农杆菌介导法.
农杆菌介导法
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。 其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰丁 香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食 子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基 苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。 双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子， 而使T- DNA可以成功的转入； 而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区 的基因，达到转基因的目的。
1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 (tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP 1977年，Chilton et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。 1981年，Ooms et al.发现Ti质粒上有致瘤区(virulence region)，Vir区。
VirD
4.5
4
16,47,21,75
C/M?
T-DNA border endonuclease (VirD1 and VirD2); pilot protein? nuclear localization?(VirD2)
VirC
2.0
2
26,23
C?
processing of T-DNA(VirC1)
最先激活表达的是virA基因，它编码感受蛋白，位于细菌细胞膜的疏水区，可接 受环境中的信号分子。 在virA蛋白的激活下，virG基因表达，virG蛋白经磷酸化由非活性态变为活化状 态，进而激活vir区其他基因表达。 其中virD基因产物virD1蛋白是一种DNA松弛酶，它可使DNA从超螺旋型转变为 松弛型状态；而virD2蛋白则能切割已呈松弛态的T-DNA，2个边界产生缺口，使 单链T-DNA得以释放。 VirE基因所表达的virE2蛋白是单链T-DNA结合蛋白。可使T-DNA形成1个细长的 核酸蛋白复合物（T-复合体），以此保护T-DNA不被包内外的核酸酶降解。 T-复合体依次穿过根癌农杆菌和植物细胞膜及细胞壁。并进入植物细胞核，最终 整合进入植物核基因组。 T-DNA的转移机理比较复杂，依赖于T-DNA区和vir区共同参与，涉及多个基因表 达及一系列蛋白质和核酸的相互作用。
20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)
1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。
转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。
1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。
◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。
◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。
◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。
1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。
植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。
原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。
多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。
农杆菌介导法
实验九植物遗传转化——农杆菌介导法一、目的了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术二、原理根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。
下列因子与转化过程有关：1. Ti 质粒(tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。
T-DNA含有RB和LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。
不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。
置于该边界内的任何外源基因均可被转化。
LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。
LB（－链）5’GT TTACACCACAA TA TATCCTG CCA 3’RB（＋链）5’TGA CAGGA TA TA TTGGCGGGTAA AC 3’2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子转化所必需的基因有vir A、B、C、D、E、G。
