金银花中绿原酸的体外抑菌和抗氧化性的研究

　第20卷第2期2005年6月 天津科技大学学报Journal of Tianjin University of Science &Technol ogy

Vol .20　No .2

Jun .　2005

金银花中绿原酸的体外抑菌和抗氧化性的研究

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张泽生,乌　兰

(天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津300222)

摘　要:用紫外光谱法(UV )和高效液相色谱法(HP LC )对金银花中提取的绿原酸进行定性

定量分析,测定了绿原酸对食品中常见的致病菌的抑菌能力,清除DPPH ・自由基的能力和对Fe 3+的还原能力。结果表明:金银花中绿原酸具有较强的抑菌效果,对自由基有较强的清除能力,对Fe 3+有较强的还原能力。关键词:金银花;绿原酸;抑菌;抗氧化

中图分类号:TS207.3 文献标识码:A 文章编号:167226510(2005)022*******

An ti m i crob i a l and An ti ox i da ti on I nv itro of Chlorogen i c Ac i d i n F los

L on icerae

ZHANG Ze 2sheng,W U Lan

(College of Food Engineering and B i otechnol ogy Tianjin University of Science &Technol ogy,Tianjin 300222,China )

Abstract:Quantative and qualitative analysis of chl or ogenic acid in Flos L onicera were devel oped by UVand HP LC .Detect the bacteri ostatic acti on against pathogenic bacteria in diets ,the capacity of eli m inating DPPH ・and deoxidizing Fe 3+

.The results suggested that chl or ogenic acid has a str ong antibacterial acti on,a superi or capacity of eli m inating DPPH ・and deoxidizing Fe 3+

.Key words:Flos L onicerae ;chl or ogenic acid;bacteri ostatic acti on;anti oxidati on

金银花在我国分布广,药用历史悠久,是常用的清热解毒药。金银花为忍冬科(Caprifoliaceae )忍冬属(L on icera )植物忍冬(L onicera japonica thunb )及同属多种植物的干燥花蕾,是临床常用的中药之一。近年来研究发现,金银花中富含多种对人体健康有益的物质,诸如挥发油黄酮及绿原酸类、三萜类和微量元素等,具有很高的利用价值。在众多的成分中绿原酸较为丰富且具有多种活性功能,因此常以绿原酸含量的高低评价金银花质量的优劣[1]

。 绿原酸是一种含有酚羟基的化合物,药理学证明,

绿原酸具有保护心血管的活性[2]

。人体内的低密度脂蛋白(LDL )被氧化是引起心血管病的一个重要原因[3]

。绿原酸能有效地保护人体LDL 中α2Tocopher 2ol,使其LDL 免受氧化

[4]。当人体摄入一定量含有酚羟基化合物的食物时,这些物质可降低或淬灭人体中自由基的产生。据统计在心脏病低发病率的人群中,发病率与绿原酸的摄入有一定联系,其部分抗病机制是绿原酸对人体LDL 中α2T ocopher ol 氧化的抑制作用[5]

。 本文在对金银花中绿原酸的抗菌、抗氧化活性等方面做一些探讨,为工业化生产该类物质提供一定的技术依据。

1　材料和方法

1.1　材料与仪器1.1.1　试验材料

河南产金银花,经干燥后破碎。

3

　收稿日期:2004211202

　33基金项目:天津市教委科研基金资助项目(20039902)

　33作者简介:张泽生(1956-),男,天津市人,教授,博士生导师;研究方向:食品营养、天然产物开发与研究.

E 2mail:zhangzesheng@hot m ail .com.

1.1.2　试验菌株

大肠埃希氏菌(Escherichia Coli,G-),枯草芽胞杆菌(B acillus subtilis,G+),金黄色葡萄球菌(S taphylo2 coccus aureus,G+),藤黄八叠球菌(M icroccus luteus (S chroeter)Cohn,G+)购自于湖北武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.1.3　培养基

固体肉汤培养基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉浸膏5.0,NaCl5.0,琼脂20.0,pH7.2,121℃灭菌20m in;半固体肉汤培养基(g/L):蛋白胨10.0,牛肉浸膏5.0, NaCl5.0,琼脂8.0,pH7.2,121℃灭菌20m in。

