核酸分子探针
DNA探针技术介绍
DNA探针技术介绍
杂交当双链DNA受热时，稳定的双股螺旋结构的氢链被打开，双螺旋结构变得不稳定，DNA分子的双链分开，这个过程称为变性。如果接着降低温度，双股螺旋链又可形成，原来的双链DNA分子又可恢复，这个过程叫复性或退火。实际上，任何两条单链核酸分子都能形成一个双链分子，只要其碱基几乎都是互补的。双链分子被称为杂交体，其形成的过程称为杂交。杂交体能在两条DNA链之间、DNA和RNA之间及两条RNA之间形成。核酸的这种特性用于一系列分析、检测技术，可从复杂的混合物中，利用一种核酸的互补序列检测特异性DNA或RNA序列。
探针利用杂交技术检测特异核酸序列必须使用探针。一个探针可以是能检测互补核酸序列的简单的DNA或RNA 分子。探针必须是纯净的，而且不受其他不同序列核酸的影响。典型的探针是克隆的DNA序列或通过PCR扩增获得的DNA。人工合成的寡核苷酸或从体外转录克隆的DNA序列后获得的RNA，也常作为探针。允许使用互补的配对碱基对靶核酸检测，但所用探针必须是单链。寡核苷酸和RNA探针是自然的单链分子，然而，DNA分子正常情况下是双链，在对靶序列杂交前，DNA分子必须变为单链，这一般是通过加热使其变性而达到解链目的。解链DNA分子被迅速冷却到只能缓慢复性的温度以下，可使探针保持单链状态。靶DNA分子的检测要求用药物标记，以便观察杂交结果。探针一般用放射性同位素标记，如P32、S35、C14或H3。杂交体发出的射线，能使X光片感光而被观察到，这称为放射自显影。由于放射性物质的使用，对人体有风险，使得非放射性探针有了进一步的发展。常用地高辛(DIG)标记探针，它可被用染料标记或结合有能催化底物并形成有色产物的酶的特异性抗体检测到。
核酸探针的原理及应用
核酸探针的原理及应用
1. 导言
核酸探针是一种用于检测和鉴定核酸分子的分子探针。它通过特异性识别目标核酸序列，可广泛应用于基因组学、生物医学研究、临床诊断等领域。本文将介绍核酸探针的原理和应用。
2. 核酸探针的原理
2.1 核酸杂交原理
核酸探针的原理基于核酸的互补配对特性。当目标核酸序列与探针的互补序列相遇时，它们之间会发生杂交反应。杂交后，探针会与目标核酸形成稳定的双链结构，从而实现对目标核酸的特异性识别和检测。
2.2 核酸标记技术
核酸探针通常需要标记以便于检测。常用的核酸标记技术包括荧光标记、放射性标记和酶标记等。这些标记可以通过特定的检测方法，如荧光显微镜、放射性测量和酶反应等，来检测探针与目标核酸之间的杂交情况。
2.3 核酸探针的设计
核酸探针的设计需要考虑多个因素，包括目标序列的长度、杂交条件、标记方式等。探针的长度应足够长以确保与目标序列的特异性结合，同时要避免与非目标序列的杂交。此外，探针和目标序列的杂交温度、盐浓度等条件也需要进行优化。
3. 核酸探针的应用
3.1 基因组学研究
核酸探针在基因组学研究中扮演着重要角色。通过使用特异性的核酸探针，可以对基因组进行定位、定序和变异等研究。同时，核酸探针也可用于基因表达分析和基因功能研究，例如通过反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测目标基因的表达水平。
3.2 生物医学研究
核酸探针可用于生物医学研究中的疾病诊断和治疗。例如，在肿瘤学研究中，核酸探针可以用于检测肿瘤相关基因的异常改变，从而实现早期诊断和治疗监测。此外，核酸探针还可用于检测病毒和细菌感染，诊断遗传性疾病等。
高中生物知识理解探针(probe)的定义和应用
核酸分子杂交示意图 疑难问题：今天在讲解试题中发现，让学生应用DNA分子杂交技术的原理检测植株有没有成为转基因植株，绝大多数学生的答案是用“单抗探针”检测，而不是“目的基因探针”，说明学生对探针不够了解，造成张冠李戴。 定义1：在分子杂交中用来检测互补序列的带有标记的单链DNA或RNA片段。 定义2：分子生物学和生物化学实验中指示特定物质（如核酸、蛋白质、细胞结构等）的性质或物理状态的一类标记分子。 我的理解是：定义1是狭义的探针，即核酸分子探针（基因探针），定义2应该是广义的探针，包括单克隆抗体探针（单抗）。 下面“基因探针”的具体应用程序： 探针是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、萤光染料或者酶（如辣根过氧化物酶，一种临床检验试剂中的常用酶）标记成为探针。 磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。 当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸（DNA或RNA）序列通过氢键紧密相连，随后，未被杂交的多余探针被洗去。最后，根据放射自显影、萤光显微镜、酶联放大等方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测序列（即与探针互补的序列）。 过程示意图 下面是“单抗探针”的具体应用程序： 单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位（即抗原决定簇）相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。 此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。 如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子（蛋白质、核酸、酶等）在细胞中的位置和分布。 免疫学技术－单抗技术及其应用 核酸探针及其作用
小分子g-四链体荧光探针
小分子g-四链体荧光探针
小分子g-四链体荧光探针是一种新型的荧光探针，以其高灵敏度、高特异性和易于修饰等优点在生物检测领域受到广泛关注。本文将详细介绍小分子g-四链体荧光探针的原理、应用以及未来发展前景。
一、小分子g-四链体荧光探针的原理
g-四链体是一种具有特殊结构的核酸分子，由两个相互作用的DNA双链组成，形成一个稳定的发夹状结构。在特定条件下，g-四链体可以猝灭荧光团，从而实现对生物小分子的灵敏检测。小分子g-四链体荧光探针利用这一原理，通过设计特定的核酸序列，使荧光团与g-四链体结合，从而实现对目标分子的检测。
二、小分子g-四链体荧光探针的应用
1.生物传感器：小分子g-四链体荧光探针可作为一种高灵敏度的生物传感器，用于检测各种生物小分子，如金属离子、氨基酸、核苷酸等。
2.疾病诊断：利用小分子g-四链体荧光探针的高特异性，可以用于疾病相关生物标志物的检测，为临床诊断提供便捷、灵敏的方法。
3.环境监测：小分子g-四链体荧光探针可用于环境中有害物质的检测，如重金属、农药等，为环境保护提供技术支持。
4.生物成像：小分子g-四链体荧光探针可以用于活体生物成像，实现对细胞、组织内部结构的实时观察。
三、未来发展前景
1.探针优化：通过进一步优化核酸序列设计和荧光团的选择，提高小分子g-四链体荧光探针的灵敏度和特异性，使其在更广泛的生物检测领域得到应用。
2.多功能探针：开发具有多种功能的小分子g-四链体荧光探针，如信号放大、光激活、温度敏感等，以满足不同应用场景的需求。
3.生物传感器的集成：将小分子g-四链体荧光探针与其他生物传感器集成，构建高性能的生物检测平台，实现对多种目标分子的快速、准确检测。
第6章 核酸分子探针
第六章
基于分子工程的核酸分子探针
生命的本质是一系列可自主调控的化学、物理过程，但主角不是简单的化合物而是复杂的生物大分子。核酸与蛋白质是生命发生、发展和繁衍中最重要的两类物质，正是它们之间复杂、精巧而协调的相互作用演绎出神奇、千变万化、令人叹为观止的生命现象。
因此，在分子水平上研究核酸、蛋白质等生物大分子及其相互作用是我们深入理解生命现象、揭示生命奥秘最为关键的内容之一。
红细胞:6,000-9, 000nm
白细胞:10,000nm
一般细菌: 1,000 –10,000 nm 一般病毒:75 –100 nm 蛋白质5 –50 nm DNA (双链宽) 2 nm
研究人员需要一些合适的分析工具和
手段，在分子水平上，最好是在活体内，
将生物分子的成分、结构、相互作用等信
息转变为易于检测的光、电信号变化，非
常灵敏、准确地反映出来。
以体系的功能为导向，在分子水平上设计所需结构，并定向合成功能分子，是分子工程的重要特征。通过在分子水平上研究生物分子间的相互作用，设计、合成和筛选具有特定功能的分子探针并发展其生物医学应用，是分子工程的前沿研究领域之一。
