Qiagen 质粒抽提试剂盒
大肠杆菌质粒转染实验-QIAGEN大提试剂盒
质粒抽提一、溶液及培养基配制：1、LB液体培养基（1）配方:酵母提取物（Yeast extract）5g/L胰蛋白胨（Tryptone）10g/L（2）配制：A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。
B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于锥形瓶中，搅拌使药品全部溶化。
C、定容。
D、加塞、包扎。
F、高压灭菌121 C, 30min ,灭菌后室温保存备用。
若要分装需要在超净台内。
G、培养基完全溶解，降至室温后，加氨苄霉素（AMP ）。
先将AMP用三蒸水配制为100mg/ml母液，而后每1ml母液加至1000ml培养基。
（可以多配制一些，分装为1ml/管）2、LB固体培养基（1）配方:酵母提取物(Yeast extract)5g/L氯化钠（NaCl）5g/L胰蛋白胨（Tryptone）10g/L氨苄青霉素溶液100^g/ml （终浓度）（即100mg溶于1ml超纯水或生理盐水或PBS，再加入1000ml培养基）琼脂粉15g/L（2）配制：A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。
B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，搅拌使药品全部溶化。
C、5mol/L NaOH 溶液调pH 到7.4。
D、定容。
E、分装、加塞、包扎。
F、高压灭菌121 C, 30min。
G、火菌后，将融化的LB固体培养基置与55 C的水浴中（或室温），待培养基温度降到55C时（手可触摸）加入抗生素，（免温度过高导致抗生素失效），并充分摇匀。
（3）倒板：一般20ml倒1块板，培养基倒入培养皿后，打开盖子，水分晾干后盖上盖子并用封口膜封口，4 C保存备用，使用前提前拿出，防止水蒸气滴入板中。
首要检查是否有足够的固体和液体LB培养基，基本上每个质粒需要一块固体培养基，小摇的2ml和大摇的250ml LB培养基。
小摇的可以在一个50ml离心管中预备着，每次直接取用。
转化所需L形玻璃棒需确认已灭菌摇菌器申请，张评浒老师，王雪师姐；注意：考虑到多种东西需要灭菌，可以在转化之前或者小摇大摇那天一起灭菌。
QIAGEN 中文版去内毒素大提试剂盒
纯化高转染级别的质粒DNA 【工作台流程】BENCH PROTOCOL准备工作：1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1)2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water)3.可选：加 LyseBlue 试剂于 Buffer P14.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解5.Buffer P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill6.细菌扩增培养补充：1.准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液，2个用于接下来的菌块重悬和与buffer混合2.1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯，因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA3.5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制4.准备1个冰浴盒用于步骤65.准备室温下的异丙醇10.5ml6.4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳步骤：peocedureA.细菌培养、收获和裂解bacterial culture,harvest & lysis1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度；6000×g；15min从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落，2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm，注意孵化容器容积至少4倍于培养液）抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。