其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA 结合蛋白，有2个NLS。
该操纵子的表达顺序如下：vir A和vir G组成型表达形成VirA和VirG蛋白→VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活→激活的VirG 诱导vir C、D、E、B、F、H表达。
3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chv A、chv B（农杆菌运动、附着）、chv D、chv E（编码单糖结合蛋白、趋化性）、psc A、att、cel（合成纤维素丝，附着）。
它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。
农杆菌介导法在玉米遗传转化中的应用
６ ９ ．６ ４ ８． ６
４ ５． ４
２ ５． ５
２６ ． ３
１ ０４０ １． ０ ９ ９４ ８． Ｏ １ Ｏｌ ５ ３．５ １ ０６ ４８ ．５ ９ ８８ ６． ５
５ ．２ Ｏ ．６ ２ ．７ ７ ．７
２５ ． ２
２５ ．６
６３ ． ２ ４７ ． ２
１ ９ ３ ４ ５
抗 除草 剂 的 转基 因 玉 米 已率 先 应 用 于 玉 米 的 商品 化 生产 。农 杆 菌 介 导 的 遗 传 转 化 由 于具 有 独 特 的优 点 ， 一直 受到
育种家、 分 子 生 物 学 家和 微 生物 学 家 的 重 视 。 介 绍 了农 杆 菌介 导 的 玉 米 遗 传 转 化 的技 术 要 点及 影 响 转 化 的 主 要 因
收 稿 日期 ： ２ ０ １ ３ － ０ ７ — １ ５
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素， 并 对 玉米 遗 传 转 化 技 术 发 展 现状 和 未 来 趋 势 做 了讨 论 。 关键词 ： 玉米； 农杆 菌； 遗传 转 化
２
３
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１
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２
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７
２
６
玉米作 为最 重要 的粮 食 作物 之一 ， 也是 现代 食 品工 业 、 医 药工 业 和 化学 工 业 的 重要 原 料 ， 它 的遗传 转 化 研 究一 直 受到 各 国科学 家 的重视 。到 目前 为止 ， 己建立 了多 种外 源 基 因导入 玉米 受体 细胞 的遗 传转 化 方法 。 由于农 杆 菌作 为 自然界 中存 在 的天然 基 因工程 载体 ， 具 有操 作简 便 、 费用 低廉 、 可插 入 外源 基 因片段 大 、 一 次 转化 能产 生较 大可 能 的单拷 贝基 因等 优点 ， 所 以农 杆菌 介 导转 化 单 子 叶植 物 尤其 是 重 要 粮食 作 物 的研 究 一 贯受 到世 界各 国科 研工 作者 的重 视 。玉米 作 为世 界第 三大 粮 食作 物 和 重要 的饲 料 作物 ， 农 杆 菌 介 导 的 遗 传
农杆菌介导法
农杆菌介导的高效水稻遗传转化体系的研究A Highly Efficient Agrobacterium - mediated Rice Transformation Method水稻是基因组研究的模式植物 ,近年来水稻基因组研究取得了很大进展 ,构建了遗传图谱和物理图谱 ,完成了籼稻和粳稻的全基因组草图测2 - 3序 ,以及第 1 号和第 4 号染色体的精细测4 - 5序 ,并对第 10 号染色体的结构进行了详细分析。
在此基础上 ,各实验室大规模地 ,系统地进行水稻功能基因研究 ,普遍采用的研究手段是基因标签技术。
基因标签技术包括 T - DNA 和转座子标签 ,创建大量的基因标签体是功能基因研究的材料平台。
而根癌农杆菌介导的水稻遗传转化是水稻基因标签技术中的重要步骤之一。
本研究完善了根癌农杆菌介导的水稻转化方法 ,以期为水稻功能基因研究提供丰富材料 , 为水稻重要农艺性状的改良开辟途径。
1材料以水稻品种日本晴(Oryza sativa L. ssp.japonica)为试验材料。
菌株类型为 EHA105 超毒力菌株 ,载体为增强子捕获载体 pFX- E24. 2 - 15R(见图 1) ,载体上带有 GUS报告基因、35 S的 CaMV 启动子序列和潮霉素选择标记基因(HYG) 。
农杆菌菌株为EHA105。
2方法2.1水稻愈伤组织的诱导诱导方法参照 HIEI7等。
将日本晴水稻种子去壳 ,用 75 %乙醇灭菌 5min ,再用2. 5 %的次氯酸钠灭菌处理不同时间(40min ,37 min ,30 min 和 25 min) ,以确定最佳灭菌时间 ,灭菌后用无菌水冲洗 6～8 次 ,于 MS 固体培养基上28 ℃避光培养 ,30 d 后 ,将愈伤组织进行继代培养 ,得到胚性愈伤组织。
2.2农杆菌转化愈伤组织用 AB 固体培养基+氯霉素 25 mg/L + 利福平 20 mg/L + AS 20 mg/L培养农杆菌 ,在20 ℃下培养5～6 d。
根癌农杆菌介导法原理
根癌农杆菌介导法原理引言根癌农杆菌介导法是一种常用的基因转化技术，广泛应用于植物遗传工程领域。
它利用植物根癌农杆菌接触感染时产生的植物激素和DNA导入技术，将外源基因导入植物细胞，实现对植物基因组的改造。
本文将全面、详细、完整地探讨根癌农杆菌介导法的原理、应用以及优缺点。