核酸分子探针是一种重要的分子生物学研究手段。它非常巧妙地利用了核酸的结构及其识别能力上的特点，例如核酸的杂交、立体构象转变、与蛋白质、寡聚高分子甚至金属离子的特异性结合等，结合分子水平的信号传导机制，将相关的生命信息转变为易于检测的信号，例如拉曼、荧光、化学发光、电流、放射性等。随着其他相关学科如化学、材料科学的发展，核酸分子探针的合成、标记和检测技术取得了长足的进展，已经能在单个活细胞，甚至单分子水平上观测分子的行为。与荧光蛋白技术相比，核酸分子探针一般不需要对目标细胞预先进行基因操作，不仅更能反映生命活动的真实状况，而且也便于直接研究临床样品。
核酸探针技术及应用
核酸探针技术及应用
基因检测技术的发展，使对某些疾病的诊断达到了特异性强、敏感性高及简便快速的目的。近年来各种血清学方法发展很快，但血清学方法主要是测抗体，是间接的证据随着分子生物学的发展，应用DNA—DNA杂交建立了核酸探针(Probe)技术，该技术是目前基因检测最常用的方法，目前已成为诊断各种感染性疾病，恶性肿瘤，遗传病，检测抗生紊的耐药性，法医学鉴定及从分子水平上研究发病机制与流行病学规律等方面的一种重要手段。本文主要介绍了核酸探针技术的原理，核酸分子杂交方法及核酸探针的应用等方面。
一、核酸探针技术的原理
DNA 或RNA 片段能识别特定序列基因的DNA 片段，能与互补的核苷酸序列特异结合，这种用同位素非同位素标记的单链DNA片段即为核酸探针。
核酸探针技术是将双链DNA 经加热或硷处理，使硷基对间的氢链被破坏而变性，解开成两条互补的单链。它们在一定温度和中性盐溶液条件下，又可按A—T，G—C碱基配对的原则重新组合成双链为复性。这种重组合只是在两股DNA是互补(同源)或部分互补(部分同源)的条件下才能实现。正是由于双链DNA的这种可解离与重组合的性质，才可用一条已知的单链DNA，用放射性同位素或其他方法标记后制备成核酸探针，与另一条固定在硝酸纤维素滤膜上的变性单链DNA进行杂交，(另一条DNA链与核酸探针是配对碱基，称为靶)再用放射自显影或其他显色技术检测，以确定有无与探针DNA (或RNA)同源或部分同源的DNA(或RNA)存在。因为探针只与靶病原体的DNA或RNA杂交，而不与标本中存在的其他DNA 或RNA 杂交。
生物检测技术——核酸探针
RNA的探针制备过程是将一段含完整或部分基因的DNA 片段插入重组质粒的多克隆位点，以内切酶在插入片段 中某一适当部位或插入片段下游的某一部位消化重组质 粒，使之成为线性DNA，然后在相应的DNA依赖RNA 聚合酶催化下，以含有目的基因的DNA片段为模板合成 RNA探针。
2)人工合成的寡核苷酸探针
核酸探针的分类及制备方法
根据核酸的来源和性质，核酸探针可分为RNA探针、人工 合成的寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针等几 类。
1） RNA探针
RNA探针一般都是单链，它具有单链DNA探针的优点，又 具有许多DNA单链探针所没有的优点，主要是：RNA： DNA杂交体比DNA：DNA杂交体有更高的稳定性，所以 在杂交反应中RNA探针比相同活性的DNA探针所产生信号 要强。RNA：RNA杂交体用RNA酶A(胰RNA酶)切比用Sl 酶切DNA：RNA杂交体容易控制，所以用RNA探针进行 RNA结构分析比用DNA探针效果好。
生物检测技术
——核酸探针
前言
从基因工程技术一开始，就伴随着核酸探针的应用。 在许多领域如基因研究、SNP检测、STR检测、肿瘤 研究、药理学研究等方面，核酸探针都是一种强有力 的工具。为了能更好的应用和发展核酸探针，有必要 对核酸探针有一个系统的认识。 核酸探针是以研究和诊断为目的，用来检测特定序列 核酸(DNA 或RNA)的DNA或RNA片段，称为核酸探针， 作为探针的核酸探针片段可以较短(20 bp)，也可以较 (5kb)。 核酸探针具有特定的序列，能够与具有相应核苷酸碱 基互补序列的核酸片段结合，因此可用于样品中特定 基因片段的检测。
5.06 核酸的分子杂交-探针制备
末端标记法原理
末端加成标记法： （1）一种是在 末端加成标记法： ）一种是在5`末端加成标记法 碱性磷酸酶（ ）去掉dsDNA 5`-磷 先用碱性磷酸酶 磷 先用碱性磷酸酶（AP）去掉 再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP 多核苷酸激酶催化标记的 酸，再用 多核苷酸激酶催化标记的 转移加到DNA片段 片段5`-OH上。 转移加到 片段 上 末端用末端转移酶 （2）在探针 末端用末端转移酶掺入一个 ）在探针3`-末端用末端转移酶掺入一个 单标记的ddUTP。 单标记的 。