(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。
(孵化容器容积至少4倍于培养液，培养至细菌密度约3-4×109/ml，即离心后菌块湿重约3g/L培养基)培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠溶于800ml蒸馏水，用1 N NaOH 调pH值至7.0，用蒸馏水调整至1L。
QIAGEN Plasmid Kits(德国凯杰质粒提取试剂盒说明书中文翻译)
QIAGEN Plasmid Mini,Midi,and Maxi Kits（说明书中文翻译版）Plasmid Midi Kit(cat.Nos.12143and12145)The kit can be stored at room temperature(15~25℃)for up to2years.使用前的注意事项：（1）将Rnase A solution加入Buffer P1中，混匀，2~8℃储存。
（2）可选步骤：按1:1000的比例将LyseBlue试剂加入到Buffer P1中。
（3）使用前在4℃预冷Buffer P3，检查Buffer P2是否出现SDS沉淀。
（4）需准备好异丙醇和70%酒精。
（5）标志：圆形代表小提试剂盒；三角形代表中提试剂盒；正方形代表大提取试剂盒。
表1推荐LB培养物体积试剂盒高考倍质粒低拷贝质粒小提3mL不推荐中提25mL100mL大提100mL500mL具体操作步骤：1.收取过夜培养的细菌培养物，在4℃条件下6000×g离心15min。
2.（弃去上清液）使用4mL Buffer P1重悬菌体沉淀。
3.加入4mL Buffer P2，颠倒4~6次使彻底混匀，室温（15~25℃）孵育5min。
注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液会变蓝。
4.加入4mL预冷过的Buffer P3，颠倒4~6次使彻底混匀，冰上孵育15min。
注：如果使用了LyseBlue试剂，溶液混匀后直至蓝色消失。
5.在4℃条件下≥20000×g（14000×g）离心30min。
6.平衡柱子QIAGEN-tip100：加入4mL Buffer QBT，通过重力流使液体过柱。
7.将第5步的上清液转移至QIAGEN-tip中，使其依靠重力流通过柱中的树脂。
8.使用10mL Buffer QC洗涤QIAGEN-tip，使Buffer QC依靠重力流通过柱中的树脂。
洗涤2次。
质粒提取试剂盒原理
质粒提取试剂盒原理质粒提取试剂盒是一种用于提取质粒DNA的试剂盒，其原理主要基于离心、蛋白酶消化和硅胶膜吸附等方法。
在进行质粒提取实验时，首先需要将含有目标质粒的细菌培养物进行离心，将细菌沉淀物收集起来。
接着，通过加入蛋白酶等消化酶，将细菌细胞壁和膜等部分消化掉，释放出目标质粒。
最后，利用硅胶膜的吸附作用，将目标质粒吸附在硅胶膜上，再通过洗涤等步骤将杂质去除，最终得到纯净的质粒DNA。
质粒提取试剂盒的原理主要包括以下几个步骤：1. 离心，将含有目标质粒的细菌培养物进行高速离心，使细菌沉淀成为一个团。
这样做的目的是将细菌细胞从培养基中分离出来，为后续的蛋白酶消化提供条件。
2. 蛋白酶消化，将离心后的细菌沉淀物加入蛋白酶等消化酶，通过消化细菌细胞壁和膜等部分，释放出目标质粒。
这一步骤是质粒提取试剂盒中至关重要的一步，能够有效地将目标质粒从细菌细胞中释放出来。
3. 硅胶膜吸附，将经过蛋白酶消化的细菌沉淀物加入硅胶膜柱中，利用硅胶膜的吸附作用将目标质粒吸附在硅胶膜上。
硅胶膜具有很强的吸附能力，可以有效地将目标质粒与其他杂质分离开来。
4. 洗涤，通过洗涤等步骤将杂质去除，最终得到纯净的质粒DNA。
这一步骤是为了去除硅胶膜上的杂质和残余的蛋白酶等物质，使得提取的质粒DNA更加纯净。
总结来说，质粒提取试剂盒的原理是通过离心、蛋白酶消化和硅胶膜吸附等方法，将目标质粒从细菌细胞中提取出来，并最终得到纯净的质粒DNA。
这一原理简单易懂，操作方便，适用于实验室中的质粒提取工作。
通过对质粒提取试剂盒原理的深入了解，可以更好地进行质粒提取实验，并取得准确可靠的实验结果。
QIAGEN最新试剂盒质粒大提操作步骤(翻译版)
QIAGEN EndoFree Plasmid Maxi KitCatalog numbers 12362 室温下15-25度存放2年。
在开始之前作如下准备1）按照说明把RNase A加到Buffer P1 中，混匀，放到2-8度储存。
选作：按照1:1000的比例把LyseBlue 加到Buffer P12）pre-chill Buffer P3 4°C存放。
3）检查Buffer P2 是否有SDS沉淀物，可以放到37℃短暂温热以便溶解分子沉淀物。
4）准备异丙醇。
