第二章2电压钳制和膜片钳制技术
电压钳制和膜片钳制技术讲解
5 膜电流（membrane current）
电位的变化引起膜电容的充电或放电， 而电流的变化则表现在膜电阻上的电流流 动。Ic只在膜电位发生变化的一瞬间出现， 若将膜电位固定在一定水平，记录到的仅 为Ii（Ir），这是电压钳制技术的电学基 础之一。
(二) 细胞膜的时间常数（time constant）
一、细胞膜的生物物理特性
(Biophysical properties of cell membrane)
细胞膜上以脂质双分子层为支架，镶嵌着不同 特性的蛋白质。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的 极化状态及其形成过程中等都是细胞膜电缆性质 (cable properties)的反映。(轴浆电阻与膜电阻、 膜电容的组合，使电流对膜电位的影响起着依距离而 衰减以及在时间上的延缓作用――神经的“电缆”性 质)。细胞膜的电缆特性从它的等效电路及其时间常 数和空间常数得到证实。
第二节 电压钳制技术
Voltage clamp technique
利用微电极技术，虽然记录到细胞内的电 变化过程，但不能阐明这种变化的原因。要阐 明跨膜电变化机制，必须应用电压钳制技术。 这 一 技 术 首 先 是 由 Cole 及 其 同 事 设 计 ， 在 经 Hodgkin等人加以改进，用于神经电生理研究， 弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。
即细胞膜本身具有的膜电阻。细胞膜 由双层脂质构成，厚度很薄，但具有很高 的电阻，即绝缘性。膜电阻表示离子通过 膜的有限能力。 膜电阻反映了离子是否 容易通透膜的情况。膜电阻（Rm）的大小 反映了膜结构电学方面的差异。
2.横向电阻（redial resistance）
膜电位、膜电流和膜电阻的关系遵循欧姆定律： Em = Im . Rm
膜片钳技术的基本原理
膜片钳技术的基本原理膜片钳技术的基本原理膜片钳技术运用微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以千兆欧姆[gigaohm seal,1010欧姆（GΩ）]以上的阻抗使之对接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（膜片）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA 级）进行检测记录。
膜片钳技术的原理及应用（综述）Intro：细胞是构成生物体的基本单位。
细胞内和细胞之间的信号传导的重要途径是通过镶嵌在细胞膜上的离子通道蛋白进行的。
1976年，德国的两位细胞生物学家埃尔温. 内尔（Erwin Neher）和贝尔特. 萨克曼（Bert Sakmann）建立了一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一或多数离子通道分子活动的技术，成为膜片钳技术（Patch Clamp）。
这一技术使对细胞电活动的研究精度提高到1pA 的电流分辨率，1μm的空间分辨率和10μs的时间分辨率水平，是细胞和分子水平的生理学研究领域的一次革命性突破。
它与基因克隆技术（Gene Cloning）并驾齐驱，推动了生命科学研究的迅速发展。
为此，1991年的诺贝尔医学与生理学奖授予了这两位学者，以表彰他们的突出贡献。
这一能精确描述细胞通道特征的实验方法在问世后的短短十几年时间里，已经在生物学研究领域显示出了非常重要的意义和广阔的应用前景。
一. 膜片钳技术的基本原理膜片钳技术运用微玻管电极（膜片电极或膜片吸管）接触细胞膜，以千兆欧姆[gigaohm seal,1010欧姆（GΩ）]以上的阻抗使之对接，使与电极尖开口处相接的细胞膜小片区域（膜片）与其周围在电学上分隔，在此基础上固定电位，对此膜片上的离子通道的离子电流（pA 级）进行检测记录。
（如图1）图1 膜片钳技术原理图Rs是与膜片阻扰相串联的局部串联电阻（或称入路阻扰），Rseal 是封接阻抗。
Rs通常为1-5MΩ，若Rseal高达10GΩ以上时成为Ip/I=Rseal/（Rs+Rseal）-1，此Ip可作为在I-V转换器（点线）内的高阻扰反馈电阻（Rf）的电压下降而被检出。
膜片钳技术
测试题：
1. 膜片钳的主要记录方式有哪几种，各
有何优缺点? 2. 什么叫整流，产生整流的原因是什么？
膜的被动反应
离子通道开放 膜的主动反应
外向整流
随膜电位的去极化，I-V曲线明显向Y轴（电流轴）靠 近。如IK电流。
内向整流
随膜电位的去极化，I-V曲线明显向X轴（电压轴）靠 近。如烟碱电流。
去极化方向
去极化方向
IK电流的外向整流
烟碱电流的内向整流
尾电流（Tail current）
指通道在激活因素结束时的关闭过程中，所记录
6. 基本概念及参数设置
输入漏电流（Input leakage current）
理论上讲，不施加外部命令时，通过放大 器探头的电流应该为0，如果由于放大器本 身的原因产生了电流，这就是漏电流。由于 放大器控制电流漂移的质量很高，一般漏电 流都很小。
封接电流（Seal current）
由于封接质量不高（没有形成良好的高 阻封接），从封接处产生的电流。成为噪 声。
第三部分
全细胞记录结果举例
+80mV
+40mV
0mV
-40mV
-80mV 200ms
Iso Hypo
Current Density (pA/pF)
-40
60
30
0 -80 0 -30 40 80
Voltage (mV)
-60
Iso 4 Iso 2 Hypo Hypo
Current (nA)
0
倒 置 相 差 显 微 镜
EPC-7膜片钳放大器(德国)
4. 膜片钳的记录方式及基本操作
细胞吸附式（Cell-attached
膜片钳 电压钳
