内标溶液 取内标储备液 1． 0 mL，置于 20 mL 量瓶中，加 0． 02 mol·L－1 盐酸溶液定容，摇匀，取上述 溶液 2． 0 mL，按“2． 2． 2”项下“加入 1 mol·L－1 三乙胺 乙腈溶液 1． 0 mL”起操作，即得。 2． 3 系统适用性溶液 取混合对照品溶液、供试品溶 液、空白溶液及内标溶液各 4 μL，按“2． 1”项下色谱条 件进行测定，16 种氨基酸及内标各色谱峰之间分离度 较好，空白无干扰，见图 1。16 种氨基酸及内标色谱峰 分离度及理论板数见表 2。 2． 4 线性关系和检测限 精密吸取“2． 2． 2”项下对 照品储备液 0． 5，1，2，3，4，5 mL，分别置 20 mL 量瓶 中，分别加入内标贮备液 1． 0 mL，加 0． 02 mol·L－1 盐 酸溶液定容，摇匀。取上述溶液 2． 0 mL，按“2． 2． 2”项 下“加入 1 mol·L－1 三乙胺乙腈溶液 1． 0 mL”起操作， 即得系列浓度溶液，按上述色谱条件进样测定，分别以 氨基酸对照品峰面积与内标峰面积比为纵坐标，对照 品浓度（ μg·mL－1 ） 为横坐标，绘制工作曲线，计算回 归方程。见表 3。将供试品溶液稀释 10 倍后进样测 定，峰面积最小的蛋氨酸（ Met） 的色谱峰 S / N = 10，故 认为该方法可用于氨基酸的定量测定。 2． 5 精密度实验 取 1 号样品的供试品溶液，按上述 色谱条件连续进样 6 次，计算 16 种氨基酸进样精密 度，16 种 氨 基 酸 峰 面 积 与 内 标 峰 面 积 比 的 RSD 均＜2． 0% 。 2． 6 稳定性实验 取 1 号样品的供试品溶液，按上述 色谱条件分别于 0，4，12，16，20 h 进样，16 种氨基酸峰 面积与内标峰面积比的 RSD 均＜2． 0% 。 2． 7 重复性实验 精密称取 1 号样品 6 份，每份约 20 mg。按“2． 2． 2”项下方法制备供试品溶液，依上述 条件进样测定，计算各氨基酸含量，除 His 和 Met 的 RSD 分别为 2． 6 % 和 3． 8% 外，其余 14 种氨基酸的 RSD 均＜2． 0% 。 2． 8 加样回收实验 精密称取已测知含量的 1 号样 品 6 份各 10 mg，分别置玻璃安瓿中，精密加入氨基酸 混合 对 照 品 储 备 溶 液 2． 5 mL，加 6 mol · L－1 盐 酸 6 mL，按“2． 2． 3 ”项下自“充氮熔封，于 110 ℃ 水 解 24 h”起操 作，制 备 所 需 溶 液，按 上 述 色 谱 进 样 测 定，计算回 收 率，Asp、Glu、Ser、His、Arg、Thr、Ala、P ro、
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Herald of Medicine Vol. 31 No. 12 December 2012
虫草头孢菌粉中 16 种氨基酸的含量测定
石云峰1 ，林丽琴2 ，王金兰1
（ 1． 浙江省食品药品检验研究院，杭州 310004； 2． 杭州市药品检验所，310017）
摘 要 目的 建立测定虫草头孢菌粉中 16 种氨基酸含量的反相高效液相色谱 （ RP-HPLC） 法。方法 样品 以 6 mol·L－1 盐酸于 110 ℃ 水解 24 h，内标为正亮氨酸，以异硫氰酸苯酯（ PITC） 为衍生化试剂，衍生后进行 HPLC 分析。 采用 Agela Venusil XBP C18（ 150 mm×4． 6 mm，5 μm） 色谱柱，柱温为 40 ℃ ； 流动相 A 为 0． 1 mol·L－1 醋酸-醋酸钠缓冲液 （ pH 6． 5） -乙腈（ 95∶ 5） ，流动相 B 为乙腈-水（ 4∶ 1） ，梯度洗脱，流速为 1． 0 mL·min－1 ； 检测波长为 254 nm。结果 16 种氨基酸浓度在 1． 81 ～ 7． 50 μg·mL－1 范围内呈良好的线性关系（ r = 0． 998 3 ～ 1． 000 0） ； 平均回收率除组氨酸、甲硫氨