1.1.4　实验仪器

K DF22116康达多功能食品粉碎机(天津市达康电器公司),微量进样器(基因公司),OR I O N818型pH 计(美国),RE23000旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器),SHB2Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸), AB2042N分析天平(美国Mettler2Toledo Gr oup),Uv m i2 ni21240紫外可见分光光度计(日本岛津有限公司),高效液相色谱仪(美国Lab)。

1.1.5　主要试剂

CH

3

CH2OH、NaCl、FeCl3、K3Fe(CN)6、Na2HP O4、NaH2P O4、绿原酸标准品、2,22二苯基2α2苦基肼(DPPH)、抗坏血酸、三乙胺、三氯乙酸(均为分析纯),乙腈(色谱纯);庆大霉素(华北制药厂,生产批号: 20040218,80万单位/2mL),大孔树脂(南开大学化工厂)。

1.2　实验方法

1.2.1　绿原酸的基本提取工艺

金银花破碎颗粒→热回流浸提→浓缩→冷沉→离心→大孔树脂纯化→浓缩→冷藏保存备用。

1.2.2　紫外分光光度法对金银花中绿原酸含量的测

定

将绿原酸标准溶液配成浓度0.01mol/L,用紫外分光光度计于200～500n m扫描。选取绿原酸的最大吸收波长,测定不同浓度标准溶液的吸光度值,做出标准曲线,以计算金银花中绿原酸的含量。

1.2.3　对金银花中绿原酸的定性分析

本试验利用高效液相色谱法(HP LC)在相同色谱条件下,将标准溶液色谱图与样品色谱图进行对照,根据保留时间确定样品中的绿原酸。

1.2.4　绿原酸抑菌活性实验———生物检测法

抑菌试验方法:无菌操作。取10mL琼脂培养基于直径为9c m的无菌培养皿中,铺匀,待凝固后,放入两个牛津杯。取含有活菌的半固体培养基10mL,加到装有牛津杯的培养皿中,铺匀,待凝固后,拔出牛津杯,在其中一个杯孔中加入药液50μL,并设阴性对照和阳性对照,37℃培养24h观察结果,并测量抑菌环直径。抑菌环直径≥20mm为极敏,15～20mm为高敏,10～15mm为中敏,≤10mm为低敏[6]。

1.2.5　绿原酸抗氧化性

本实验利用还原法测定了金银花中绿原酸在体外清除2,22二苯基2α2苦基肼自由基(DPPH・)的能力,并与抗坏血酸进行了还原Fe3+能力的对比。

(1)绿原酸清除DPPH・活性测定[7]

取0.1mL的精制绿原酸样品溶液,加入2.9mL 0.05g/L的DPPH・乙醇溶液。混匀后在517n m处测定吸光度值,每1m in测量一次,直至读数稳定。

(2)绿原酸还原Fe3+能力的测定[7]

取2.5mL的不同样品溶液,加入2.5mL的磷酸盐缓冲液(0.2mol/L,pH=6.6)及2.5mL的10 0K3Fe(CN)6溶液,于50℃水浴反应20m in后急速冷却,加入2.5mL的100 0三氯乙酸溶液,取反应液5mL,加入5mL的H2O和0.10 0FeCl3溶液1mL,混合均匀,10m in后于700nm处测定其吸光度值,以水为空白,吸光度值越大表示还原能力越强。以上实验均以抗坏血酸作阳性对照。

2　结果与讨论

2.1　金银花中绿原酸的测定

通过对绿原酸标准溶液和在金银花中精制所得的绿原酸溶液用紫外分光光度计在200～500nm扫描,见图1。由图1可以看出,由大孔吸附树脂精制所得的绿原酸和相同浓度的绿原酸标准品的紫外光谱图比较,二者都是在324nm有一最大吸收峰,峰形和两峰峰高比例基本相同。最后选取最大吸收波长324n m,再分别测定不同浓度标准绿原酸溶液的吸光度值,以绿原酸标准品浓度为横坐标,以其吸光度值为纵坐标绘制标准曲线,如图2。

根据所绘的标准曲线,求得线性回归方程为Y= 57.497x+0.0482,且相关系数R2=0.9999,说明本方法在绿原酸的质量浓度为0.005～0.030g/L时具有良好的线性关系。

利用大孔吸附树脂对粗提液进行的纯化使得产品的纯度由原来的37.990 0提高到90.380 0,精制得率达900 0以上。

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