电压钳技术原理图片
电压钳技术原理
•电压钳（voltage
clamp）技术是通过插入细胞内 的一根微电极向胞内补充电流，补充的电流量正好 等于跨膜流出的反向离子流，这样即使膜通透性发 生改变时，也能控制膜电位数值不变。经过离子通 道的离子流与经微电极施加的电流方向相反，数量 相等。因之可以定量测定细胞兴奋时的离子电流。 膜通透性的改变是迅速的，但如使用一个高频响应 的放大器，可以连续、快速、自动地调整注入电流 ，达到保持膜电位恒定的目的。它可以测量细胞的 膜电位、膜电流和突触后电位。
膜片钳技术的建立
• 膜片钳技术的建立，对生物学科学特别是神经 科学是一资有重大意义的变革。这是一种以记 录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一 的（或多个的离子通道分子活动的技术。此技 术的出现自然将细胞水平和分子水平的生理学 研究联系在一起，同时又将神经科学的不同分 野必然地融汇在一起，改变了既往各个分野互 不联系、互不渗透，阻碍人们全面认识能力的 弊端。
膜片钳技术的定义
• 1用以记录通过单个膜通道的电流的装置 • 2研究离子通道的一种电生理技术，是施 加负压将玻璃微电极的尖端(开口直径约 1 μ m)与细胞膜紧密接触，形成高阻抗 封接，可以精确记录离子通道微小电流 。能制备成细胞贴附、内面朝外和外面 朝内三种单通道记录方式，以及另一种 记录多通道的全细记录通过离子通道的离子 电流来反映细胞膜单一的或多个的离子 通道分子活动的技术。它和基因克隆技 术（gene cloning）并架齐驱，给生命 科学研究带来了巨大的前进动力。
•
技术原理
• 膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3 个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通 过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜 的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实 上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片 膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个 极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量 此电流强度，就代表单一离子通道电流
医学生理学期末重点笔记---第二章----细胞的基本功能
第二章细胞的基本功能第一节细胞膜的跨膜物质转运功能一、膜的化学组成和分子结构<一>磷脂的分子组成以液态的脂质双分子层为基架,具有流动性<二>细胞膜蛋白质镶嵌或贯穿于脂质双分子层分类：表面蛋白、整合蛋白<三>细胞膜糖类多为短糖链,以共价键的形式与膜脂质或蛋白质结合,形成糖脂或糖蛋白.二、细胞膜的跨膜物质转运功能被动转运〔passive transport〕：指物质顺浓度或电位梯度的转运过程.不消耗细胞提供的能量.主动转运〔active transport〕：指物质逆浓度或电位梯度的转运过程.需消耗细胞提供的能量.1.单纯扩散simple diffusion脂溶性物质由膜的高浓度一侧向低浓度一侧移动的过程.影响因素：浓度差通透性特点:①不依靠特殊膜蛋白质的"帮助"②不需另外消耗能量、顺浓度差转运物质：O2、CO2、N2、<NH3>2CO、乙醇、类固醇类激素等少数几种.2.易化扩散facilitated diffusion〔1〕概念:一些非脂溶性或脂溶性非常小的物质,在膜蛋白质的"帮助"下,顺电化学梯度进行跨膜转运的过程分类：原发性主动转运〔简称：泵转运〕、继发性主动转运〔简称：联合转运〕〔1〕原发性主动转运primary active transport概念：指物质在细胞膜"生物泵"的帮助下逆浓度梯度或电位梯度的转运过程.Na+-K+泵又称Na+-K+-ATP酶,简称钠泵.机制：当膜内[Na+]↑/胞外[K+]↑,钠泵激活↓ATP酶〔钠泵〕ATP------------------→ADP + 能量↓2K+泵至细胞内;3Na+泵至细胞外↓维持[Na+]膜外高、[K+]膜内高的不均匀分布状态生理意义•胞内低Na,维持细胞体积•胞内高K,酶活性----新陈代谢正常进行•势能储备钠、钾的易化扩散继发性主动转运,联合转运•生电效能〔2〕继发性主动转运secondary active transport概念：间接利用ATP能量的主动转运过程.分类：①同向转运：Na+-葡萄糖同向转运体,Na+-氨基酸同向转运体〔小肠粘膜上皮细胞,肾小管上皮细胞〕②逆向转运：钠钙交换体〔心肌细胞〕4. 入胞和胞吐①离子通道耦联受体介导的跨膜信号转导②G-蛋白耦联受体介导的跨膜信号转导③酶耦联受体介导的跨膜信号转导第三节细胞的生物电现象细胞的生物电现象〔跨膜电位〕：静息电位、动作电位一、静息电位resting potential、RP1.概念：静息时,细胞膜两侧存在的稳定的、外正内负的电位差.2.与RP相关的概念：••➢极化：RP存在时,细胞膜内负外正的状态称为极化.➢去极化:膜内外电位差向小于RP值的方向变化的过程.➢超极化:膜内外电位差向大于RP值的方向变化的过程.➢复极化:去极化后再向极化状态恢复的过程.➢反极化:细胞膜由内负外正的极化状态变为内正外负的极性反转过程.3.机制原理：带电离子跨膜转运条件：①静息状态下细胞膜内、外离子分布不均匀②静息状态下细胞膜对离子的通透性具有选择性,安静时,细胞膜主要对K+通透机制：K＋顺浓度差向膜外扩散；A-不能向膜外扩散↓[K+]内↓、[A-]内↑→膜内电位↓<负电场>• [K+]外↑→膜外电位↑<正电场>↓膜外为正、膜内为负的极化状态↓当扩散动力与阻力达到动态平衡时=RP结论: RP是K+的平衡电位影响因素：•细胞膜两侧离子的浓度差•细胞膜对离子的通透性•钠泵的活动二、动作电位action potential、AP1.