根癌农杆菌的特点1. 根癌农杆菌简介根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 是一种通过植物接触感染的土壤细菌，在植物遗传工程研究中具有重要的应用价值。
它能够将其自身的T-DNA（转座子DNA）片段导入植物细胞，并在植物细胞中稳定表达。
2. 根癌农杆菌的感染机制根癌农杆菌感染植物的过程包括以下几个步骤：1.识别和结合：根癌农杆菌通过识别植物伤口释放的酚类化合物，结合到植物细胞表面。
2.感染透入：根癌农杆菌产生的信号分子诱导植物细胞产生细胞壁降解酶，使其自身进入植物细胞。
3.T-DNA转移：根癌农杆菌通过特殊的转移螺旋（vir蛋白）将T-DNA从细菌自身转移到植物细胞中。
4.T-DNA整合：转移的T-DNA片段在植物细胞染色体上整合，并导致植物细胞的遗传改变。
根癌农杆菌介导法原理根癌农杆菌介导法利用根癌农杆菌的感染机制，将外源基因导入植物细胞，从而实现对植物基因组的改造。
1. 构建适合的转化载体在根癌农杆菌介导法中，首先需要构建适合的转化载体。
转化载体通常包括以下几个重要组成部分：•T-DNA：携带待转化的外源基因片段。
•选择标记基因：用于筛选转化成功的植物细胞。
•根癌农杆菌起始核酸序列（ori）：用于在根癌农杆菌中复制转化载体。
2. 根癌农杆菌感染植物将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，然后让根癌农杆菌感染植物组织。
通常可以通过以下步骤实现：•制备根癌农杆菌感染液：将构建好的转化载体导入根癌农杆菌中，培养至菌体达到一定浓度。
•植物组织处理：将待转化的植物组织浸泡在根癌农杆菌感染液中，利用真空处理或共振法促使菌体进入植物细胞。
植物组织培养：第十三章 植物遗传转化
• 接种时所用菌液浓度和侵染时间 是影响转基因植株再生的关键因素 之一。
• 共培养：接种菌体后的外植体培养 在诱导愈伤组织或不定芽固体培养基 上，在外植体细胞分裂、生长的同时， 农杆菌在外植体切口面也增殖生长， 两者共同培养的过程称为～。
• Horsch等(1985)首创叶盘法，用根 癌农杆菌感染烟草叶片外植体，获得 了转基因烟草。
（一）生物学特性与转 化原理
1.生物学特性
• 根癌农杆菌将Ti质粒的DNA片 段、发根农杆菌将Ri质粒的DNA 片段导入植物细胞的基因组中，导 致植物发生冠瘿瘤和毛状根。
• 根据携带不同Ti质粒的根癌农杆 菌诱导的冠瘿瘤所产生的冠瘿碱类 型，将根癌农杆菌分为章鱼碱型、 胭脂碱型和农杆碱型三种根癌农杆 菌。
一、农杆菌介导法
• Ackermann(1977)，Wullems等 (1981)，De Greve等(1982)和Spano 等(1982)首先在烟草和马铃薯中由Ri质 粒和Ti质粒转化的细胞再生出植株。
• Zambryski等(1983)和De Block等 (1984)以及Horsch等(1985)分别报道 了用切去癌基因的根癌农杆菌和发根 农杆菌进行遗传转化，获得了形态正 常的转基因植物。
第十三章 植物遗传转化
• 植物遗传转化（plant genetic transformation）：是指将外源基因 转移到植物体内并稳定地整合表达与 遗传的过程。
• 农杆菌介导法、基因枪法、植株原 位真空渗入法、电击法、聚已二醇法、 花粉管通道法、显微注射法、激光微 束法、超声波法、生殖细胞浸泡法、 脂质体法
（5） Vir区基因的活化
• 大多数双子叶植物受伤后，植物 细胞会分泌某些酚类化合物，这些 酚类化合物可诱导Vir区基因活化， 使农杆菌转化成为可能。
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术（Agrobacterium-mediated plant transformation）是一种常用的植物遗传转化技术。
该技术利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因
导入目标植物细胞，使其产生转基因植物。
农杆菌天然具有植物细胞转化的能力。
当农杆菌感染植物时，其携带的质粒（T质粒）能够在植物细胞中插入外源基因，并
将其转化为转座子形式，随后将其整合入宿主植物基因组中。
转座子通常包含目标基因、转座酶和调控序列，它们共同确保外源基因正确表达。
T质粒还携带有自身所需的发育激素和植
物生长调节物质，以维持转化后细胞的生存和分裂。
农杆菌介导的植物转基因技术具有许多优点。
首先，它可以用于许多不同植物物种的基因转化。
其次，该技术可以实现整株或局部的基因转化，包括细胞、组织、器官或整个植株。
此外，农杆菌介导的转基因技术可实现稳定遗传转化，外源基因可以遗传到植物后代中。
最后，该技术对植物基因组中的特定位点插入外源基因，使得外源基因可以与内源基因进行正常结合。
随着转基因技术的不断发展，农杆菌介导的植物转基因技术仍然广泛应用于研究和农业生产领域。
它为植物功能研究、抗病虫害、提高产量和改善品质等方面提供了有效手段。
然而，农杆菌介导的转基因技术也面临着一些挑战，如转化效率低、插入位点随机性以及响应植物抗性等问题。
因此，研究人员不断探索新的转基因技术和改进农杆菌介导的植物转基因技术的方法，以改善转基因植物的性状和应用。
农杆菌介导植物转基因技术发展的历史和前景
农杆菌介导植物转基因技术发展的历史和前景植物转基因技术是现代农业中的一个重要组成部分，它促进着植物产量的提高，同时也带来了一系列的争议。
农杆菌介导植物转基因技术是其中一种常用的方法，本文将着重介绍这种方法的发展历程和前景。