5）用试剂盒提供的无内毒素的水中加入40ml的96-100%的酒精。
大量质粒提取过程在LB培养基中种植转化的E.coli菌。
使用100ml（高复制数的质粒）或者250ml（低复制数的质粒）过夜培养。
操作步骤如下1.收获LB培养过夜的细菌，在6000g，4℃条件下离心15min。
2.加入10ml Buffer P1（根据SBI要求加倍，用20ml）重悬细菌。
3. 加10ml Buffer P2（根据SBI要求加倍，用20ml），剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。
如果使用了LyseBlue试剂，溶液应该变成均匀蓝色。
4.在孵育期间，打开针口的密封盖.并把过滤器放到合适的架子上。
5.加入10ml冰浴的Buffer P3（根据SBI要求加倍，用20ml）到此溶菌产物中，剧烈晃动离心管4-6次使其混匀。
如果加入了LyseBlue试剂，混匀试剂直到没有颜色。
6.将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。
打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。
7. 加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。
8.将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液通过重力滴下排空。
9.将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。
质粒提取试剂盒 (2)
质粒提取试剂盒简介质粒提取试剂盒是一种用于从细菌中提取质粒的试剂盒。
质粒是一种可以在细菌细胞内自主复制的环状DNA分子，广泛应用于基因工程和分子生物学研究中。
质粒提取试剂盒通过一系列化学和物理方法，可以快速、高效地提取细菌中的质粒，并纯化出目标质粒，供后续实验使用。
组成质粒提取试剂盒一般包含以下主要试剂：1.细菌裂解缓冲液：用于破坏细菌细胞膜，释放细菌内的质粒和其他细胞组分。
2.蛋白酶K：用于降解细菌细胞中的蛋白质，减少蛋白质对质粒提取的干扰。
3.碱式溶液：用于中和细菌裂解液中的酸性成分，以保持适宜的酸碱平衡。
4.酚/氯仿混合溶液：用于分离DNA和蛋白质。
DNA会转移到酚相，而蛋白质则会转移到氯仿相。
5.洗涤缓冲液：用于去除酚/氯仿混合溶液中的残余蛋白质和杂质。
6.乙醇：用于沉淀DNA。
7.纯化缓冲液：用于溶解和稀释沉淀的DNA，以得到纯净的质粒DNA。
使用步骤步骤一：细菌培养和扩增1.首先，选择含有目标质粒的细菌菌落，将其接种到含有适当抗生素的琼脂培养基上。
2.在恒温振荡培养箱中以适当的温度和时间对细菌进行培养，使其形成细菌液培养物。
3.将细菌液培养物按照说明进行扩增，获得足够的细菌量以便后续提取质粒。
步骤二：质粒提取1.向适量的细菌液培养物中加入适量的细菌裂解缓冲液，充分混匀。
2.在室温下孵育一段时间，使细菌细胞完全裂解。
3.加入适量的蛋白酶K，消化掉细菌细胞中的蛋白质。
4.加入碱式溶液，中和酸性成分。
5.加入等体积的酚/氯仿混合溶液，轻轻倒置试管，使混合溶液充分混合。
6.离心混合溶液，使溶液分为上层酚相、中间界面层和下层氯仿相。
7.将上层酚相转移到新的离心管中。
8.加入等体积的洗涤缓冲液，轻轻倒置试管，使混合溶液充分混合。
9.离心洗涤溶液，将上层酚相转移到新的离心管中。
10.重复洗涤步骤，直到洗涤液清澈无色。
11.加入冰冷的乙醇，使DNA沉淀。
12.用洗涤缓冲液洗涤DNA沉淀。
13.用乙醇洗涤DNA沉淀。
质粒提取试剂盒
质粒提取试剂盒
质粒提取试剂盒是一种用于从细菌中提取质粒的实验工具。
质粒是细菌中的一种环状DNA分子，常用于基因工程和遗传学研究。
质粒提取试剂盒通常包含以下主要试剂：
1. 细菌裂解缓冲液：用于破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒。
2. 酚/氯仿溶液：用于提取DNA，并去除细菌的碎片和蛋白质。
3. 乙酸缓冲液：用于沉淀DNA。
4. 纯化缓冲液：用于纯化提取的质粒DNA。
使用质粒提取试剂盒的步骤一般包括以下内容：
1. 收集细菌：在培养基上培养转染了目标质粒的细菌。
2. 细菌浸液：将培养的细菌转移到裂解缓冲液中，使其充分裂解。
3. 加入酚/氯仿溶液：将酚/氯仿溶液加入细菌浸液中，混合均匀，并离心分离液相。
4. 收集DNA：将DNA上清液收集到新离心管中，并加入乙酸缓冲液，沉淀DNA。
5. 洗涤DNA：倒掉上清液，用乙酸缓冲液洗涤DNA沉淀。
6. 溶解DNA：将纯化缓冲液加入DNA沉淀中，将DNA溶解。