概念：细胞膜受到有效刺激时,在RP的基础上发生的一个快速的、可逆的、可远距离传播的电位变化.2.动作电位变化过程3.特征：①具有"全或无"的现象：即同一细胞上的AP大小不随刺激强度和传导距离而改变的现象.②是非衰减式传导的电位.③动作电位之间不融和4.动作电位的意义：AP的产生是细胞兴奋的标志,即AP=兴奋5.与AP有关的概念➢兴奋性：活组织或细胞对刺激发生反应的能力.➢刺激：能引起细胞或组织发生反应的所有内、外环境的变化.➢反应：细胞或组织对刺激产生的应答表现.有两种形式：兴奋：组织受刺激后由静息→活动或由活动弱→强的过程.抑制：组织受刺激后由活动→静息或由活动强→弱的过程.●可兴奋组织：神经、肌肉和腺体●兴奋性的指标————阈值〔threshold>阈强度〔阈值〕：刚能引起细胞或组织产生反应的最小刺激强度.阈值与兴奋性的高低呈反变关系.●刺激强度的表示方法1、阈刺激:刚好引起组织产生反应的最小刺激.〔此刺激的强度即称为阈强度〕2、阈上刺激:3、阈下刺激:6.形成机制原理：带电离子跨膜转运条件：⑴. 细胞膜两侧离子的浓度差——电化学驱动力•等于膜电位和该离子平衡电位之差•对Na+的驱动力：E m -E Na =-70-60 = -130mv•对K+的驱动力：E m -E k = -70+90 = 20mv⑵.细胞膜通透性的变化——膜在受到阈刺激而兴奋时,对Na+的通透性增加,继而对K+通透性增加.结论：①AP的上升支由Na＋内流形成,下降支是K＋外流形成的,后电位是Na＋－K＋泵活动引起的.②AP去极相末=Na＋的平衡电位.7.相关实验和实验结论实验1：细胞膜通透性的变化——电压钳〔voltage clamp〕技术实验结论1•内向电流,形成AP上升支〔去极化〕；外向电流,形成AP下降支〔复极化〕.内向电流是Na+电流；外向电流是K+电流•时间依赖性——先产生内向电流〔Na+通透性↑〕,继而产生外向电流〔Na+通透性↓,K+通透性↑〕.实验结论2⑴细胞膜离子通透性的电压依赖性：如果刺激强度达到阈值,可使细胞膜去极化达到阈电位,则会产生膜去极化和钠电导之间存在正反馈〔图1〕,即再生性循环<regenerative cycle>,进一步去极化产生AP〔图2绿线示〕；〔如果刺激强度小于阈值,细胞膜去极化幅度低,没有达到阈电位,则不会产生这种再生性循环,无法产生AP〔图2黑和红线示〕图1 图2阈电位<threshold potential>：能触发动作电位的膜电位临界值因此动作电位的引起过程：阈刺激↓Na+内流,细胞膜去极化↓达阈电位↓Na+通道大量开放,Na+大量内流↓AP⑵.细胞膜离子通透性的时间依赖性：先Na+通透性↑,继而Na+通透性↓,K+通透性↑实验2：细胞膜通透性〔膜电导〕变化的实质——膜片钳技术<patch clamp technique>概念：指已兴奋与邻近未兴奋的心肌细胞之间形成电位差,出现电荷移动,称为局部电流电流方向：作用：使未兴奋部细胞膜去极化达到阈电位,产生AP.这样的过程在膜表面连续进行下去,就表现为兴奋在整个细胞的传导.有髓鞘N纤维AP的传导——跳跃式三、局部电位:local potential概念：阈下刺激引起的低于阈电位的去极化称局部电位.特点：①不具有"全或无"现象.其幅值可随刺激强度的增加而增大；②衰减式传导；③具有总和效应：时间性和空间性总和第四节肌细胞的收缩功能<一>收缩形式1.单收缩和强直收缩<1>.单收缩：肌肉受到一次刺激,引起一次收缩和舒张的过程称为单收缩.<2>.复合收缩①不完全强直收缩:新刺激落在前一次收缩的舒张期内②完全强直收缩:新刺激落在前一次收缩的缩短期内2.等长收缩与等张收缩• 等长收缩:肌肉收缩时,只有张力增加而长度不变的收缩,称为等长收缩.当负荷等于或大于肌张力时,出现等长收缩等张收缩:肌肉收缩时,只有长度缩短而张力不变的收缩,称为等张收缩.当负荷小于肌张力时,出现等张收缩<二>影响收缩因素外在因素：前负荷和后负荷内在因素：肌肉的收缩能力1.前负荷或肌肉初长度：前负荷<preload>：肌肉在收缩之前所承载的负荷肌肉初长度<initial length>：前负荷使肌肉被拉长到某一长度可以用肌肉初长度表示前负荷的大小在一定范围内,随着前负荷↑,粗细肌丝重叠↑,肌缩速度、幅度和张力↑.反之亦然2.后负荷<after load>：肌肉收缩时遇到的负荷和阻力后负荷过大,虽肌缩张力↑,但肌缩速度、幅度↓,不利作功；后负荷过小,虽肌缩速度、幅度↑,但肌缩张力↓,也不利作功.3.肌肉收缩能力：指与负荷无关、决定肌肉收缩效应的内在特性.肌缩能力↑→肌缩速度、幅度和张力↑肌缩能力↓→肌缩速度、幅度和张力↓第二章小结练习• 1. Na+-K+-ATP酶每分解1分子A TP可将__个Na+移出胞外,同时将__个K+移入胞内.• 2. 在肌肉兴奋-收缩偶联过程中,起关键作用的物质是____.• 3. 细胞内外正常Na+、K+浓度的形成和维持是由于_______的作用• 4. 有机磷农药中毒时,可使〔〕A、乙酰胆碱释放增加B、乙酰胆碱释放减少C、胆碱酯酶活性增加D、胆碱酯酶活性降低E、骨骼肌终板处的乙酰胆碱受体功能障碍案例Case 1.A 43-year-old man presents to the physician’s clinic with plaints of epigastric pai n. After a thorough workup, the patient is diagnosed with peptic ulcer disease. He is started on a medication that inhibits the "proton pump" of the stomach.QUESTIONS：•What is the "proton pump" that is referred to above?