一、农杆菌介导植物转基因技术的发展历程农杆菌介导植物转基因技术是一种利用农杆菌转化植物的基因工程技术，也叫做Agrobacterium tumefaciens介导的转化技术。
这种技术的发展始于20世纪70年代末期，当时Mayer和策尔恩等人首次报道了农杆菌介导的植物转化，他们使用农杆菌感染了土豆诱导物，并成功地将细菌基因转移到土豆细胞中。
这项开创性的研究为农杆菌介导植物转基因技术的发展奠定了基础。
随后，科学家们对农杆菌介导的转化过程进行了详细研究，并逐步完善了这种技术。
1994年，Baulcombe和科尔顿等人将一种外源的DNA序列和抗生素酶基因转移到了拟南芥细胞中，并成功地将这些转基因的植物培养出来。
这一研究开创了利用农杆菌介导植物转基因技术改善环境和农业的新途径。
二、农杆菌介导植物转基因技术的工作原理农杆菌是一种土壤细菌，它可以侵入植物细胞，通过水平基因转移的方式将DNA序列转移到受体植物细胞的基因组中，从而实现转化。
这种水平基因转移的机制是由农杆菌的Ti质粒（Tumor-inducing plasmid）决定的。
农杆菌利用Ti质粒的T-DNA片段将外源DNA转移到植物细胞中，并在转化区域形成根瘤或肿瘤。
农杆菌介导植物转基因技术的具体操作过程如下，首先将外源基因插入Ti质粒的T-DNA片段中，构建成重组质粒。
然后将这些质粒导入农杆菌中，使得农杆菌携带了外源基因。
接着，将这些农杆菌感染到植物的受体细胞中，使其产生根瘤或肿瘤。
最后，通过PCR等分子生物学技术检测转基因植物中外源基因的表达和遗传稳定性，并选育出稳定性较高的转基因植物品系。
三、农杆菌介导植物转基因技术的前景利用农杆菌介导植物转基因技术，可以将外源基因转移到植物细胞中，从而实现植物的转化和改良。
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究
农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究植物遗传转化技术是一项广泛应用于作物改良和生物制药领域的重要技术手段。
其中农杆菌介导的植物遗传转化技术是目前最为常用和成熟的一种转化方法。
本文将对农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进行介绍和探讨。
一、农杆菌介导的植物遗传转化技术原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤杆菌，是一种天然的植物病原菌。
它通过菌体上存在的Ti质粒（tumor-inducing plasmid）和T-DNA（transfer DNA）片段，将外源DNA片段导入植物细胞并整合到植物基因组中，导致细胞核内出现转化的植物细胞。
因此，农杆菌介导的植物遗传转化技术也被称为农杆菌转化。
农杆菌介导的植物遗传转化技术包括以下几个步骤：农杆菌感染植物细胞、T-DNA整合进入植物细胞、T-DNA片段内的外源DNA导入植物细胞基因组、以及转化细胞的筛选和检测等。
其中，农杆菌感染植物细胞是整个转化过程的关键步骤，需要通过构建合适的载体和适当的农杆菌菌株，使其能够有效地感染到目标植物细胞。
二、农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进展农杆菌介导的植物遗传转化技术已经被广泛应用于许多作物品种的改良和基因功能研究中。
例如，利用农杆菌转化技术可将外源基因导入烟草、玉米、水稻、小麦、大豆等许多重要的作物中，实现对它们特性的改良。
在农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究和应用中，也出现了许多问题。
其中，影响转化效率的因素包括转化载体、农杆菌菌株、植物品种、转化条件等。
此外，还存在着难以破解的难题，例如植物细胞壁难以透过、转化后细胞的不稳定性、外源基因的稳定性等。
为了提高转化效率和成功率，许多研究者着眼于改进农杆菌转化系统，包括构建新的载体、筛选适合的农杆菌菌株、研究植物细胞壁和农杆菌感染机制等。
一些新型转化技术，例如粒子轰击法、激光微加工技术和等离子膜处理技术等，也被尝试用于植物遗传转化中，但它们还需要进一步的研究和优化。
农杆菌介导的植物转基因技术试验指导
农杆菌介导的植物转基因技术一、实验目的1 了解低温离心机、恒温振荡培养箱、超净工作台等仪器的使用。
2学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理；掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术的操作流程。
二、实验原理农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。
农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。
人们将目的基因插入到经过改造的丁-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
实验一培养基配制一、仪器和试剂1、仪器：高压灭菌锅，超净工作台2、药品：Beef extract （牛肉浸膏）5g/L，Yeast extract （酵母提取物）1g/L， Peptone （蛋白胨）5g/L，Sucrose （蔗糖）5g/L，100ml，Agar （琼脂）100ml， MS粉，有机溶液，肌醇，Fe盐，NAA （萘乙酸），6-BA（6-苄氨基腺嘌吟），卡那霉素（kan），利福平（"「，链霉素（str）。
