乳酸菌的分类鉴定

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乳酸菌分类鉴定方法的研究进展

收稿日期 : 2008211207
基金项目 :国家“973”项目 (2004CB719604—4) ;农业部核技术农业应用专项资助课题 (200803034)
作者简介 :庞会利 (19822) ,女 ,河南洛阳人 ,博士研究生 ,主要从事乳酸菌的分类鉴定及应用研究工作 ;秦广雍 3 ,通讯作者。
乳酸菌是利用可发酵糖产生大量乳酸的革兰氏阳性用 AP I50CHL 体系分析了 317株可能为乳酸菌的菌株 , 只
细菌的通称。乳酸菌是广义范畴的概念 ,是非正式、非规有 38%分离株被鉴定到种的水平。W IJTZES T等 [4 ]利用
范的细菌分类学名称 [1 ] 。当前 ,乳酸菌产品以其独特的生 2种碳源发酵测试体系也未能将 14 种乳酸菌分离株鉴定
通过设计特异性的引物在一定条件下通过聚合酶链式反应选择性的特异扩增特定的靶 DNA 片段 ,理论上讲可以在任何分类水平上对微生物菌株进行区别和鉴定。虽然特异性扩增靶 DNA 片段可以快速准确地在种和亚种甚至菌株水平鉴定乳酸菌 ,但是需要较复杂的引物设计策略 ,并鉴定引物的有效性后才能获得一系列有效的引物。因此这种方法只有在对检测和鉴定的菌株完全了解的情况下 ,才最为有效和实用。 21212 基因组短重复序列标记
这类标记主要是指基因组中的分散保守重复 DNA 元件 ( Interspersed Conserved Repetitive DNA Elements) ,依据它们在整个细菌基因组 DNA 中存在多个拷贝进行引物设计。现在已有 3类重复性元件得到了确认 ,即重复基因外回文序列 ( Repetitive Extragenic Palindrom ic Sequences,
专论与综述

分析食品检验中乳酸菌的鉴定方法

分析食品检验中乳酸菌的鉴定方法作者：曹敬慧来源：《科学与财富》2019年第09期摘要：近年来，随着人民生活水平的不断提升，人们对于食品安全问题的重视程度也随之不断提升。

食品检验与人民的身体健康和生命安全有着极为密切的关系，完善现有的食品检验标准和方式是十分必要的。

本文就针对食品检验中乳酸菌的鉴定方法进行了简要的探讨分析，立足于我国当前的乳酸菌鉴定标准，分析在食品检验过程中实用性较强的乳酸菌鉴定方法，希望可以为保证食品安全贡献一份力量。

关键词：食品检验;微生物检测技术一、引言常见的乳酸菌包括多个种类，且应用较为广泛。

乳酸菌不仅可以改善食物的味道，同时也可以提升食品的营养价值，延长其储存时间。

它们不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。

在我们日常生活中，经常食用的食品当中都有乳酸菌的存在。

摄入一定量的乳酸菌，一方面可以改善人体的肠道功能，另一方面也可以降低人体内的血清胆固醇，从而起到保障人体健康、预防各类疾病的作用。

在对乳酸菌进行鉴定时，应当依据乳酸菌的不同形态以及其生物特性进行具体的划分，并有针对性地采取适当的鉴定方法，从而确保鉴定结果的精准性和可靠性。

二、乳酸菌的鉴定简单来说，乳酸菌就是一种可以充分利用可发酵碳水化合物而形成的乳酸细菌，乳酸菌种类多样，且在人们日常的生活中发挥着较为重要的作用。

当前阶段已知的乳酸菌类型已达数百种，大部分乳酸菌都可以起到改善人体机能的作用。

我们可以将乳酸菌细分为动物源乳酸菌以及植物源乳酸菌两大类。

对比两类乳酸菌，人体在摄入乳酸菌时，对于植物源乳酸菌具备更强的吸收能力。

加之，植物乳酸菌的活性明显强于动物乳酸菌，因而在各类食品的生产过程中，往往更加青睐于使用植物乳酸菌。

乳酸菌鉴定，简单来说，就是指通过以不同种类的乳酸菌形态及其他特性为基础，充分利用先进的检验方法，分析乳酸菌的类型以及其中含有的各类元素。

乳酸菌的鉴定

乳酸菌的鉴定吲哚试验1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。

3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2 ml ,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。

糖发酵试验1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。

将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。

3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。

培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。

1.2.3 乳酸的检测选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10 ml于试管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。

1.结果和分析2.1 乳酸菌的分离提纯在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下观察到了链球状和杆状两种形状（如图一2.2乳酸菌的鉴定该菌种的菌落为圆形稍扁平的黄色菌落，有杆状和链球状两种形状。