随机引物标记法原理
用一些六核苷酸作为随机引物， 用一些六核苷酸作为随机引物，将这些 六核苷酸作为随机引物 引物和探针DNA片段一起热变性，退火后， DNA片段一起热变性 引物和探针DNA片段一起热变性，退火后， 引物与单链DNA互补结合， DNA互补结合 DNA聚合酶的 引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的 作用下，按碱基互补配对原则不断在其3` 3`作用下，按碱基互补配对原则不断在其3`OH端添加标记的单核苷酸修补缺口 端添加标记的单核苷酸修补缺口， OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新 的标记的探针片段。 的标记的探针片段。
1 芯片方阵的构建 2 样品制备 3 生物分子反应 4 信号的检测及分析
（四）DNA芯片应用 DNA芯片应用
可在基因组水平进行基因表达和发 现研究、突变、序列测定等， 现研究、突变、序列测定等，已方泛 应用于基因组研究和人类疾病的诊断 等多领域。 等多领域。
核酸探针的种类
核酸探针的种类
基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针、RNA探针、cDNA探针、cRNA探针及寡核苷酸探针等几类，DNA探针还有单链和双链之分。下面分别介绍这几种探针。
(一)DNA探针
DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。
这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。
因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。
rt-pcr 探针原理
rt-pcr 探针原理
RT-PCR（逆转录聚合酶链式反应）探针原理是一种基于实时荧光检测的核酸扩增技术，用于定量分析目标RNA分子。其原理如下：
1. 首先，从目标组织或细胞中提取总RNA，然后通过逆转录酶将RNA 转化为cDNA。
2. 采用特定引物和探针进行PCR扩增。探针是一种荧光标记的DNA 分子，能够与目标cDNA序列特异性地结合。
3. 在PCR反应过程中，荧光探针与目标cDNA结合，随着扩增产物的形成，探针的荧光强度逐渐增强。
4. 通过实时监测扩增过程中荧光信号的变化，可以计算出目标分子的拷贝数。荧光信号的强度与目标RNA分子的数量成正比，从而实现对RNA分子的定量分析。
5. 利用特定的软件和数据分析，可以得到目标RNA分子的相对表达量，从而分析不同样本之间基因表达的差异。
RT-PCR探针原理具有高度敏感性和特异性，广泛应用于基因表达研
究、病毒载量检测、突变检测等领域。需要注意的是，RT-PCR实验过程中需要严格控制实验条件，以确保结果的准确性和可重复性。
核酸探针作用的原理及应用
核酸探针作用的原理及应用
引言
核酸探针是一种广泛应用于生物学研究中的工具，通过与目标DNA或RNA序
列的特异性互补配对，能够检测并定位特定的核酸分子。本文将介绍核酸探针的原理和其在生物学研究中的应用。
核酸探针的原理
核酸探针的原理基于DNA或RNA的碱基互补配对。核酸分子由四种碱基组成，分别是腺嘌呤（A）、胞嘧啶（C）、鸟嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T）（DNA中的胸
腺嘧啶被尿嘧啶（U）取代）。两条相互互补的核酸链能够通过碱基配对（A与
T/U，C与G）形成稳定的双链结构。
核酸探针通常由两个部分组成，一个是探针的序列，另一个是标记物。探针的
序列通常与目标DNA或RNA的互补序列相匹配，便于与目标核酸发生特异性配对。标记物则是一种用于检测核酸探针位置的信号发出物质，如荧光染料或放射性同位素。
核酸探针的应用
核酸探针在生物学研究中有着广泛的应用。以下是核酸探针的几个重要应用。
1. 基因检测和表达分析
核酸探针可以用于检测和鉴定目标基因的存在和表达情况。通过将探针与目标DNA的互补序列配对，可以检测基因的存在与否。此外，通过标记物的选择，可
以定量检测基因的表达水平。
2. 突变检测
