荧光偏振技术介绍

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原理：

当荧光分子受平面偏振光激发时，如果分子在受激发时期(对于荧光素约持续 4纳秒)保持静止，发射光将位于同样的偏振平面。如果在受激发时期，分子旋转或翻转偏离这一平面，发射光将位于与激发光不同的偏振面。 如果用垂直的偏振光激发荧光素，可以在垂直的和水平的偏振平面检测发射光光强(发射光从垂直平面偏向水平平面的程度与荧光素标记的分子的迁移率有关)。如果分子很大，激发时发生的运动极小，发射光偏振程度较高。如果分子小， 分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化。如图2.

图2 荧光偏振检测原理

任何物质都处于不断运动当中，液态环境中的荧光分子也不例外。因此当受到偏振光激发时，荧光分子的运动状态例如旋转、翻转、相互结合、排斥、溶液的粘度、温度等这些因

素都有可能对这个荧光因子受激发后发出的偏振光的性质产生影响。对此进行分析比较，有可能揭开物质活动的内在规律，达到研究目的，“荧光偏振”。近年来，以这种物理学现象为基础的技术在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。因此，我们可以看到，以荧光偏振为基础发展的技术可用来研究生命科学中分子之间的相互作用，以及分子与所处环境——“小”至核酸和蛋白结构，“大”至整个细胞——的相互作用。相对于传统研究方法，荧光偏振技术在溶液中进行，可最大程度的模拟真实生命环境；利用它，可以实时跟踪监测分子间结合/分离的变化，并解决一直以来困扰荧光技术使用者们对于荧光无法定量的烦恼。最为重要的是，相对于一直被人们使用的放射性同位素研究方法，它更为安全可靠，不会在实验过程中对研究者造成威胁，也不会产生难以处理的具有放射性的废弃物。此外，荧光偏振所需的样品

量少，灵敏度高，重复性好，操作简便。

概述

光由微小的波构成，光波可以在任何一个平面上均匀的振动。当其通过某些平面时，有可能因受到平面的作用将光波的能量分成不均匀的光束，振动平面也就发生了变化，可能在某一个方向的振动强或弱于其他平面，这种光称为偏振光。如图1.化学研究中常用到偏振光理论，这是因为偏振光在通过含有某种分子的溶液时，其振动性质将发生改变，如偏振平面受到扭转，根据扭转的方向和角度的变化，就能够对溶液中分子的结构作出推断。

图1 偏振光形成原理

Perrin 于1926年首先描述了荧光偏振理论，他观察到溶液中的荧光分子在受到偏振光激发时，如果在激发时分子保持静止，该分子将发出固定偏振平面的发射光(发射光仍保持偏振性)。然而，如果分子旋转或翻转那么发射光的偏振平面将不同于初始激发光的偏振平面。

分子的偏振性与分子旋转驰豫时间成比例，分子旋转驰豫时间是分子转过 68.5度角时所用的时间。 分子旋转驰豫时间与粘度、绝对温度、分子体积和气体常数有关。

荧光偏振技术介绍

偏振光和荧光分子相结合形成的荧光偏振理论，正在生物学分支学科理论和应用研究中大显身手。成为基础科学研

究和药物筛选研究中的一个重要检测手段。

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核酸结构变化研究

利用荧光偏振可帮助揭开DNA 结构和结合蛋白之间的作用关系。以2003年Nucleic Acids Research 发表的一篇文章为例，该研究发现，以荧光标记寡核苷酸，后者可高度自由旋转，因此受到偏振光的激发后发出的激发光偏振性很低。解旋酶-寡核苷酸复合物分子量大，旋转速度低，激发光的偏振性高。随着复合物的解体，高的偏振信号急剧减弱。因此，这种方法可结合动力学研究，通过偏振信号的变化对DNA 双链形成和解链过程进行实时监测，灵敏度高，方便迅速。此外，这种方法也应用于其它蛋白与DNA 结合的研究中。