2． 2 溶液的制备 2． 2． 1 内 标 溶 液 取 正 亮 氨 酸，精 密 称 定， 加 0． 02 mol·L－1 盐酸溶液制成每毫升含 0． 1 mg 的溶 液，即得内标贮备液。 2． 2． 2 混合对照品溶液 取 16 种氨基酸适量，精密 称定，加 0． 02 mol·L－1 盐酸溶液制成每毫升分别含 Asp 0． 12 mg、Glu 0． 14 mg、Ser 0． 06 mg、Gly 0． 06 mg、 His 0． 02 mg、 Arg 0． 07 mg、 Thr 0． 06 mg、 Ala 0． 08 mg、Pro 0． 05 mg、Tyr 0． 06 mg、Val 0． 04 mg、 Met 0． 01 mg、Ile 0． 05 mg、Leu 0． 08 mg、Phe 0． 06 mg 和 Lys 0． 05 mg 的混合溶液，即得对照品储备液。取 内标贮备液 1． 0 mL 置于 20 mL 量瓶中，加对照品储备 液 2． 0 mL，加 0． 02 mol·L－1 盐酸溶液定容，摇匀，作 为 对 照 品 溶 液。 取 上 述 对 照 品 溶 液 2． 0 mL，加 入 1 mol·L－1 三乙 胺 乙 腈 溶 液 1． 0 mL，再 加 入 0． 1 mol·L－1 异硫氰酸丙酯（ PITC） 乙腈溶液 1． 0 mL，混 匀，室温下放置 2 h，加入 4． 0 mL 正己烷，放置 20 min， 取下层溶液，滤过，即得。 2． 2． 3 供试品溶液 取样品约 20 mg，精密称定，置 玻璃安瓿中，加 6 mol ·L－1 盐酸 6 mL，充氮熔封，于 110 ℃ 水解 24 h，放冷，打开安瓿封口，将内容物移入 蒸发皿中，蒸干，残渣加 0． 02 mol·L－1 盐酸溶液溶解 并转移至 25 mL 量瓶中，定容，作为样品储备液。取内 标贮备液 1． 0 mL 置于 20 mL 量瓶中，加样品储备液
310004，China； 2． Hangzhou Institute for Drug Control，Hangzhou 310017，China）
ABSTRACT Objective To establish a quantitative method for detecting 16 amino acids in cordyceps mycelium powder． Methods The sample was hydrolyzed for 24 h at 110 ℃ ，and derived with phenyl isothiocyanate （ PITC） ，with norleucine serving as an internal standard． High performance liquid chromatography （ HPLC） was performed on a Agela Venusil XBP C18 （ 150 mm×4． 6 mm，5 μm） column with gradient elution of 0． 1 mol·L－1 acetic acid-sodium acetate buffer solution （ pH 6． 5） acetonitrile （ 95∶ 5） （ A） and acetonitrile-water （ 4∶ 1） （ B） at a flow rate of 1． 0 mL·min－1 ，detected at 254 nm． Results Sixteen amino acids had a good linearity in the range of 1． 81－7． 50 μg·mL－1（ r = 0． 998 3－1． 000 0） ． The average recoveries were 95． 3% – 104． 1% ，except His 92． 9 % ，Met 90． 6% ，and RSD less than 2． 0% ，except His 2． 8% and Met 3． 3% ． Conclusion The method is sensitive and accurate with high repeatability and stability，and is helpful for the determination of amino acids in cordyceps mycelium powder．
KEY WORDS Cordyceps mycelium powder； Amino acids； Phenyl isothiocyanate； Internal standard method； HPLC
