EB病毒实验室检测技术研究进展_王荣就

国际检验医学杂志２０１２年５月第３３卷第９期 Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｍａｙ ２０１２，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．９
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法，定量检测 ＥＢＶ 感染的外周淋巴，用实时荧光定量聚合酶 链 反应（ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ）确证，结 果 显 著 相 关，该 方 法 可 用 于 移 植 后 ＥＢＶ 感染的 定 量 分 析。 原 位 杂 交 既 可 确 定 病 毒 的 存 在 情 况，还可区别感染的 细 胞 种 类，是 检 测 ＥＢＶ 最 为 敏 感 的 指 标。 然 而 操 作 比 较 繁 锁 ，探 针 价 格 略 贵 ，不 利 于 临 床 推 广 。
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·综 述·
国际检验医学杂志２０１２年５月第３３卷第９期 Ｉｎｔ Ｊ Ｌａｂ Ｍｅｄ，Ｍａｙ ２０１２，Ｖｏｌ．３３，Ｎｏ．９
ＥＢ 病毒实验室检测技术研究进展
王荣就 综述，邵继红 审校 （广 西 壮 族 自 治 区 北 海 市 卫 校 附 属 医 院 检 验 科 ５３６１００）
关 键 词 ：疱 疹 病 毒 ４ 型 ，人 ； 病 毒 培 养 ； 免 疫 学 技 术 ； 聚 合 酶 链 反 应
４ ＥＢＶ 的基因诊断技术 ＥＢＶ ＤＮＡ 的相对 分 子 质 量 为 ８１５×１０７～１ １０５×１０８，基
因组全序列平均 １７２ｋｂ，由 ５ 种 重 复 序 列 单 位 即 内 部 重 复 序 列、末端重复序列和５种特异的间隔性序列构成。主要表 达 的 基因有先导 蛋 白 基 因 （ＬＰ 基 因 ）、ＥＢＮＡ 基 因、终 末 蛋 白 基 因 （ＴＰ 基因）和 ＬＭＰ 基因。潜伏基因编码６种 ＥＢＮ（ＥＢＮＡ１、２、 ３ａ、３ｂ、Ａ３ｃ和 ＬＰ）和 ３ 种 ＬＭＰ（ＬＭＰ１、２ａ、２ｂ）及 在 各 种 潜 伏 感染 中 均 表 达 ＥＢＶ 编 码 的 小 ＲＮＡ（ＥＢＥＲ），其 中 ＥＢＮＡ１、 ＬＭＰ１、ＬＭＰ２ 及 ＥＢＥＲ 等 基 因 与 癌 变 有 关 。 ［１５］ 根 据 ＥＢＶ 特 异性基因序列设计引物进行基因检测。
ＥＢＶ 培养是将标本直接接种人 新 鲜 的 脐 带 血 淋 巴 细 胞 或 Ｂ 细胞，培养４周，如果出现大量的转化淋 巴 细 胞，则 提 示 病 毒 培 养 阳 性 ，可 通 过 免 疫 荧 光 技 术 或 其 他 检 测 手 段 检 测 转 化 淋 巴 细胞中的 ＥＢＶ 核 抗 原 （ＥＢＮＡ）进 行 鉴 定。 由 于 ＥＢＶ 分 离 鉴 定 耗 时 长 而 且 需 要 特 殊 的 组 织 培 养 条 件 ，因 而 不 适 宜 常 规 检 测 所采用。目前 ＥＢＶ 培养主要应用于对 ＥＢＶ 感染的发病机 制、 预 防 、治 疗 的 体 外 研 究［３－４］。Ｇｏｔｏｈ 等［５］使 用 人 类 扁 桃 体 的 淋 巴组织建立 ＥＢＶ 感染 模 型 并 观 察 到 ＥＢＶ 在 最 初 阶 段 的 感 染 和 扩 散 ，此 项 选 新 型 抗 病 毒 药物。