核酸探针可以用于检测DNA序列的突变。通过与目标DNA的互补配对，如果
存在突变，则配对会受到影响，从而使标记物的信号发生改变。这种方法可以准确、快速地检测DNA序列中的单核苷酸突变。
3. 细菌和病毒检测
核酸探针还可以用于检测和鉴定细菌和病毒的存在。利用特异性的核酸探针，
可以识别和定位特定的细菌和病毒序列。这种方法在临床诊断中有着重要的应用，可以迅速判定感染的细菌或病毒种类。
核酸探针的原理是什么
核酸探针的原理是什么
核酸探针是一种用于检测、鉴定和定量核酸分子的工具。它基于互补配对原理，将带有荧光标记或放射性标记的单链DNA或RNA引物与待测样品中的靶核酸特异性结合，通过检测标记物的荧光或放射性信号来确定靶核酸的存在、数量和序列等信息。
核酸探针的原理基于DNA和RNA双链分子的互补配对规则。DNA由四种不同的碱基（腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和鳸嘧啶）组成，它们之间可以通过氢键形成配对，即腺嘌呤与鸟嘌呤之间形成两个氢键，胸腺嘧啶与鳸嘧啶之间形成三个氢键。因此，DNA的两条链是互补的，即一个链上的碱基与另一个链上的碱基相互配对。
核酸探针通常由一条具有特定序列的单链DNA或RNA构成，并在末端或碱基上标记有荧光染料或放射性同位素等标记物。当该核酸探针与待测样品中的靶核酸序列互相配对时，标记物会被激活并发出荧光或放射性信号。这种信号可以通过荧光显微镜或放射性计数器等设备被检测、记录和分析。
核酸探针的选择是十分重要的，它们必须与待测样品的靶核酸序列具有高度的亲和力和特异性，以确保检测的准确性和灵敏度。核酸探针的设计通常基于目标序列的已知信息，通过比对目标序列与其他相关序列的异同，确定具有高度亲和力和特异性的引物。此外，核酸探针的长度、配对性及标记物的选择也会影响探针的灵敏度和特异性。
核酸探针技术在生物医学研究和临床应用中具有广泛的应用。例如，在基因检测中，核酸探针可以用于检测特定基因变异或突变，从而确定个体是否患有遗传疾病；在病毒学研究中，核酸探针可以用来检测和定量病毒的存在和数量，帮助诊断和治疗病毒性感染；在环境监测中，核酸探针可以用于检测和鉴定水体、土壤和空气中的微生物和有害物质等。
分子探针名词解释
分子探针名词解释
分子探针是目前国内外科研领域普遍使用的一种新型、高灵敏度、快速分析检测工具，可应用于物理、化学、生物等领域。目前常见的分子探针主要包括：亲核试剂分子探针、基团转移分子探针和有机试剂分子探针。
在常规质谱中，为了确保检测结果的重复性和准确性，对分子探针进行选择性标记是必不可少的。选择性标记是指将分子探针标记到被检测物质上，标记过程为改变靶分子的结构，使其变得不容易进入质谱仪的内腔而与质谱仪的检测器相互作用，这样就避免了与仪器原有结构的碰撞，从而提高了质谱仪的分辨率，减少了背景的干扰，增加了检测的精密度。分子探针又称作试剂探针，它通常以非常微量的化学物质作为标记分子，这些标记分子在生物大分子的水解和降解反应中起着至关重要的作用。利用分子探针可以实现快速、灵敏地对生物大分子进行定性或定量分析，并且能够从各种细胞中分离出活的生物大分子，是理想的微量生物分子定量分析工具。
2．具有与样品匹配性好，灵敏度高，线性范围宽，背景低，操
作简便，结果可靠等特点，在农残检测、食品安全、疾病诊断等方面获得了广泛的应用。分子探针因其简单而廉价，已成为目前最常用的微量生物分子定量分析工具。在目前，分子探针主要有4类，第一类为碱性品红，第二类为乙酸镁，第三类为辣根过氧化物酶，第四类为辣根过氧化物酶。
分子探针由分子束源（如激光器或二极管）、多道检测器、单道
检测器、信号放大器及信号处理系统等组成。根据所用的探针，分子探针又可以分为：核酸分子探针、蛋白质分子探针、糖类分子探针、肽分子探针、类固醇分子探针、代谢物分子探针、脂类分子探针等几种类型。由于分子探针具有高度的选择性，与检测物的结合力强，可进行样品的前处理、富集、制备成各种衍生物等优点，因此分子探针在许多领域的应用越来越广泛，也越来越受到重视。现在，分子探针在食品安全检测、环境检测、动植物检疫、疾病诊断、医药卫生等领域得到了广泛的应用。
核酸探针的种类
核酸探针的种类
基因探针根据标记方法不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类，根据探针的核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，cRNA探针及寡核苷酸探针等几类，DNA探针还有单链和双链之分。下面分别介绍这几种探针。