通过质粒提取试剂盒，可以方便地从细菌中提取质粒DNA，并进行后续的分子生物学实验。
QIAGEN-质粒提取操作
质粒提取操作步骤——QIAGEN(德国凯杰)质粒提取试剂盒一、细菌培养物的生长1. 从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到2-5mL含有适当抗生素的LB液体培养基中生长。
将液体培养基置于37℃，300rpm的摇床中振荡8小时。
2. 用LB培养基以1/500~1/1000的比例稀释含菌落的培养基。
若为了获得高拷贝质粒，用100-200ul含菌落液体培养基接种到100ml LB培养基中；若为了获得低拷贝质粒，用250~500ul含菌落培养基接种到250ml LB培养基中。
让其在37℃，300rpm的摇床中振荡12-16小时。
二、细菌的收获和裂解1. 在6000×g，4℃条件下离心15min，收获细菌。
2. 加入10ml Buffer P1重悬细菌。
3. 添加10ml Buffer P2，剧烈晃动离心管4-6次使其彻底混匀，室温放置5min。
4. 加入10ml冰浴的Buffer P3到此溶菌产物中，晃动离心管4-6次使其混匀。
5. 将溶菌产物倒入针口密封的过滤器中，室温放置10min，不要插入活塞。
6. 打开针口的密封盖，轻轻挤压活塞将溶菌产物过滤到一新的50ml离心管中。
7. 添加2.5ml Buffer ER到过滤的溶菌液中，充分混匀10次后冰上孵育30min。
三、质粒DNA的纯化1. 将QIAGEN-tip 500的柱子挂在另一离心管上，加入10ml Buffer QBT，让管中溶液慢慢滴下排空。
2. 将第7步冰上孵育的溶菌液加入QIAGEN-tip柱子中让其透过树脂慢慢滴下。
3. 用2×30ml Buffer QC洗QIAGEN-tip柱。
4. 再用15ml Buffer QN洗脱DNA，用离心管收集DNA洗脱液。
5. 加入10.5ml异丙醇到洗脱液中使DNA沉淀下来，混匀。
15000×g，4℃离心30min，离心后小心倒出上清液。
6. 洗DNA用5ml无内毒素-70%乙醇(添加40ml 96%-100%乙醇到试剂盒的无内毒素水中)，15000×g，4℃离心10min。
QIAGEN-中文版去内毒素大提试剂盒
纯化高转染级别的质粒DNA 【工作台流程】BENCH PROTOCOL准备工作:1.将RNase A 溶液加入P1缓冲液(Buffer P1)2.加40ml96－100％乙醇(ethanol)于试剂盒的去内毒素水中(endotoxin-fre water)3.可选: 加 LyseBlue 试剂于 Buffer P14.检查 Buffer P2是否有SDS沉淀precipitation 有沉淀可在37摄氏度下暖化溶解5.Buffer P3 置于4摄氏度中预冷pre-chill6.细菌扩增培养1.补充:2.准备4-6个50ml新的或灭菌的离心管用于冷冻离心机下离心过夜菌液, 2个用于接下来的菌块重悬和与buffer混合3.1个无内毒素的30ml聚丙烯（不推荐聚碳酸酯, 因为不耐乙醇）管子（最好用圆底的离心管以利于高速离心）用于收集洗提的质粒DNA4.5个1.5ml的EP管用于收集抽提过程各步骤的产物用于实验后分析和质量控制5.准备1个冰浴盒用于步骤66.准备室温下的异丙醇10.5ml7.4摄氏度冰冻离心机和分光光度仪,琼脂糖凝胶电泳步骤: peocedureA.细菌培养、收获和裂解bacterial culture,harvest & lysis1.100ml高拷贝high-copy或250ml低拷贝low-copy过夜overnight LB培养菌液于冰冻离心机4摄氏度；6000×g；15min从新鲜的抗生素平板上挑取一个单菌落, 2-5ml抗生素LB液体初始培养基30摄氏度孵化约8小时（振荡300rpm, 注意孵化容器容积至少4倍于培养液）抗生素LB液体培养基稀释初始培养液到1:500-1000。
(高拷贝质粒100-200ul初始培养液加于100ml培养基；低拷贝质粒250-500ul初始培养液加于250ml培养基)37摄氏度300rpm振荡12-16小时。
(孵化容器容积至少4倍于培养液, 培养至细菌密度约3-4×109/ml, 即离心后菌块湿重约3g/L培养基)培养基配方：10g蛋白胨+5g酵母+10g氯化钠溶于800ml蒸馏水, 用1 N NaOH 调pH值至7.0, 用蒸馏水调整至1L。
质粒提取试剂盒原理
质粒提取试剂盒原理
质粒提取试剂盒是一种用于提取质粒DNA的试剂盒，其原理是利用离心、溶解、吸附、洗脱等步骤将目标DNA从细胞裂解液中分离出来。
下面将详细介绍质
粒提取试剂盒的原理及各个步骤的作用。
首先，细菌裂解液中的细胞膜和细胞壁会被破坏，使得细胞内的质粒DNA暴
露出来。