虫草头孢菌粉为新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角 菌科真菌虫草头孢 （ Cephalosporiun sinensis． Chen． Sp． nov） 经液体深层发酵所得的菌丝体的干燥粉末，具有 补肺肾、益精气的功能，可用于治疗两虚引起的咳嗽、 气喘、咯血、腰酸背痛及慢性支气管炎的辅助治疗［1-2］。 研究表明，虫草头孢菌粉中所含的氨基酸作为蛋白质 的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质，是人 体的必需 营 养 成 分 之 一［3］。 虫 草 头 孢 菌 粉 已 收 载 于 国家标准中［标准号： WS-10001-（ HD-1280） -2002］，标 准中已对腺苷、甘露醇类物质等有效成分进行控制，但 未对氨基酸含量进行控制［4］，笔者参考 文 献［5 ］，研 究 建立虫草头孢菌粉中的 16 种氨基酸的异硫氰酸苯酯 （ PITC） 柱前衍生化反相高效液相色谱（ RP-HPLC） 测 定 方 法， 从 而 控 制 虫 草 头 孢 菌 粉 的 质
表 1 梯度洗脱程序 Tab． 1 Gradient elution progFra Baidu bibliotekam
时间 / min 0． 0 3． 0 9． 0 18． 0 23． 0 24． 0 25． 0 25． 1 30． 0
流动相 A-B 比例 100∶ 0 100∶ 0 86∶ 14 75∶ 25 45∶ 55 0∶100 0∶100 100∶ 0 100∶ 0
医药导报 2012 年 12 月第 31 卷第 12 期卷终
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2 方法与结果 2． 1 色谱条件 采用 Agela Venusil XBP-C18 色谱柱 （ 150 mm×4． 6 mm，5 μm） ，柱温为 40 ℃ 。流动相 A 为 0． 1 mol·L－1 醋酸钠缓冲液（ 以醋酸调 pH 至 6． 5） -乙 腈（ 95∶5） ； 流动相 B 为乙腈-水 （ 4 ∶1 ） 进行梯度洗 脱，程序见表 1，流速 1 mL·min－1 。检测波长 254 nm； 进样量 4 μL。
酸分别为 92． 9% 和 90． 6% 外，其余 14 种氨基酸在 95． 3% ～ 104． 1% 之间； RSD 除组氨酸、甲硫氨酸分别为 2． 8% 和 3． 3%
外，其余均＜2． 0% 。结论 该方法灵敏、准确，具有良好的重复性和稳定性，可用于虫草头孢菌粉中氨基酸的检测。
关键词 虫草头孢菌粉； 氨基酸； 异硫氰酸苯酯； 内标法； 色谱法，高效液相
收稿日期 2012－06－12 修回日期 2012－08－15 作者简介 石云峰（ 1979 －） ，男，内蒙古人，主管药师，硕 士，主要从事药品检验与药品质量标准的研究。电话： 0571 － 86459422，E-mail： lin－net@ 163． com。
量。 1 仪器与试药 1． 1 仪 器 Agilent 1100 高 效 液 相 色 谱 仪； DHG9023A 型电热恒风干燥箱（ 上海精宏实验设备有限公 司） 。 1． 2 试药 PITC，Alpha Aesar 公司，纯度 99． 0% ； 乙 腈为色谱纯，醋酸钠、三乙胺、醋酸皆为分析纯。正亮 氨酸对照品，Sigma 公司，纯度≥98． 5% 。氨基酸对照 品（ 批号： 100624-200805） ，包括天冬氨酸（ Asp） 、谷氨 酸（ Glu） 、丝氨酸（ Ser） 、甘氨酸（ Gly） 、组氨酸（ His） 、 精氨酸 （ Arg） 、苏 氨 酸 （ Thr） 、丙 氨 酸 （ Ala） 、脯 氨 酸 （ Pro） 、缬 氨 酸 （ Val ） 、甲 硫 氨 酸 （ Met ） 、异 亮 氨 酸 （ Ile） 、亮氨酸（ Leu） 、苯丙氨酸（ Phe） 、赖氨酸（ Lys） 及 脯氨酸（ Pro） 均来自中国食品药品检定研究院。草头 孢菌粉为国内企业提供，批号分别为 101102，110101， 110203，20110705，20110706，20100811，20110203， 20110205，101009，20110617，样品号分别为 1 ～ 10。