（一）DNA探针
DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。
这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。这些DNA片段须是特异的，如细菌的毒力因子基因探针和人类Alu探针。这些DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G+C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。细菌的基因组大小约5×106bp，约含3000个基因。各种细菌之间绝大部分DNA是相同的，要获得某细菌特异的核酸探针，通常要采取建立细菌基因组DNA文库的办法，即将细菌DNA切成小片段后分别克隆得到包含基因组的全信息的克隆库。然后用多种其它菌种的DNA作探针来筛选，产生杂交信号的克隆被剔除，最后剩下的不与任何其它细菌杂交的克隆则可能含有该细菌特异性DNA片段。将此重组质粒标记后作探针进一步鉴定，亦可经DNA序列分析鉴定其基因来源和功能。因此要得到一种特异性DNA探针，常常是比较繁琐的。探针DNA克隆的筛选也可采用血清学方法，所不同的是所建DNA文库为可表达性，克隆菌落或噬斑经裂解后释放出表达抗原，然后用来源细菌的多克隆抗血清筛选阳性克隆，所得到多个阳性克隆再经其它细菌的抗血清筛选，最后只与本细菌抗血清反应的表达克隆即含有此细菌的特异性基因片段，它所编码的蛋白是该菌种所特有的。用这种表达文库筛选得到的显然只是特定基因探针。
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分子信标用于果蝇卵母 细胞内mRNA成像
PNAS, 2003, 100, 13308
• CRE-decoy aptamer 治疗乳腺癌 的效果要显著地优于tamoxifen。
• 抗VEGF aptamer (Macugen) 已 被用于老年性黄斑变性的临床治 疗。
1962年，沃森、克里克和威尔 金斯获得诺贝尔生理学或医学奖
D。NA双螺旋结构模型的提出标志现代分子生物学的诞生。
DNA分子的特点：
➢ 稳定性：脱氧核糖和磷酸交替 连接方式不变，碱基配对原则不变 ，可反复变性和复性。
➢ 多样性：DNA分子碱基对的排 列顺序千变万化，一天n个碱基的 DNA分子排列方式有4n种。
1.2 金属-碱基对
T-Hg2+-T的结构
Angewandte Chemie International Edition, 2004, 43(33): 4300-4302
C-Ag+-C的结构
Chemical Communications, 2010, 46(9): 1476-1478
1.3 G四聚体
600
J. Huang, K. Wang, W. Tan, et al. Anal. Chem. 2010, 82, 10158
Cell aptamer
细胞膜蛋白触发构型变化的激活式核酸适体探针，用于肿瘤活体荧光成像。 检测原理示意图
创新性提出了“激活式核酸适体探针” 概念，该探针与传统 “always on”核酸适体 探针相比，有效降低了非特异性背景信号， 在肿瘤部位产生了更高的对比度并大大缩短 诊断时间，有望为实现肿瘤早期诊断提供一 种更为灵敏的检测方法。
4x106 3x106 2x106 1x106
0 350
400
450
500
550
Wavelength (nm)
[L ysozyme] 500 nM 200 nM 100 nM 50 nM 20 nM 10 nM 5 nM 2 nM 1 nM 0.8 nM 0.5 nM 0.2 nM 0.1 nM 0 nM
➢ 特异性：基于碱基配对原则， DNA能特异性识别与其完全互补 的DNA或RNA序列。
➢ 合成和标记简单且已经自动化 和市场化。
核酸分子的优越性质： 1. Watson-Crick碱基互补配对，金属-碱基对，G或C四聚体等；
2. 作为生物催化剂（核酶），与蛋白酶发生特异性相互作用； 3. 可人工合成，便于修饰和衍生化功能分子（锁核酸等）； 4. 核酸适配体---基于核酸的特定空间构型特异性识别靶分子 （离子、蛋白、细胞等）；