接着，加入试剂盒中的一种缓冲液，能够使DNA和其他细胞成分分离开来，使得DNA能够在后续步骤中被提取出来。
然后，通过离心将细胞碎片和其他
杂质沉淀到管底，上清液中的DNA得以分离。
接下来，将上清液加入试剂盒提供
的柱子中，DNA会在柱子上被特定的材料吸附住，而其他杂质则会被洗脱掉。
最后，用洗脱缓冲液将DNA从柱子上洗脱下来，得到纯净的质粒DNA。
质粒提取试剂盒的原理是基于DNA的物理性质和化学性质，通过不同步骤的
组合实现对质粒DNA的高效提取。
在整个提取过程中，试剂盒提供的各种缓冲液
和柱子起着至关重要的作用，能够使DNA得以分离和纯化。
这种原理简单而高效，适用于从各种细菌中提取质粒DNA，为后续的分子生物学实验提供了可靠的DNA
样本。
总的来说，质粒提取试剂盒的原理是通过细胞裂解、DNA分离、DNA吸附、
洗脱等步骤，将目标DNA从细胞裂解液中提取出来。
这种原理简单易行，操作方便，适用于实验室中的质粒DNA提取工作。
希望通过本文的介绍，能够让大家对
质粒提取试剂盒的原理有一个更加清晰的认识，为实验工作的顺利开展提供帮助。
QIAGEN质粒大提试剂盒
产品简介本试剂盒采用独特的硅胶模吸附技术，高效专一地结合质粒DNA。
同时采用特殊的溶液P4和过滤器CS1，可有效的出去内毒素、蛋白质杂志；整个提取过程仅需1h，方便快捷。
使用本试剂盒提取的质粒DNA可适用于各种常规操作，包括酶切、PCR、测序、连接、转化和细胞转染多种细胞等试验。
推荐每次菌液使用量：高拷贝质粒推荐使用量为100ml，得率一般在500-1500μg左右；低拷贝质粒推荐使用量为200ml，得率一般在200-600μg左右。
注意事项：请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项。
1.溶液P1在使用前先加入RNase A （将试剂盒中提供的RNase A全部加入)，混匀，置于2-8℃保存。
2.第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在漂洗液PW中加入无水乙醇。
3.使用前先检查平衡液BL，溶液P2和P4是否出现结晶或者沉淀，如有结晶或者沉淀现象，可在37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
4.注意不要直接接触溶液P2和P4，使用后应立即盖紧盖子。
5.使用过滤器时请将推柄小心缓慢地从过滤管中抽出，避免滤膜因压力而松动。
6.提取的质粒量与细菌培养浓度，质粒拷贝数等因素有关。
如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加P1、P2、P4的用量；洗脱缓冲液推荐在65-70℃水浴中预热，可以适当延长吸附和洗脱时间，以提高提取效率。
7.实验前使用平衡液BL处理吸附柱，可以最大限度激活硅基质膜，提高得率。
8.用平衡液处理过的柱子最好立即使用，放置时间过长会影响使用效果。
质粒DNA 浓度及纯度检测得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
OD260值为1相当于大约50μg/ml双链DNA。
纯化的质粒DNA OD260/OD280通常在1.8-2.0左右，可直接应用于细胞转染甚至动物体内实验等对DNA纯度要求很高的实验中。
操作步骤：1.柱平衡步骤：向吸附柱CP6中（吸附柱放入50ml收集管中）加入2.5ml的平衡液BL，8000rpm（~8228×g）离心2min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
QIAQUICK质粒抽提说明书
QIAQUICK质粒抽提说明书
⑴使用质粒提取试剂盒提取质粒时请参考具体试剂盒的操作说明。
⑵碱裂解手提法：此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下：
①接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2mlLB培养基。
②37℃振荡培养过夜。
③取1.5ml菌体于Ep管(离心管)，以4000rpm离心3min，弃上清液。
④加0.lml溶液I（1%葡萄糖，50mM/LEDTApH8.0，25mM/LTris-HClpH8.0）充分混合。
⑤加入0.2ml溶液II（0.2mM/LNaOH，1%SDS），轻轻翻转混匀，置于冰浴
5min.
⑥加入0.15m1预冷溶液III（5mol/LKAc，pH4.8），轻轻翻转混匀，置于冰浴5min.
⑦以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管。
⑧加入等体积的异戊醇，混匀后静置10min.