•What type of cell membrane transport would this medication be blocking?•What are four other types of transport across a cell membrane?ANSWERS TO CASE 1: MEMBRANE PHYSIOLOGY•◆Proton pump: H+-K+-ATPase <adenosine triphosphatase> pump.•◆Type of cell membrane transport: Primary active transport.•◆Other types of transport: Simple diffusion, facilitated diffusion, secondary active transport <cotransport and countertransport [exchange]>, endocytosis and exocytosis.Case 2.某男性患者,16岁,近来运动后感到极度无力,尤其是在进食大量淀粉类食物后加重.门诊检查血清钾正常〔4.5 mmol／L〕,但运动后血清钾明显降低〔2.2 mmol／L〕,经补钾治疗后症状缓解.1.为什么低血钾会引起极度肌肉无力？2.为什么在进食大量淀粉后症状加重？3.血钾增高时对肌肉收缩有何影响？为什么？。
上海细胞生物学膜片钳电生理技术原理及步骤
上海细胞生物学膜片钳电生理技术原理及
步骤
细胞生物学是研究细胞结构、功能和生理过程的学科，而膜片钳电生理技术是细胞生物学中的一种重要技术手段。
本文将介绍上海细胞生物学膜片钳电生理技术的原理及步骤。
一、原理
膜片钳电生理技术是一种用于研究细胞膜离子通道的技术。
其原理是利用玻璃微管制成的膜片钳，将其吸附在细胞膜上，形成一个微小的封闭空间，称为膜片钳封闭空间。
通过在膜片钳封闭空间中加入不同离子浓度的溶液，可以观察到细胞膜离子通道的开放和关闭，从而研究细胞膜离子通道的特性和功能。
二、步骤
1. 制备膜片钳
制备膜片钳需要用到玻璃微管，将其拉制成细长的管状，然后用火烧制成膜片钳。
制备好的膜片钳需要经过精细的打磨和校准，以确保其尺寸和形状符合要求。
2. 建立膜片钳封闭空间
将制备好的膜片钳放置在细胞膜上，通过负压吸附在细胞膜上，形成一个微小的封闭空间，即膜片钳封闭空间。
在膜片钳封闭空间中
加入不同离子浓度的溶液，可以观察到细胞膜离子通道的开放和关闭。
3. 记录电信号
在膜片钳封闭空间中加入不同离子浓度的溶液后，可以通过记录电信号来观察细胞膜离子通道的开放和关闭。
记录电信号需要用到电极和放大器等设备，将电信号转换成可视化的信号，以便进行分析和研究。
三、总结
上海细胞生物学膜片钳电生理技术是一种重要的细胞生物学研究技术，其原理是利用玻璃微管制成的膜片钳，在细胞膜上形成一个微小的封闭空间，通过加入不同离子浓度的溶液来观察细胞膜离子通道的开放和关闭。
该技术可以用于研究细胞膜离子通道的特性和功能，对于深入了解细胞生物学的研究具有重要意义。
电压钳制和膜片钳制技术
特点：较易改变细胞内的离子或物质浓度，也能把酶等直接
加入膜的内侧面，适宜研究胞内物质对通道活动的影响。但 实验中改变膜外侧物质困难，且需侵入低钙液中，以免小泡
误差 变
。
时引起的电容电流 。
将一定的电压加入到刺激信
(4)指令信号控制部分：号中，形成一指令信号的保
持电压。进行电压钳制时， 它决定膜电位值，作电流钳
四种经典记录模式 (Cell-attached or On cell mode)
贴附式
全细胞记录模式
细胞
负压吸
拉并暴露于空气中
细胞 拉
细胞 内面向外式
（三）电压钳技术的优缺点：
1． 优点
➢ 很容易将膜电容电流与离子电流分开；
➢ 可将膜电流分成不同的成分一INa、IK、 Ica 等（在灌流液中加入或去除某种离子）
➢ 能精确反映由离子通道的开放和关闭，引起 的膜电导的改变，能把离子通透性变化的时间关 系加以描述。
➢ 能分析离子通透性变化与膜电位的关系，在 研究电压调节通道的行为方面有很大价值。
1 纵向电阻（Ro、Ri）
由胞浆的性质所决定，具有较高的电阻率， 它与直径呈反比关系（直径大、电阻小，直 径小，电阻大）。由于它的存在，使生物电 的传导主要沿细胞膜所包围的容积导体进行。 它是单位长度的电阻，单位是Ω/cm ，细胞 外间质的容积很大，其单位长度电阻（Ro） 较Ri小。
2.横向电阻（redial resistance）
通过对膜电位的钳制可以观察通过离子 通道的电流，膜片钳放大器正是通过维持电 压的恒定而测出这种电流。运用膜片钳技术 记到的最小电流可达到pA级(10-12 A)。
膜片钳技术
膜片钳技术膜片钳技术80年代初发展起来的膜片钳技术(patch clamp technique)为了解生物膜离子单通道的门控动力学特征及通透性、选择性膜信息提供了最直接的手段。
该技术的兴起与应用，使人们不仅对生物体的电现象和其他生命现象更进一步的了解，而且对于疾病和药物作用的认识也不断的更新，同时还形成了许多病因学与药理学方面的新观点。
本文拟对膜片钳的基本原理及在心血管研究中的应用作一综述。
1膜片钳技术基本原理与特点膜片钳技术本质上也属于电压钳范畴，两者的区别关键在于：①膜电位固定的方法不同；②电位固定的细胞膜面积不同，进而所研究的离子通道数目不同。
电压钳技术主要是通过保持细胞跨膜电位不变，并迅速控制其数值，以观察在不同膜电位条件下膜电流情况。
因此只能用来研究整个细胞膜或一大块细胞膜上所有离子通道活动。
目前电压钳主要用于巨大细胞的全性能电流的研究，特别在分子克隆的卵母细胞表达电流的鉴定中发挥着其他技术不能替代的作用。
该技术的主要缺陷是必须在细胞内插入两个电极，对细胞损伤很大，在小细胞如中枢神经元，就难以实现，又因细胞形态复杂，很难保持细胞膜各处生物特性的一致。
膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。
膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。
由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零，形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。
此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。
又由于玻璃微电极尖端管径很小，其下膜面积仅约1 μm2，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个或几个通道，经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少，可以忽略，也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略，那么，只要保持电极内电位不变，则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变，从而实现电位固定。
膜片钳问题解答
膜片钳常见问题解答1.什么是电压钳与膜片钳，有什么区别？答：电压钳技术是通过向细胞内注射一定的电流（怎么注射），抵消离子通道开放时所产生的离子流，从而将细胞膜电位固定在某一数值。
由于注射电流的大小与离子流的大小相等、方向相反，因此它可以反映离子流的大小和方向。
膜片钳技术钳制的是“膜片”，是指采用尖端经过处理的微电极与细胞膜发生紧密接触，使尖端下的这片细胞膜在电学上与其它细胞膜分离(怎么分离)，这大大降低了背景噪声，使单通道微弱的电流得以分辨出来。
采用电压钳技术将这片膜的电位钳制在某一数值，可记录到单通道电流。
从这点上看，膜片钳技术是特殊的电压钳技术。
随着膜片钳技术的发展，它已经不仅仅局限于“膜片”的概念，也不仅仅采用电压钳技术，还常采用电流钳技术。
2. 离子通道电导的单位是什么？如何换算？答：离子通道电导的单位是西门子（Siemens, S），旧称姆欧，即安培/伏特。
常用皮西门子（pS），1pS＝10E-12 S，1,000 pS＝1 pA/mV。
3. MultiClamp 700A中，在放大器和信号器的连接中，放大器的raw output是否需要连接信号器的ANALOG IN 接口? scaled output，raw output有什么区别?答：Raw output为原始信号输出，放大器输出的信号没有经过处理（如滤波、放大等），scaled output为定标输出，输出的信号经过了处理。
后者的灵活度大，因此多采用。
目前膜片钳放大器多设有scaled output，你可将其与数模转换器（你所说的信号器）的ANALOG IN连接，这样放大器的输出信号就能传送给计算机了，此时已经没有必要再使用Raw output了。
若你想记录两个输出，则需要将Raw output与数模转换器的另一个ANALOG IN连接。
4. 在Clampex的Edit protocol/Wave中，Step和ramp各有什么适用范围？答：Ramp多用于电流衰减缓慢的离子通道以及失敏不明显的受体通道的I-V曲线制作，如多用于钾、钙离子通道。
膜片钳技术的基本原理
（一）膜片钳技术的基本原理：膜片钳技术是用尖端直径1~2μm的玻璃微电极吸管与经蛋白酶处理干净的细胞膜接触，通过20~30cm H2O的负压吸引造成电极尖端与细胞膜形成高阻封接（10~100GΩ），使电极尖端下的小块膜片与膜的其它部分在电学上绝缘，并在此基础上固定膜片电位，监测几个μm2膜片上1~3个离子通道活动的方法。
高阻封接的形成：高阻封接形成与否是记录细胞离子通道电流能否成功的前提，是进行膜片钳实验的关键一步。
微电极尖端与细胞膜形成封接的过程，可以采用软件或刺激器发出一个脉冲电压作用于微电极，造成膜两侧电位差发生变化，产生电极电流，再通过示波器或显示屏，观察电极电流幅度的变化来确定封接程度。
在电极未入溶液之前，在显示器或示波器上可见一直线。
当电极入液后，软件或刺激器发出的电脉冲经记录微电极、浴液及参考电极形成回路，1mV的封接电压流径5MΩ的电极阻抗，则会产生0.2nA的电流浮动，随着微电极尖端接近、接触细胞膜，电极电阻则进一步增加，而电流幅度则随之减小，当在显示器或示波器上看到电流方波变为直线时，则形成低阻封接（50MΩ），然后经微电极给予负压（-10~-30cm H2O），即可形成高阻封接。
再将电脉冲调为10mV，调节快、慢电容电流补偿，消除电容电流，就可进行细胞贴附式膜片钳实验，如果在此基础上再次给予负压或电脉冲，使微电极尖端下膜片破裂，则形成全细胞式。
进行高阻封接时，需注意的是：①在微电极未入液之前常施以正压，使电极内有液体从电极尖端流出，防止浴液表面灰尘或溶液中粒子附着于电极尖端，影响高阻封接。
②如果微电极尖端与细胞膜接触后，仍不能形成高阻封接，则电极即不能再用，需重新换一根微电极继续封接。
③电极尖端与细胞膜接触，稍加负压后电流波形变得平坦，此时，如使电极超极化，则有助于加速形成高阻封接。
④电极入液后封接的成功率与入浴液后的时间呈反比，电极内液中的肽类或蛋白质成分也会有碍于封接形成。
膜片钳实验技术入门---基本原理与操作
膜片钳实验技术入门------基本原理与操作关兵才 李国华 刘理望按：本文乃于2003年根据较旧型号的仪器写成，后被《机能实验科学》 （郑先科主编，北大医学版，2006）收入。
因新旧仪器基本原理和操作步骤大同小异，现对原文略作修改和标注，供同学们参考。
【实验目的】1. 了解膜片钳技术的基本原理和操作。
2. 初步学习电压依赖性离子通道电流的基本记录方法。