二、实验方法第一组配制YEB固体培养基1、配制250mlYEB固体培养基：先称取Beef extract （牛肉浸膏）；Peptone （蛋白胨）；Yeast extract （酵母提取物）；Sucrose （蔗糖）；1g ；琼脂粉；将上述药品置于250ml三角瓶中，用量筒称取200ml蒸馏水将其溶解混匀，然后再定容至250ml,用NaOH调pH=。
2、灭菌：将盛有250ml培养基的三角瓶封口，在三角瓶表面写清培养基名称，用高压灭菌锅进行灭菌。
3、抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到50-60℃时（手可触摸）加入已经过滤好的抗生素（100ug/ml kan+50Dg/ml Str+50ug/ml rif）,以免温度过高导致抗生素失效。
农杆菌介导的针刺法将双价抗虫基因导入水稻
种子胚 芽生长点 ， 对存 活成 苗的 １ ０株 ９ ３ １ １ 、 ５株 南粳 ４ ５和 １ 株 １ １ ０ １ ８ ３进行 常规 Ｐ Ｃ Ｒ检 测 ， 阳性株分 别为 ９株 、 ３株 和 １
株， 混合计算 ， 阳性率为 ８ １ ％。去除南粳 ４ ５发 芽种子的种根和幼 芽后 ， 对裸 露的胚 芽生长点进行针刺接种 ， ９株存 活。经对 成苗的 Ｐ Ｃ Ｒ检 测 ， ４株含 有 ２个外 源基 因， 各 有 ２株只含有 １个基 因（ ｓ ｂ ｋ或 ｓ ｃ ｋ ） 。与传 统的农杆 菌介 导法相比 ， 本研 究的方
ｉ ｎ ｔ ｏ Ａ ｇ ｒ ｏ ｂ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｕ ｍ Ｅ ＨＡ １ ０ ５ ， ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｅ ｄ ａ ｐ ｉ ｃ ａ ｌ ｍｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｅ ｍ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｒ ｅ ｅ ｉ ｒ ｃ ｅ ｖ ａ ｒ ｉ ｅ ｔ ｉ ｅ ｓ（ ｉ ｎ ｄ ｉ ｃ ａ ｒ ｉ ｃ ｅ ９ ３ ｌ １ ， ｊ ａ ｐ ｏ ｎ ｉ ｃ ａ ｒ ｉ ｃ ｅ Ｎ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ ４ ５ ａ ｎ ｄ
江西农业学报
２ ０ １ ５ ， ２ ７ （ ８ ） ： ６ ～ ９
(完整版)农杆菌介导法
Ti质粒
Ti质粒是根癌农杆菌 细胞核外存在的一种 环状双链DNA分子， 长度约200kb，平均 周长54.1－75 .4 um， 分子质量为（90－ 150）×106 Da。在温 度低于30℃的 条件下， Ti质粒可稳定地存在 于根癌农杆菌细胞内。
的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类 胭脂碱(nopaline)类 农杆碱（agropine） 类。
Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应 基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达， 它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分 解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源 和碳源。
子的刺激，Ti质粒vir区毒性
基因被激活和表达。
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。 其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰 丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没 食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟 基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。
脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中TDNA的左右两侧是一段24bp 的重复序列,构成T-DNA的边 界序列(border sequence), 分别称为左边界(left border,LB)和右边界(right border,RB).在某些章鱼碱型 根癌农根癌农杆菌Ti质粒中TDNA是以两个分开的独立片 段形式存在，即T-DNA左边 区段和T-DNA右边区段。研 究表明，插入在T-DNA边界 序列之间的任何DNA都可被 转到植物染色体中。因此Ti质 粒可用做外源目的基因的载 体。
农杆菌介导转化法
农杆菌转化法基本操作与理论
2021/3/27
CHENLI
2
二、原理