⑨以10，000rpm离心20min，弃上清。
⑩用70%乙醇0.5ml洗涤一次，抽干所有液体。
⑪待沉淀干燥后，溶于50ulTE缓冲液中（或60℃温育去离子水）。
QIAGEN-组织提取试剂盒
试剂盒成分
本实验使用量
QIAamp Spin Column 1个
Collection Tubes
2个
Buffer AL
200ul
Buffer AW1
500ul
Buffer AW2
500ul
Buffer AE
100ul
QIAGEN Protease
20ul
实验步骤
（一）准备样本 将冻存在-40 ℃的样本取出，在37
加入200ul的溶液AL，旋涡混合均匀
70 ℃孵育10min,加热灭活蛋白酶K
加入200ul的（96-100%）的乙醇，旋涡混合数秒
轻轻的将离心管内的混合物转移到 离心柱内（切勿接触到离心柱沿）， 盖上管盖，8000rpm离心1分钟
将离心柱置于一个干净的2ml 收集管内， 将含有过滤物的旧管丢弃
加入50ul 0.1M的Tris-Hcl/EDTA， 反复冻融（-40°C---90°C）3次
加入10ul 20ug/ml蛋白酶K， 在56°C水浴箱中孵育过夜
在放入100°C中灭活10min 放入-20°C冰箱中保存
实验步骤
准备样本 将皮肤组织标本从70%的酒精
中取出，放入1 ×TE中浸泡1小时， 取出后用消毒的剪刀，镊子将其剪 成肉泥状。
消化样本
将肉泥状的皮肤组织放入EP管中， 加入消化液ATL180ul和蛋白酶
K20ul,55 ℃消化大约72h，期间用旋
涡混合器振荡混合助溶。消化好的样 本成清亮透明。
加入200ul的溶液al旋涡混合均匀70孵育10min加热灭活蛋白酶k加入200ul的96100的乙醇旋涡混合数秒轻轻的将离心管内的混合物转移到离心柱内切勿接触到离心柱沿盖上管盖8000rpm离心1分钟将离心柱置于一个干净的2ml收集管内将含有过滤物的旧管丢弃加入500ul的溶液aw18000rpm离心1分钟将离心柱置于一个干净的2ml收集管内将含有过滤物的旧管丢弃加入500ul的溶液aw214000rpm离心3分钟将离心柱置于一个干净的2ml收集管内将含有过滤物的旧管丢弃洗脱基因组dna将离心柱置于一个干净的15ml的离心管内将含有过滤物的旧管丢弃加50ul的溶液ae室温孵育5分钟8000rpm离心1分钟检测
菜鸟级大抽质粒之前的准备 QIAGEN版
菜鸟级大抽质粒实验前准备QIAGEN版目前本人以菜鸟级身份，在师兄师姐们的指点下顺利使用QIAGEN 试剂盒进行了大抽，现在将操作步骤、实验原理注意事项、之前需要准备的东西都进行一下小小的总结，以方便各位菜鸟们在实验之前有个基本的认识，这样操作起来心里会比较有数。
但介于本人只是菜鸟级的所以给出的建议仅仅是本人最近几次实验的总结，仅供参考，如果有什么问题还请高手们指点。
在做质粒大量提取前一般需要进行固体培养基铺菌、小试管摇菌然后1L液体培养基摇菌，最后收集菌液进行质粒提取。
D1---准备需要的瓶子及进行固体培养基养菌。
配置固体培养基配方：每升固体(L)LB培养基配方：Nacl 10g 、胰化蛋白胨10g、酵母粉5g 、琼脂糖15g,加950ml 去离子水（RO）高压灭菌20min灭菌后加入待冷却至60°左右时加入相应的抗生素（浓度根据不同的抗生素而定），倒入洗净高压灭菌的玻璃平皿中。
基本上100ml 即可以制作7-10个，所以不用倒的太多太厚，个人觉得细菌生长要求的培养基并不多，所以不用太厚，但要铺的均匀，倒入平皿后不要晃动，待其凝固。
在等待凝固的同时，就可以准备菌液了。
将之前保存的菌液从﹣20°的冰箱中取出，在室温中令其溶解。
充分冲悬混溶，根据之前的浓度大小，取一定量的菌液。
我用的菌液是师姐之前自己保存的，说是浓度还可以，建议我取20μl，结果长出来也还是很满，个人感觉大肠杆菌生长旺盛，只要10-20μl即可以顺利长起来的。
用小枪尖点在已经凝固好的固体培养基的中间，用铺菌专用的铁丝铺满整个平皿，注意铁丝在使用前要用酒精棉擦拭干净并且在酒精灯下充分烧灼灭菌，待铁丝冷却后方可使用。