150000 145000 140000
0
2.3X10-3
1.2X10-3 2.3X10-4
400
800
200000
100000
0
200
400
600
800
Time (Second)
NTFS (Nucleotide Fragment Sense)平台技术实时监测核酸的连接过程 该平台还被用于核酸磷酸化过程监测，NAD等的高灵敏检测
3. 核酸衍生物的性能
硫代化核酸结构示意图 2’-O-甲基RNA结构示意图
肽核酸结构示意图
锁核酸结构示意图
•衍生物类型 •硫代化核酸 •2’-氧甲基RNA
•肽核酸 •锁核酸
•抗酶切能力 •较强 •较强 •强 •极强
核酸衍生物性能比较
•选择性 •中 •中 •高 •高
•杂交亲和力 •稍微降低 •稍微增强 •强 •强
尺度和量的概念
红细胞: 6,000-9, 000nm
白细胞: 10,000nm
一般细菌: 1,000 – 10,000 nm
一般病毒: 75 – 100 nm
蛋白质： 5 – 50 nm
DNA (双链宽) ： 2 nm
谋求灵敏、准确地在分子层面，以致在活体内，将生物分子的成分、结构、相互作用 等信息转变为易于检测的光、电等信号变化。
历史回顾：DNA双螺旋结构是怎样发现的？
1951年，英国科学家威尔金斯 和富兰克林利用X射线衍射技术拍 摄到了DNA晶体照片。
1952年，奥地利科学家查哥夫 研究指出：生物DNA中，碱基A 和T的含量总相等，G和C的含量 相等。
1953年，美国科学家沃森和英 国科学家克里克在Nature杂志上 发表了DNA的双螺旋结构（20世 纪生物科学最伟大的发现）。
5. 与纳米结构结合，用于肿瘤等的成像和治疗研究； 6. 临床应用等
1.1 Watson-Crick碱基互补配对—分子信标
目标 DNA
分子信标是个呈发夹结构、设计十分巧妙的短链DNA分子。由于它特殊的结构，自 从1996年被首次合成出来以后，它已经被非常广泛地应用于PCR定量、基因分型、 基因芯片、活细胞内mRNA分析以及蛋白质（酶）研究等领域。
2.2 与蛋白酶发生特异性相互作用---核酸片段检测（NTFS） 平台技术
（Nucleic Acid Res., 2003, 31, e148; Nucleic Acid Res., 2005, 33, e97；Analyst, 2005,130,350-357; Anal. Biochem., 2006, 353, 141-143; Biomedical Photonics Handbook, 2003, p57-1~57-23, ）
5. 与纳米结构结合，用于肿瘤等的成像和治疗研究
6. 临床应用等
核酸分子探针的进展， 已经能在单个活细胞，甚 至单分子水平上观测分子 的行为，为细胞信号转导 的活体、实时、在线研究 提供了条件。
核酸分子探针的发展 不仅促进了检测手段的变 革，还带来了巨大的经济 和社会效益。
核酸适体用于肿瘤 细胞的识别
亲和力高 特异性强
筛选周期短，成本低
靶分子种类广泛
结合条件可控 修饰灵活
分子量小，无免疫原性
稳定、易保存
•核酸适配体的定义
• 核酸适配体：由15-60个碱基组成的能特异识别 靶分子的单链DNA/RNA，识别对象包括小分子 、蛋白质、细胞等。
分子识别的基础不是碱基互补配对 折叠成特定的二级与三级结构 空间结构与靶分子构象匹配
杂交链式反应用于DNA的高灵敏检测 --- Watson-Crick碱基互补配对
Fluorescence Intensity (a.u.)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
350
400
450
500
550
600
650
Wavelength (nm)
J. Huang, K. Wang, W. Tan, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 401
•靶分子
•核酸适配体
•ATP 核酸适配体
•Designer DNA/RNA
小分子ATP aptamer Aptamer辅助的量子点自组装用于ATP的荧光传感
J. Liu, X. Yang*, K. Wang*, et al. Anal. Chem. 2013, 85, 11121−11128