【实验原理】一、膜片钳技术原理简介膜片钳(patch clamp)是一种主要用于检测细胞膜离子通道活动的电生理技术，按工作方式可区分为电压钳(voltage clamp)和电流钳是最基本的工作方式，即对细胞膜电位进行人为控制，如将膜电位钳制于某一固定水平，或在此基础上再施以阶跃(step)式或斜坡式(ramp)电压刺激，同时记录跨膜电流，从而分析细胞膜通道的活动。
电流钳即人为控制经微电极对细胞进行注射的电流（等于离子通道电流与细胞膜电容电流之和），同时记录膜电位及其变化。
若注射电流为零即常用的零位钳流，用于测量细胞膜静息电位，若注射方波脉冲刺激电流，用于诱发、观测动作电位。
另外，膜片钳技术还常用于观测细胞膜电容, 从而推测分泌细胞的活动情况。
下面主要介绍其电压钳工作方式的基本原理。
（注：在电生理资料中，因通常将细胞外液和记录系统的“地”点相连作为参考点即零电位点，所以电位和电压两个概念经常混用。
）根据膜片钳实验中受检细胞膜的型式（configuration）不同，又可将膜片钳分为全细胞式(whole-cell)、细胞贴附式(cell-attached 或on-cell)、内面朝外式(inside-out)、外面朝外式(outside-out)等四种模式。
(一)全细胞式1．电压钳制和电流记录的实现图9-9为全细胞式膜片钳工作原理示意图。
图9-9 全细胞膜片钳实验原理示意图A1：运算放大器；A2：单倍增益差动放大器；R f：反馈电阻；V p：电极电位（A1反向输入端电位）；V c：A1同向输入端电位；C in：输入端杂散电容；C p：电极电容；Rs：串联电阻；C m：细胞膜电容；R m：细胞膜电阻；E m：细胞膜内在电位(指钳压时的细胞膜诸通道状态决定的内在Goldman-Hodgkin-Katz平衡电位)；V o：A2输出端电位；V-offset：偏移电位补偿电位；C c：用于电容补偿的电容；V c(app)：表观钳制电压即欲施加于受试膜片的电压；图中⊕和表示求和电路将充有电解质溶液的玻璃微电极（glass microelectrode或 recording pipette）利用负压紧密吸附于细胞表面，形成吉欧即千兆欧（109Ω）级高阻封接，进一步对微电极内施加负压、将放大器（以下简称运放）A1在深度负反馈工作状态下的“虚短路（virtual short circuit）”原理实现，即只要A1工作于线性范围内，其反向输入端的电位V p总是等于同向输入端的电位V c，这两个输入端之间虽非短路却类似于短路。
膜片钳电压钳原理
膜片钳电压钳原理
膜片钳电压钳是一种测量电路中常用的仪器，它的原理是利用薄膜片的变形来测量电路中的电压。
对于电路中的直流电压和交流电压，膜片钳电压钳都可以准确测量。
膜片钳电压钳由两个电极和一个膜片组成。
当电路中的电压作用于膜片上时，膜片会因为电压的变化而产生微小的形变。
这种形变会引起膜片两端的距离变化，从而改变电极之间的电阻值。
通过这种方式，膜片钳电压钳可以测量电路中的电压。
膜片钳电压钳的测量范围通常从几毫伏到几百伏不等。
对于不同范围的电压，膜片钳电压钳的电极间距和膜片的厚度也有所不同。
在实际应用中，膜片钳电压钳可以通过调整电路中的电阻值和放大器的增益来扩大或缩小测量范围。
膜片钳电压钳具有响应速度快、精度高、干扰小等优点，因此在电子、通信、自动化等领域得到了广泛应用。
在实际应用中，膜片钳电压钳可以用于测量电路中的直流电压、交流电压、脉冲信号等，还可以用于测量电路中的电流、电阻等参数。
除了膜片钳电压钳，还有其他测量电路中电压的方法，如电阻分压式、差动放大器式等。
但膜片钳电压钳具有响应速度快、精度高等优点，特别适合于对电路中信号变化快速、幅度小的情况进行测量。
膜片钳电压钳是一种常用的电压测量仪器，它的原理是利用膜片的形变来测量电路中的电压。
它具有响应速度快、精度高等优点，在电子、通信、自动化等领域得到了广泛应用。
第二章2电压钳制和膜片钳制技术2012.9.25.
2.横向电阻（redial resistance）
膜电位、膜电流和膜电阻的关系遵循欧姆定律：
Em = Im . Rm I = V/R 膜电阻越大，对电流的导通能力越小。
膜电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。膜电 阻（ Rm ）的倒数膜电导（ G ， g ）。 I = g V （膜电位 恒定的情况下，膜电导越大，膜电流也越大。 不同的离子有不同的电导。
一、细胞膜的生物物理特性
(Biophysical properties of cell membrane)
细胞膜上以脂质双分子层为支架，镶嵌着不同 特性的蛋白质。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的 极化状态及其形成过程中等都是细胞膜电缆性质 (cable properties) 的反映。 ( 轴浆电阻与膜电阻、
方面特性即可构成其 等效电路 （ Equivalent Circuit）。
outside
Ro
Cm
+
Rm
Cm
膜电容
Rm
Em
膜电阻
离子平衡电位
-
Em
Ro 细胞外液的纵向电阻（Ω/cm）
Ri
轴浆的纵向电阻（Ω/cm）
inside 膜电位等效电路的简化图
离子通道等效电路
细胞膜的等效电路是一个并联的阻容 电路，膜活动时既有电压的改变，同时又 有电流的改变。电位的改变可引起电容器
第二节
电压钳制技术
Voltage clamp technique
利用微电极技术，虽然记录到细胞内的电 变化过程，但不能阐明这种变化的原因。要阐 明跨膜电变化机制，必须应用电压钳制技术。 这一技术首先是由 Cole 及其同事设计，在经 Hodgkin 等人加以改进，用于神经电生理研究， 弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。
膜片钳实验与技术课件.