将铺好菌的平皿放在37°孵箱中孵育过夜。
未使用的平皿可以用封口胶封口保存在4°冰箱中。
一般可以在一个月内使用。
2.为明天的小试管摇菌做准备配液体100mlLB培养基，用于小量培养大肠杆菌。
qiagen 56304提取原理
qiagen 56304提取原理
Qiagen 56304是一种用于DNA提取的试剂盒，其提取原理如下：
1. 预处理：首先，细胞样品需要经过预处理步骤，包括细胞裂解和蛋白质降解。
细胞裂解是将细胞膜破裂，释放细胞内的DNA，通常会使用裂解缓冲液和表面活性剂来实现。
然后，
蛋白质降解酶会将细胞中的蛋白质分解，以消除蛋白质的干扰。
2. 绑定：在这一步骤中，DNA会与硅胶膜相互作用。
硅胶膜
是具有高亲和力的材料，可以与DNA形成非特异性的结合。
将细胞裂解产物与试剂盒中的绑定缓冲液混合，并在硅胶膜上进行吸附。
3. 洗涤：洗涤步骤旨在去除非特异性结合的杂质。
通过添加洗涤缓冲液，硅胶膜上的非特异性结合物质会被冲洗掉，而
DNA仍然保留在硅胶膜上。
4. 解吸：解吸步骤是将DNA从硅胶膜上解吸下来。
使用低盐
含量的洗涤缓冲液，可以使DNA从硅胶膜上解吸下来溶于溶
液中。
通过上述步骤，Qiagen 56304试剂盒能够高效地提取纯度较高
的DNA样品，可用于后续的分析和实验。
Qiagen基因组提取试剂盒中文操作说明
Qiagen基因组提取试剂盒中⽂操作说明QIAamp DNA Blood Mini Kit简介：QIAGEN公司出品的QIAamp DNA Blood Mini Kit适⽤于使⽤微型离⼼机或真空处理从全⾎、⾎浆、⾎清、⾎沉、淋巴细胞以及体液样品中提取总(基因、线粒体和病毒)DNA。
该试剂盒可处理带有EDTA、柠檬酸盐和肝素等常规抗凝剂的新鲜或冷冻的全⾎样本，样品量可达200µl。
整套基因组的操作时间约为20–40分钟，⼀般可从200µl健康全⾎中获得4–12 µg DNA，洗脱体积可在50–200µl范围。
抽提原理：样品中的DNA可以特异性结合到QIAamp的硅胶膜上，通过两次洗涤可以将PCR抑制剂，如：⼆价阳离⼦和蛋⽩完全去除，最后结合在离⼼柱上的纯核酸可⽤⽔或试剂盒中的缓冲液进⾏洗脱收集。
开始前的注意事项：1. 所以的离⼼步骤需要在室温（15-25℃）进⾏2. 如果样品中含有的基因组当量少于10000，请添加载体DNA（carrier DNA）3. 200µl全⾎样品可以得到约3-12µgDNA开始前的准备⼯作：1. 将样品平衡到室温（15-25℃）2. 将⽔浴或是⾦属浴加热到56℃，以备第4步使⽤3. 将Buffer AE或蒸馏⽔平衡到室温，⽤于第11步的洗脱4. 确保Buffer AW1、AW2以及QIAGEN蛋⽩酶已经按照说明配置完毕5. 如果在Buffer AL中出现沉淀物，请在56℃孵育使其溶解操作步骤：以下为整个基因组提取操作的流程图，由于真空装置并⾮所有的实验室都配置，所以这⾥介绍的是离⼼法（流程图左侧）。
以下译介⾃QIAGEN官⽅出品的说明部分，⿊粗体为实验操作的主体部分。
1. 吸取20µl QIAGEN蛋⽩酶（或者蛋⽩酶K）⾄1.5ml离⼼管的底部。
2. 加⼊200µl待提取基因组的样品⾄离⼼管中。
质粒提取试剂盒提取步骤
质粒提取试剂盒提取步骤
一、质粒抽提
1、细胞抽提：将细胞培养物加入或移植到一种含有高浓度酸性剂的6-8mm离心管里，将细胞离心至半浸没，以保持溶液沉积在离心管壁上。
2、除去膜：添加浓酸溶液（如硫酸氢钠（NaHSO3）），膜结构会被溶解，使其细胞表面的结构被破坏，从而除去细胞的膜。
3、去染色：添加RNA隔离试剂，脱去细胞染色物质以获得高纯度的RNA质粒。
4、离心：离心至接近干旱，并移除液体，这时的混合液中已只剩下RNA质粒。
5、抹拭：将离心管倒过来，将质粒在管壁上均匀抹拭，这时的RNA 质粒就会在管壁上附着。
6、冷冻干燥：将管子放到冰上，将管子中的水分蒸发冷冻干燥，使RNA质粒固定在管壁上。
7、溶解：最后，将RNA质粒溶解到可以用于后续实验的溶液中。
二、PCR扩增：