肌红蛋白 aptamer 正/反筛集成的微流控芯片用于肌红蛋白aptamer的筛选
核酶（Ribozyme）是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特定RNA序 列。它的发现打破了酶是蛋白质的传统观念。有一些DNA分子同样具有催化功能。 1981年由Cech等人在研究四膜虫前体rRNA拼接机制时发现，并因此获得1988年诺 贝尔化学奖。
如上图，由于DNAzyme与底物链发生分子内杂交, 荧光基团与猝灭基团相互靠近, 导致荧光猝灭. 当Pb2+存在时, DNAzyme被激活, 底物链被切断后释放出荧光基团 标记的DNA片段, 从而产生明显的荧光信号. 据此可在常温下快速检测Pb2+, 检测 下限为10 nmol/L.
利用E.Coli DNA连接酶具有对NAD的高度依赖性，检测NAD+
Z. Tang, K. Wang* et al. Anal. Chem., 2011, 83, 2505
基于DNA聚合酶的链置换聚合反应用于DNA的高灵敏检测
Q. Guo, X. Yang, K. Wang, et al. Nucleic Acids Res. 2009, 37, e20.
•荷电性 •负电 •负电 •中性 •负电
•非特异性结合 •高 •高 •低 •底
•毒性 •高毒性 •低毒性 •低毒性 •无毒性
4. 核酸适配体 Aptamar----”Chemical Antibody”
Theoretically, anything we use antibodies today (for molecular recognition, molecular interaction, diagnosis, and therapeutical) can be replaced with synthetic DNA probes which can be prepared reproducibly in our labs using a DNA synthesizer.
Q. Wang, X. Yang*, K. Wang*, et al. Anal. Chem. 2014, 86, 6572−6579
溶菌酶aptamer
将aptamer序列嵌入到分子信标的互补链，与目标识别时发生竞争反应，可以 引起构型变化，分子信标恢复发夹结构，释放信号。
5x106
Fluorescence Intensity (CPS)
G-quadruplex–aptamer as a drug delivery carrier
Analytical Chemistry, 2009, 81(6): 2144-2149 Angew. Chem. Int. Ed. 2011, 50, 6098 –6101
2.1 作为生物催化剂（核酶）---核酶探针
分子信标的工作原理：
E: FRETΒιβλιοθήκη Baidu率 R: 荧光给体与受体之间的距离
无靶标存在下，茎环结构使得荧光基团和淬灭基团相互靠近，发生FRET，荧 光淬灭。加入靶序列后，分子信标环部与之互补配对形成刚性并且更稳定的 双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团距离增大，阻止FRET发生，荧光恢复。
K. Wang, W. Tan, et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 856
杂交链式反应用于DNA的比色检测 --- Watson-Crick碱基互补配对
P. Liu, X. Yang, K. Wang, et al. Anal. Chem. 2013, 85, 7689−7695
Watson-Crick碱基互补配对启发的自组装构型开关用于核酸杂交调控
L. He, X. Yang, K. Wang, et al. Chem. Commun., 2014, 50, 7803--7805
A
Molecular Beacon
Oligo A Oligo
Hybrid
B
NTFS
Binding
Ligation
B
Fluorescence Intensity
500000 400000 300000
2.3
0.23
0.115 6.9X10-2 2.3X10-2 1.2X10-2 6.9X10-3 2.3X10-3