４．２ ＰＣＲ ＰＣＲ 是 体 外 酶 促 合 成 特 异 ＤＮＡ 片 段 的 一 种 技 术，当存在模板 ＤＮＡ、底物、上下游引物和耐热 ＤＮＡ 聚合酶时 经多次“变性－复性－延 伸 反 应 ”的 循 环 过 程，模 板 ＤＮＡ 可 得 到 大量扩增。检测 ＥＢＶ 需 选 择 特 异 性 高 的 靶 基 因 。ＥＢＶ ＰＣＲ 有常规 ＰＣＲ、巢 式 ＰＣＲ、多 重 ＰＣＲ、逆 转 录 ＰＣＲ 和 实 时 ＰＣＲ 等。常规 ＰＣＲ 只需要设 计 一 对 相 应 的 引 物，扩 增 后 需 进 行 凝 胶电泳鉴定，故操作比 较 繁 琐，同 时 扩 增 产 物 极 易 受 到 污 染 造 成假阳性。巢式 ＰＣＲ 先用一 对 外 引 物 进 行 第 １ 轮 ＰＣＲ，然 后 再使用第１对 引 物 扩 增 的 ＤＮＡ 序 列 内 部 的 一 对 引 物 再 次 扩 增，因其采用两对引物进行两轮扩增，因此，敏感性和特异性 均 有所增强，优点是减少 扩 增 产 物 的 污 染，缺 点 是 增 加 了 每 次 试 验的复杂性。多重 ＰＣＲ 是在同一个反应管中用多对 引 物 同 时 扩增几条 ＤＮＡ 片段。Ｍａｔｓｕｄａ等 采 ［１７］ 用 ＥＢＶ 特异性 Ｔ 细 胞 抗原受体（ＴＣＲ）基因，建立 标 准 化 引 物 系 统（ＢＩＯＭＥＤ－２）多 重 ＰＣＲ，分析 ＴＣＲ 基因重排，对 ６ 例 ＥＢＶ 感 染 的 噬 血 细 胞 性 淋 巴（ＥＢＶ－ＨＬＨ）患 儿 进 行 检 测，结 果 在 所 有 患 者 中 均 发 现 ＴＣＲβ、γ 的 单 克 隆 峰。ＢＩＯＭＥＤ－２ 多 重 ＰＣＲ 可 应 用 于 ＥＢＶ－ ＨＬＨ 患者的治疗观 察。 逆 转 录 ＰＣＲ 是 提 取 组 织 或 细 胞 中 的 总 ＲＮＡ，以其为模板 进 行 ＰＣＲ 扩 增，从 而 获 得 目 的 基 因 或 检 测基因表达。 伊 强 等 从 ［１８］ Ｂ９５－８ 细 胞 扩 增 ＥＢＶ ＢＺＬＦ１Ｎ 基 因的ｃＤＮＡ 片段，为下 一 步 进 行 重 组 ＥＢＶ ＢＺＬＦ１Ｎ 的 表 达 及 其在 ＮＰＣ 诊断应用中 的 研 究 奠 定 了 基 础。 但 逆 转 录 ＰＣＲ 的 产 物 需 要 凝 胶 电 泳 进 行 鉴 定 ，操 作 比 较 繁 琐 ，临 床 上 不 常 使 用 。
２．２ 免疫组化技术 免疫组化技术又称免疫组化法或免疫 酶 法，是 以 带 有 ＥＢＶ 基 因 组 的 淋 巴 母 细 胞 株 Ｂ９５－８ 细 胞 或 Ｒａｊｉ 细胞涂片，经显色剂显色后用普通显微镜观察结果。该方法 常 用于检测血清中 ＥＢＶ 的抗 ＥＢＶ 壳抗 原 （ＶＣＡ）－ＩｇＡ 或 抗 早 期 抗原（ＥＡ）－ＩｇＧ。有研究表明免疫酶 法 具 有 较 高 的 特 异 性 和 敏 感 性［９－１１］，目 前 仍 是 检 测 ＥＢＶ 理 想 的 方 法 ，但 由 于 该 方 法 不 同 的抗原需分别制备相应 的 酶 标 抗 体 进 行 检 测，比 较 麻 烦，而 且 需在显微镜下逐一判断，结 果 带 有 一 定 的 主 观 性，影 响 了 检 测 方 法 的 特 异 性 和 敏 感 性 。 因 此 ，临 床 未 广 泛 应 用 。
４．１ 原位杂 交 技 术 ＥＢＶ 原 位 杂 交 技 术 是 将 ＥＢＶ ＤＮＡ 或 ＲＮＡ 杂交到与其互补 的 核 苷 酸 序 列 探 针 上，清 除 掉 未 被 杂 交 的 探 针，留 下 的 探 针 通 过 标 记 的 自 显 像 或 色 谱 分 析 而 被 确 定 。 临床上常用 ＥＢＥＲ－１作 为 探 针，该 探 针 是 一 段 能 与 ＥＢＶ 编 码 的小 ｍＲＮＡ 特异性结合的碱基序列，其可探查经甲醛 固 定、石 蜡包埋的 ＮＰＣ 标本，因此，用 ＥＢＥＲ－１作探针能 在 肿 瘤 细 胞 原 位检测 ＥＢＶ 的存在。原 位 杂 交 所 用 的 探 针 可 用 地 高 辛、荧 光 物 质 或 放 射 性 物 质 进 行 标 记 。Ｉｔｏ 等 采 ［１６］ 用 荧 光 物 质 标 记 ＥＢＥＲ 探 针，建 立 一 种 新 型 的 ＥＢＥＲ 荧 光 原 位 杂 交 定 量 分 析