农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶 植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤 的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内 表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化 细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增 生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质 粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可 将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植 物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以 通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感 染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组 织培养技术，得到转基因植物。
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谢谢观看！
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完
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三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多 数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组 质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分 子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学 几种方法 进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体 进行个体生物学水平鉴定。
1农杆菌介导转化法081一简介农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位并诱导产生冠痪瘤或发状根
五种常用的植物转基因技术
此外,基因枪法还存在转化过程对细胞有损害,转化率低,
嵌合体多,可重复性差及设备昂贵等缺点...
1.3超声波介导法
作为一种新创建的物理学基因转化方法,超声波介导
法已被用于真核生物的基因转化研究和人类基因治疗领
域.在农作物基因转化研究中,超声波介导法已成功
.
30(3):186～189RainFedCrops''……
文章编号:1003—4803(2010)03—0186—04
五种常用的植物转基因技术
汪由,吴禹,王岩,李兆渡,王光霞
(1.辽宁省农业科学院创新中心,辽宁沈阳110161;2.沈阳市东陵区白塔街道办事处,辽宁沈阳110167)
摘要:从原理,基本步骤和优缺点等几个方面对农杆茵介导法,基因枪法,超声波介导法,子房注射法和花粉管
第3期汗由等:五种常用的植物转基因技术l87
较大且插入片段明显及实验费用低等优点,因此,农杆菌
介导法是目前应用最广泛的一种植物转基因方法.但
是,农杆菌介导法也存在一些问题.首先,在自然条件下,
农杆菌只侵染双子叶植物.对于单子叶植物,虽然可以采
用人工添加酚类物质的方法,诱导农杆菌完成侵染过程,
但是单子叶植物的组织培养有一定的难度.目前,只发现
条件影响;由于后代群体规模较大,筛选过程丁作量较
大..
2.2花粉管通道法
2O世纪70年代末期,在DNA片段杂交假设理论和对
植物开花受精过程的解剖学及细胞学特征研究的基础上,
周光宇等推测外源DNA可以通过花粉管经过的珠心通道
进入受精胚囊,转化进入精卵融合细胞,早期合子及早期
胚细胞.随后,周光宇等创建花粉管通道技术并通过该技
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virＥ virＤ virC virG virＢ virA
植物细胞受伤后，细胞壁破 裂，分泌物中含有高浓度的 创伤诱导分子。它们是一些 酚类化合物，如乙酰丁酮 （acetosyringone，AS） 和α -羟基酰丁香酮（α hydroxacetosyringone， OH-AS）。 根癌农杆菌对这一类物质具 有趋化性，在植物细胞表面 附着后，受这些创伤诱导分 子的刺激，Ti质粒vir区毒性 基因被激活和表达。
Story
冠瘿瘤病：双子叶植物经常发生，因肿瘤着生地面在近地面的根茎交界处，形 似帽状而得名。 1907年， Smith & Townsent 农杆菌诱发冠瘿瘤病。 1947年， Braun et al. 证实俩者的关系，但发现有的菌株不
致病。提出了假说：tumour-inducing principle,TIP.肿瘤
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。 其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰 丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、 没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对 羟基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作 用。 双子叶植物在在农杆菌侵染时可以形成大量的信号因子， 而使T- DNA可以成功的转入； 而单子叶植物需要加入外源酚类物质，才能激活Vir区 的基因，达到转基因的目的。
长度：160-250 kb 6大功能区： 1)致瘤区，这个区主要合成植物 生长素和细胞分裂素； 2)冠瘿碱合成区； 3)冠瘿碱分解区； 4)Ti质粒接合转移区(tra)； 5)毒性区（Vir）； 6)DNA复制区（Rep）。