蛋白激酶活性研究

人体细胞内的蛋白激酶可以对细胞外调节因子和环境变化做出反应，使细胞活化、生长和分化，转录调节、免疫应答等的重要调节因子。Panvera 开发了一种基于荧光偏振的蛋白激酶活性试剂盒，可方便快捷的进行蛋白激酶抑制因子和筛选工作。其工作原理如下：将磷酸化底物进行荧光标记，与由蛋白激酶产生的未标记磷酸化产物抗丝氨酸抗体相竞争结合。当反应液中没有蛋白激酶产生的磷酸化产物时，荧光标记物与抗体相结合，因复合物体积较大，运动速率较小，受偏振光激发后产生的激发光具有较大的偏振值；当反应液中含有蛋白激酶产生的磷酸化产物时，因二者竞争抗体的结合位点，较少的荧光标记物结合到抗体上去，自由的荧光标记物在反应液中增多，发出的激发光偏振值减小。因为蛋白激酶的活性越大，产生的磷酸化产物越多，与荧光标记物的竞争越激烈，对标记物产生的激发光的性质影响越大，因此偏振的改变直接与蛋白激酶的活性相关。这种分析简单，易于应用，可很好的适用于高通量的筛选工作。

SNPs 筛选

长期以来，SNPs 位点的快速筛选需要大量的基因分型工作，花费巨大，是工作进展的最大障碍。现在，研究者可以采用荧光偏振为基础的FP-TDI 技术（fl uorescence polarization template-directed dye-terminator incorporation ）进行高通量单核苷酸多态分型，操作简单，投入少。

目前，荧光偏振技术在生命科学研究领域的应用并不局限于以上几个方面，以荧光偏振为基础已经衍生出多项相关技术。受篇幅所限，本文只是将荧光偏振在目前研究领域中热门方向中的应用和原理作了一个简单的介绍。相信随着学科间的不断交叉、融合和这项技术的优化与推广，它将受到研究者越来越广泛的关注，在更多的研究领域发挥其重要作用。

荧光偏振分析是利用荧光偏振的原理，通过检测荧光素标记的小分子与其它分子相互作用前后分子量的变化，计算水平方向及垂直方向 的荧光偏振值作相关分析。如果被检测分子大，激发时运动慢，测得的荧光偏振光值高。如果分子小，分子旋转或翻转速度快，发射光相对于激发光平面将去偏振化，测得的偏振光值低，从而计算出样品的偏振值（偏振值单位MP ）。通过专用分析软件，可对检测结果进行分析，判别等工作。

荧光偏振技术的优势

荧光偏振技术比研究蛋白质与核酸结合的传统方法具有更多优势(特别是不生成有害的放射性废物)并且检测限更低，可达亚纳摩尔级范围。此外荧光偏振是真正均相的，允许实时检测(动力学检测)，对于浓度变化不敏感，是均相检测形式(中间不含洗涤步骤)的最佳解决方案。临床应用概述

荧光偏振免疫技术（Fluorescence Polarization Immunassay ）——这是一项相对较为成熟的技术。它利用荧光偏振原理，采用竞争结合法机制，常用来监测小分子物质如药物、激素在样本中的含量。以药物检测为例，以荧光素标记的药物和含待测药物的样本为抗原，与一定量的抗体进行竞争性结合。荧光标记的药物在环境中旋转时，偏振荧光的强度与其受激发时分子转动的速度成反比。大分子物质旋转慢，发出的偏振荧光强；小分子物质旋转快，其偏振荧光弱（去偏振现象）。因此，在竞争性结合过程中，样本中待测药物越多，与抗体结合的标志抗原就越少，抗原抗体复合物体积越大，旋转速率越慢，从而激发的荧光偏振光度也就越少。当我们知道了已知浓度的标记抗原与荧光偏振光性的关系后就可以测量未知浓度的物质。因此，这项技术可用来检测环境或食品样品中有毒物质如农药的残留量。此外，临床医学诊断也在广泛采用荧光偏振。除应用上述方法可测定人体体液样本中某一特定物质的含量外，也可直接应用于临床诊断。例如，由Cercek 等开发的恶性肿瘤诊断方法中提出，进入淋巴细胞的荧光物质，受胞浆浓度有序性的干扰，其运动方向和速率会发生变化。胞浆粘度高时，荧光物质运动变慢，受偏振光激发产生的激发光与胞浆粘度低时产生的激发光性质不同。通过追踪测定激发的偏振光性质，即可了解淋巴细胞的胞浆流动性、粘度等环境的变化，结合其它辅助诊断方法，可有助于癌症的早期诊断。利用荧光偏振，还可检测病人样本中病毒DNA 如HBV 、HPV 的复制量，为临床诊断提供有力的量化指标依据。科研方面

从荧光偏振的理论基础可以看出，它特别适用于研究分子之间的相互作用关系，因此，越来越多的研究者开始寻找以荧光偏振为基础的研究方法来解决技术难题。目前，荧光偏振在生物学研究的应用主要有以下几个方面：