２ 免 疫 学 检 测 技 术 ＥＢＶ 感染的个体不论是否发生 恶 性 肿 瘤 均 可 产 生 一 系 列
抗体。临床上主要检测血清中 ＥＢＶ 感染产生的相应抗体。 ２．１ 免 疫 荧 光 法 （ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｓｓａｙ，ＩＦＡ） ＩＦＡ 以 ＥＢＶ 激 活 的 Ｂ９５－８ 细 胞 或 Ｒａｊｉ细 胞 涂 片，经 显 色 剂 显 色 后 用 荧光显微镜观察结果。ＩＦＡ 较早应用于检测 ＥＢＶ 并具 有 较 高 的特异 性 和 敏 感 性，被 视 为 检 测 ＥＢＶ 特 异 性 抗 体 的 “金 标 准”［６－７］，常 被 作 为 参 考 方 法［８］。ＩＦＡ 需 要 细 胞 培 养 ，因 具 有 操 作繁琐、表达的病毒抗原无法定量、需要荧光显微镜观察、结 果 的 判 断 带 有 主 观 性 等 缺 点 ，使 其 在 临 床 上 的 应 用 受 到 限 制 。
（ＥＢＥＲ）等。ＥＢＶ 感染人体后均可产生一系列抗体，检测 ＥＢＶ 各项 抗 体 是 诊 断 ＥＢＶ 感 染 的 重 要 指 标 之 一。 早 期 用 于 ＥＬＩＳＡ 法检测的抗 原 主 要 为 亲 和 层 析 纯 化 的 天 然 抗 原 ，由 于 干扰因素较多，敏感性和特异性均不理想。随着基因重组技 术 的发展，使得在原核 和 真 核 表 达 系 统 中 大 量 表 达 纯 化 ＥＢＶ 蛋 白成为可能，多种 ＥＢＶ 抗 原 已 被 表 达 纯 化，使 ＥＬＩＳＡ 法 诊 断 相关疾病的价值 大 大 提 高。 通 过 ＥＬＩＳＡ 法 检 测 诊 断 ＮＰＣ 获 得较好结 果 的 抗 原 有 ｇｐｌ２５、ＥＡ、ＺＥＢＲＡ、ＥＢＮＡ１、ＴＫ 激 酶、 ＤＮＡ 聚 合 酶、核 糖 核 酸 还 原 酶 等，其 中 ＶＣＡ ｇｐｌ２５ 编 码 是 敏 感 性 最 高 的 基 因 片 段 ，并 具 有 极 强 的 免 疫 原 性 。 盛 平 等 选 ［１２］ 用 ｇｐｌ２５制 成 重 组 ＢＡＬＦ４ 蛋 白，用 于 ＥＬＩＳＡ 法 检 测 ＮＰＣ 患 者血清中ＩｇＡ 抗体，结果特异性和敏感性分别为８１．０％和９４． ０％。目前测定 ＥＢＶ 抗体所用抗原主要为基因重组抗原，重 组 抗原 通 常 用 大 肠 埃 希 菌 或 酵 母 菌 来 制 备 ，因 此，难 免 会 带 有 该 菌本身的 蛋 白 而 影 响 检 测 结 果 。Ｆａｃｈｉｒｏｈ 等 采 ［１３］ 用 ＥＢＮＡ１ 和 ＶＣＡ－Ｐ１８制成人工合成多肽，建立新的 ＥＬＩＳＡ 法用于 诊 断 ＮＰＣ，ＥＢＮＡ１－ＩｇＡ 诊 断 ＮＰＣ 的 敏 感 性 为 ８６．２％，特 异 性 为 ９２．０％；ＶＣＡ－Ｐ１８－ＩｇＡ 诊 断 ＮＰＣ 的 敏 感 性 为 ８４．１％，特 异 性 为９０．３％；如果将两 段 人 工 合 成 肽 混 合 包 被 ，检 测 ＮＰＣ 的 敏 感 性 达 ９５．１％，特 异 性 可 达 ９０．６％；他 们 用 ＥＢＮＡ１－Ｐ１８－ ＥＬＩＳＡ 法检测１５１例 ＮＰＣ 患者和１９９例 ＥＢＶ 携带者，同时用 ＥＡ－ＥＬＩＳＡ 法进行确 证 测 试，结 果 其 敏 感 性 由 ８５．４％ 提 高 到 ９６．７％，特异性由９０．１％提高 到 ９８．０％ 。 ［１４］ 由 于 人 工 合 成 多 肽抗原没有细菌蛋白混杂，且相对分子质量小，结构简单，从 而 避 免 了 交 叉 反 应 的 可 能 ，使 结 果 的 准 确 性 得 到 提 高 。