1、非门控性离子通道
有些离子通道始终处于开放状态，离子可随时进出细胞， 并不受外界信号的明显影响，这些通道称为非门控离子通道。 如神经和肌肉细胞静息电位就是由于细胞膜上的离子通道允许 K+自由进出细胞，而引起的K+电化学平衡电位，此种K+通道即 属于非门控性离子通道。
钠离子通道（sodium channels，简称钠通道），是选择性 地容许Na+跨膜通过的离子通道。根据其对钠通道阻滞剂河豚毒素 （tetrodotoxin, TTX）和μ-食鱼螺毒素（μ-conotoxin,μ- CTX） 的敏感性不同分为神经类、骨骼肌类和心肌类钠通道三类。
电压门控钙离子通道
钙离子通道（calcium channels，简称钙通道）是选择性容许 Ca2+跨膜通过的离子通道。根据肌细胞和神经元电压门控离子通道 对膜电位变化的敏感性，将神经元质膜电压门控钙离子通道分为T、 L及N三种类型，后来应用不同的毒素阻断钙电流的某种特定的成分， 在神经元又增加了P、Q和R型，共6型。
（3）处理 微电极拉制成功后，其尖端需进一步处理。这一过程包括涂硅酮 树酯（sylgard coating）和热抛光（heat polish）。前者是将硅酮树酯涂于微 电极尖端以外部分，达到使浸入浴液中的微电极表面呈疏水性，减小电极内部 与溶液之间的电容。 热抛光是在显微镜下，将微电极尖端接近热源（通电加热的铂丝或白金丝 等），使电极尖端表面变得更加宽阔和光滑，经热抛光处理的微电极可使高阻 封接的成功率明显提高。
1976年Neher和Sakmann完成电极与膜之间50MΩ的封接，首次 记录到去神经蛙肌纤维膜上的单通道电流，为证实生物膜离子单通道 是以全或无规律、随机开放关闭的假说提供了有力依据。但是，当时 实验记录的背景噪声较大。1980年，Neher利用负压吸引实现了GΩ 封接，背景噪声显著减低。1991年膜片钳技术的创始人Neher和 Sakmann荣获诺贝尔医学或生理学奖。
膜片钳原理PPT课件
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膜片钳的放大器
膜片钳放大器是膜片钳技术的核心仪器，放大器主 要有差分放大器、频率提升部分、加法器、瞬时补偿和 钳位放大器等部件组成。放大器的核心部分是差分放大 器，此差分放大器是一电流-电压转换器，可将记录到的 电流以电位差的形式输出。到目前为止放大器的发展已 经经历了三代的发展过程。目前普遍应用的膜片钳放大 器有德国HEKA公司的EPC系列(最新的产品是EPC-9)和 美国Axon公司生产的Axon Patch 系列(最新产品是Axon200B)，日本NIHONKOHDEN公司的CEZ系列。国产放 大器有华中理共大学的PC-Ⅰ和 PC-Ⅱ系列(最新的产品 是PC-ⅡB)，上海生理所的IP-Ⅰ型等。
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电极内液可更换为药物或毒素等非生理 性成分，研究药物对电压依赖性通道的影响， 从而对通道开关动力学的作用达到从微观水 平上研究药物作用的功能机制。也可任意改 变膜片内外液的浓度组分，研究各组分对膜 通 透 性 的 影 响 ， 值 得 注 意 的 是 H+ 、 Ca2+ 浓 度要适宜。也可用相应的激动剂作用于膜受 体，在监测离子通道电流流动过程中，了解 经G蛋白介导的第二信使作用，研究跨膜信 息转导的途径。
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3
膜片钳技术的原理
膜片钳技术是用微管电极接触细胞膜，以千兆欧 姆（gigaohm seal GΩ）以上的阻抗使之封接，使于电 极尖开口处相接的细胞膜的小区域（膜片patch）与其 周围在电学学上分隔，在此基础上固定电位，对此膜 片上的离子通道的离子电流（pA级最小可达0.06pA） 进行检测记录的方法。
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膜片钳的四种工作模式
1.细胞贴附式（cell-attached） 2.全细胞模式（whole -cell recording） 3.内面向外式（inside-out） 4.外面向外式（outside-out）
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3.膜电容（capacity）
电容大小与细胞体积和细胞膜表面积有关。 膜电容和膜面积呈正比，与膜的厚度呈反比。
电容的单位是法拉第（F）。
膜电容的测量可用于细胞膜表面积的测定， 对推算某种离子通道在单位膜面积上的密度有 一定帮助。
4 膜电位 （membrane potential）
当膜上离子通道开放而引起带电离子跨膜流 动时，就相当于在电容器上充电或放电而产生电 位差，即跨膜电位。膜电位的高低决定于跨膜电 化学梯度；膜电位的高低与膜两侧的电荷成正比。
I = V/R 膜电阻越大，对电流的导通能力越小。 膜电阻反映了离子是否容易通透膜的情况。膜电
阻（Rm）的倒数膜电导（G，g）。I = g V（膜电位 恒定的情况下，膜电导越大，膜电流也越大。
不同的离子有不同的电导。 电导的单位是Siemens( S ).