1、PCR建库：将抽提的DNA放入PCR管中，加入PCR反应混合液（包括DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2），并添加特长引物，即可进行PCR 反应。
2、PCR扩增：使用PCR反应温度循环加热并添加高分子量DNA来将DNA片段扩增。
3、电泳：将PCR配型片段送到电泳仪中，使用添加特异性引物的特定电泳条件，检测和鉴定基因突变。
质粒抽提试剂盒原理
质粒抽提试剂盒原理
质粒抽提试剂盒是一种用于从细菌中提取质粒DNA 的试剂盒。
其原理基于以下几个步骤：
1. 细菌培养：首先需要将含有质粒的细菌菌落在培养基中进行扩增培养，使细菌数量增加。
2. 细菌收获：待细菌培养到一定程度后，将培养液离心，将细菌沉淀获得。
3. 细胞破裂：使用破裂缓冲液将细菌细胞破裂，释放细菌细胞内的质粒 DNA。
4. 蛋白质沉淀：通过加入蛋白质沉淀剂，将破裂后的细菌蛋白质沉淀下来。
这一步的目的是去除蛋白质的干扰。
5. DNA 结合：在蛋白质沉淀物上加入乙酸铵和异丙醇，使DNA 萃取溶液中的 DNA 结合到硅胶纤维素膜上。
6. 洗涤：通过多次洗涤去除杂质，如蛋白质、盐等，使 DNA
纯化。
7. 质粒 DNA 释放：向质粒 DNA 结合的硅胶纤维素膜上加入
洗脱溶液，使 DNA 从膜上释放。
8. 质粒 DNA 收获：将质粒 DNA 通过离心等方式收获，得到
纯化的质粒 DNA。
通过以上步骤，质粒抽提试剂盒能够实现从细菌中高效、纯化地提取质粒 DNA，为后续实验提供高质量的 DNA 样本。
大肠杆菌质粒转染实验-QIAGEN大提试剂盒
质粒抽提一、溶液及培养基配制：1、LB液体培养基（1）配方：酵母提取物(Yeast extract) 5g/L胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L（2）配制：A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。
B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于锥形瓶中，搅拌使药品全部溶化。
C、定容。
D、加塞、包扎。
F、高压灭菌121℃，30min，灭菌后室温保存备用。
若要分装需要在超净台内。
G、培养基完全溶解，降至室温后，加氨苄霉素（AMP）。
先将AMP用三蒸水配制为100mg/ml母液，而后每1ml母液加至1000ml培养基。
（可以多配制一些，分装为1ml/管）2、LB固体培养基（1）配方：酵母提取物(Yeast extract) 5g/L氯化钠(NaCl) 5g/L胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L氨苄青霉素溶液100µg/ml（终浓度）（即100mg溶于1ml超纯水或生理盐水或PBS，再加入1000ml培养基）琼脂粉15g/L（2）配制：A、称量：称取培养基各成分所需量，置于烧杯中。
B、溶化：加入所需水量2/3的蒸馏水于烧杯中，搅拌使药品全部溶化。
C、5mol/L NaOH溶液调pH到7.4。
D、定容。
E、分装、加塞、包扎。
F、高压灭菌121℃，30min。
G、灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中（或室温），待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，（免温度过高导致抗生素失效），并充分摇匀。
（3）倒板：一般20ml倒1块板，培养基倒入培养皿后，打开盖子，水分晾干后盖上盖子并用封口膜封口，4℃保存备用，使用前提前拿出，防止水蒸气滴入板中。
首要检查是否有足够的固体和液体LB培养基，基本上每个质粒需要一块固体培养基，小摇的2ml和大摇的250ml LB培养基。
小摇的可以在一个50ml离心管中预备着，每次直接取用。
转化所需L形玻璃棒需确认已灭菌摇菌器申请，张评浒老师，王雪师姐；注意：考虑到多种东西需要灭菌，可以在转化之前或者小摇大摇那天一起灭菌。