T-DNA
在致瘤区、冠瘿碱合成区的两侧 存在着一个24 bp直接重复序列， 由这三部分所构成的DNA区域叫 做T-DNA。
农杆菌介导转化法
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，
它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤 部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。
农杆菌 感染柳树 产生 冠瘿瘤
原理： 根癌农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri 质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口
进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们
将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的
感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过 细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。 农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来， 农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也
得到了广泛应用。
诱导因子 。 60’s , 肿瘤组织中含高浓度的氨基酸（octopine , nopaline）
总称冠瘿碱（opine) 。 Petit et al.证实肿瘤组织
合成的冠瘿碱取决于菌株，而且菌株能专一地利用 冠瘿碱作为菌株生存的唯一的碳源和氮源。(证实了TIP)
1974年，Zaenen et al, Schell, Van Larebeke et al. 从致瘤农杆菌中分离出一类巨大的质粒 (tumor inducing plasmid)，称为Ti质粒。 Ti=TIP
Vir 区（ Vir-region ）：即毒性区。其长度约为 35kb。 控制根癌农杆菌附着于植物细胞和 Ti 质粒进入细胞有 关部位，与感染后冠瘿形成有关。 Vir区位于T-DNA区左侧，包含义个毒性遗传点 （virA、virＢ、virC、 virＤ、virＥ和virG）。 vir基因控制着Ｔ－ＤＮＡ的转移。
冠瘿碱合成基因在宿主植物体 内合并分泌出来 , 被 Ti质粒上的 冠瘿碱代谢基因分解成碳源和 氮源，供根癌农杆菌生长所须。
脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中 T-DNA的左右两侧是一段 24bp的重复序列,构成TDNA的左边界和右边界。 在某些章鱼碱型根癌农根癌 农杆菌Ti质粒中T-DNA是以 两个分开的独立片段形式存 在，即T-DNA左边区段和TDNA右边区段。 插入在T-DNA边界序列之间 的任何DNA都可被转到植物 染色体中。因此Ti质粒可用 做外源目的基因的载体。
致瘤区+冠瘿碱+左右边界=TDNA
插入植物染色体中的Ti质粒片 段只有T-DNA。
T-DNA 区域中的这些基因只 有在T-DNA插入到植物基因组 后才能激活表达.
T-DNA ：
Tms1 、 Tms2 、 Tmr 这 3 个基
因表达植物生长素和细胞分裂 素, 可调节植物细胞的生长和发育 , 它们的过量表达刺激植物细胞 大量快速增长而形成冠瘿。
1) Ti质粒的结构
来自于不同野生型根癌农杆菌的Ti质粒可根据其产生 的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类 胭脂碱(nopaline)类 农杆碱（agropine） 类。
Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应 基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达， 它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分 解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源 和碳源。
1977年，Chilபைடு நூலகம்on et al.分子杂交技术证实肿瘤细胞中存 在外源的DNA ,与Ti质粒的DNA有同源性，是整 合到了植物染色体的农杆菌质粒DNA片段， T- DNA (transferred DNA),其内有致瘤和冠瘿 碱合成酶等基因。 1981年，Ooms et al.发现Ti质粒上有致瘤区(virulence region)，Vir区。
Ti质粒是根癌农杆菌 细胞核外存在的一种 环状双链DNA分子， 长度约200kb，平均 周长54.1－75 .4 um， 分子质量为（90－ 150）×106 Da。在 温度低与30℃的条件 下，Ti质粒可稳定地 存在于根癌农杆菌细 胞内。
Ti质粒除上述上述诱导受侵染的植物组织产生冠瘿瘤外， 还具有以下几种重要功能： 1、赋予根癌农杆菌附着于植物细胞的能力； 2、赋予根癌农杆菌分解代谢冠瘿碱的能力； 3、根癌农杆菌的寄主植物范围； 4、决定所诱导的冠瘿形态和冠瘿碱的成分； 5、参与寄主细胞合成植物激素吲哚乙酸和一些细胞分裂 素的代谢活。