3.膜电容（capacity）
表示膜的绝缘及储存电荷的性质。任何一 种装置使两个导体中间插入一个绝缘体并安排 在一起，称为电容器。细胞外液及细胞内液均 为含电解质的溶液，可看作为两个导体；细胞 膜是含脂质的膜，可视作为绝缘体。细胞外液 -细胞膜-细胞内液三者组成了电容。
二、电压钳制技术的方法原理
(一)、定义
利用负反馈原理将膜电位在空间和时间上固定 于某一恒定的测定值，以研究动作电位产生过程中 的离子通透性与膜电位之间的依从关系的技术。
电压钳制术是利用负反馈电路，在一定时间内
将跨膜电位（Transmembrane Potential， Vm）， 保持在某个选定的电位水平，此电位称为保持电位 （Holding potential，Vh），或者使保持电位突然 变到某个特定的幅值的方波电位，称为钳制电位 （ Clamping potential ） 或 指 令 电 位 （ Command potential，Vc）。
(三) 细胞膜的空间常数（space constant）
空间常数，是度量电压的空间衰减，即标志 电压依距离而衰减的程度的一个常数。即: 膜电位通过膜电阻和纵向电阻所组成的分流 电路随距离的增大而按指数曲线规律衰减的 速度.或表示膜电位按指数曲线规律衰减到 37%所需要的距离。细胞直径越大，空间常 数越大。
Cm
Rm Rm 膜电阻
+
-
Em Em 离子平衡电位 Ro 细胞外液的纵向电阻（Ω/cm）
Ri 轴浆的纵向电阻（Ω/cm）
inside
膜电位等效电路的简化图
离子通道等效电路
细胞膜的等效电路是一个并联的阻容 电路，膜活动时既有电压的改变，同时又 有电流的改变。电位的改变可引起电容器 的充、放电，也可用于电阻器上的电流流 动。通过电容器的电流为Ic ，通过电阻 的电流为Ir。
在膜两側离子浓度不变的情况下，膜电位则 取决于膜电导的改变（离子通透性的改变）。反 过来，膜电导的大小又受到膜电位的控制（离子 通透性的电压依赖性）。
5 膜电流（membrane current）
任何电流都是电容电流（Ic）和电阻 电流（Ir）两种形式通过细胞膜，前者导 致膜电荷的改变，后者实际上是由离子携 带流经细胞膜的。
1 纵向电阻（Ro、Ri）
由胞浆的性质所决定，具有较高的电阻率， 它与直径呈反比关系（直径大、电阻小，直 径小，电阻大）。由于它的存在，使生物电 的传导主要沿细胞膜所包围的容积导体进行。 它是单位长度的电阻，单位是Ω/cm ，细胞 外间质的容积很大，其单位长度电阻（Ro） 较Ri小。
2.横向电阻（redial resistance）
即细胞膜本身具有的膜电阻。细胞膜 由双层脂质构成，厚度很薄，但具有很高 的电阻，即绝缘性。膜电阻表示离子通过 膜的有限能力。 膜电阻反映了离子是否 容易通透膜的情况。膜电阻（Rm）的大小 反映了膜结构电学方面的差异。
2.横向电阻（redial resistance）
膜电位、膜电流和膜电阻的关系遵循欧姆定律： Em = Im . Rm
(一) 细胞膜的等效电路
从电学特点上分析，细胞膜可等效地模拟为 电阻－电容器。它具备细胞浆电阻（纵向电阻， Ro），膜电阻（横向电阻，Rm），膜电容（Cm） 和膜电位（Em）四方面的电学特性，根据这四
方面特性即可构成其等效电路（Equivalent
Circuit）。
outside
Ro
Cm 膜电容
I m = Ic + Ir
5 膜电流（membrane current）
电位的变化引起膜电容的充电或放电， 而电流的变化则表现在膜电阻上的电流流 动。Ic只在膜电位发生变化的一瞬间出现， 若将膜电位固定在一定水平，记录到的仅 为Ii（Ir），这是电压钳制技术的电学基 础之一。
(二) 细胞膜的时间常数（time constant）
第二节 电压钳制技术
Voltage clamp technique
利用微电极技术，虽然记录到细胞内的电 变化过程，但不能阐明这种变化的原因。要阐 明跨膜电变化机制，必须应用电压钳制技术。 这 一 技 术 首 先 是 由 Cole 及 其 同 事 设 计 ， 在 经 Hodgkin等人加以改进，用于神经电生理研究， 弄清了神经纤维在兴奋时离子流的情况。
时间常数是指膜电压随时间而改变的过程，用一 常数表示之。它反映膜电位在细胞膜上随时间而改 变的（缓慢）程度。也就是膜电位通过膜电阻和膜 电容充电到63%或放电到37 %所需的时间。
τ = Rm × Cm
τ = 膜的时间常数 (ms）;Rm=膜电阻（kΩ） Cm=膜电容（μF）
Τ的大小与膜的电学性质有关，与膜的形状无关。
一、细胞膜的生物物理特性
(Biophysical properties of cell membrane)
细胞膜上以脂质双分子层为支架，镶嵌着不同 特性的蛋白质。细胞膜的电紧张及其扩布规律，膜的 极化状态及其形成过程中等都是细胞膜电缆性质 (cable properties)的反映。(轴浆电阻与膜电阻、 膜电容的组合，使电流对膜电位的影响起着依距离而 衰减以及在时间上的延缓作――神经的“电缆”性 质)。细胞膜的电缆特性从它的等效电路及其时间常 数和空间常数得到证实。