在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。

说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。

也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证明为阳性。

在糖发酵试验中，在加入葡萄糖的发酵培养液中加入菌种后，培养液变为黄色，反应结果为阳性，且杜氏小管内无气泡（如图三）；加入蔗糖的发酵培养液中加入菌种后的反应结果也为阳性且杜氏小管内无气泡（如图四）。

乳酸菌的简介

乳酸菌的简介一、乳酸菌的起源根据圣经旧的书上记载，公元前4000多年，人类已经开始发酵乳酸肉制品及蔬菜腌渍物。

直到公元1857年，巴斯德(Pasteur)发现酸乳(sour milk)中有微小生物体存在，将其定名为”levue lactique”，发酵乃微生物作用所致的秘密才首次得以揭露；这是发现乳酸菌的开端。

1873年李斯特(Lister)利用稀释法，由酸乳中纯化分离出Bacterium lactis，也就是目前的Lactococcus lactis，这是乳酸菌最早被分离出来的纪录(廖,1998；李,2000)。

二、乳酸菌的定义乳酸菌一般是指能将碳水化合物发酵分解为乳酸的细菌群(佐佐木隆,1998)。

乳酸菌群具有以下几点特性：1.为革兰氏阳性(gram positive)球菌或杆菌。

2.不产生孢子(nonsporting)且无运动性(nonmotile)3.不具分泌催化酶(catalase negative)之能力。

4.可在有氧环境生长，但以无氧状态下生存较佳，亦有绝对厌氧者。

5.需有碳水化合物、胺基酸、维生素等多种生长因子方能生长之复合营养需求性(complex nutritional requirements)。

6.依代谢途径与最终产物的不同，可分为同质发酵(homofermentative)及异质发酵(heterofermentative)两种乳酸菌。

同质发酵性乳酸菌含有aldolase，最终产物90％-100％为乳酸；异质发酵性乳酸菌具有phosphoketolase，其最终产物除了40％-50％的乳酸外，还包括乙醇、二氧化碳及醋酸等多项产物(Ingledew,1995)。

乳酸菌普遍存在动物体消化道中，因耐酸性佳且可分泌乳酸及抗菌物质等有利于生存的条件，故消化道三大菌群当中最占优势(Nemcova et al. 1997)三、乳酸菌的分类乳酸菌一般包括Lactobacillus (L)、Leuconostoc (Leuc.)、Streptococcus (S)及Pediococcus (Ped.)四属；广义的乳酸菌尚包括Bifidobacterium与Sporolactobacillus 两个属(Jay, 2000)。

3种乳酸菌鉴定、筛选、富硒比较研究

ａｎｄｔｈｅｎｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｄｏｍｅｓｔｉｃａｔｅｄ（ｔｈｅｍｅｄｉａｓｈｏｕｌｄｆｏｒｍｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）．Ｔｈｅ３，３
ａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｓｅｌｅｎｉｕｍｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．ＴｈｅｒｅｓｕｈｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｒｄｅｒｏｆｓｅｌｅｎｉｕｍｔｏｌｅｒａｎｃｅｗａｓＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ，ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｉｕｓｔｈｅｒｍｏｐｉｌｅｓａｎｄＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｂｕｌｇａｒｉａ．Ｗｈｅｎｔｈｅｓｅｌｅｎｉｕｍｃｏｎｔｅｎｔｗａｓ１７Ｉ￣ｇ］ｍＬ．ｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｆｏｒ９ｈｕｎｄｅｒ３７℃ ．ｔｈｅｓｅｌｅｎｉｕｍｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｒａｔｅｏｆＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓｒｅａｃｈｅｄ６５．４％．Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓｃｏｌｏｎｉｅｓｗｅｒｅｇｅｎｅｒａｌｌｙｆｏｕｎｄｔｏｂｅｒｅｌａｔｉｖｅｌｙｓｍａｌｌ，ｉｒｒｅｇｕｌａｒｌｙｒｏｕｎｄｅｄ，ｍｉｌｋｙｗｈｉｔｅ，ｓｍｏｏｔｈａｎｄｓｈｉｎｙｏｎｓｅｌｅｎｉｕｍ —ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｍｅｄｉａ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ；Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ；ｓｅｌｅｎｉｕｍｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ｓｅｌｅｎｉｕｍｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ
自然界中的硒主要以有机、无机两种形态存在，无机硒通过被动扩散方式吸收，其生物有效性低，毒性大，而有机硒通过主动运输方式吸收，速率远高于无机

GB4789. 35乳酸菌检验

乳酸菌计数
乳杆菌计数乳酸菌总数结果减去双歧杆菌与嗜热链球菌计数结果之和即得乳杆菌计数。
报告（GB/T4789.35-2008）
根据菌落计数结果出具检测报告。最终确定的乳酸菌菌落在30～300之间的平板计数，再乘以相应的稀释倍数，修约保留两位有效数字，之后的数字，采用10的指数表示。参照GB/T 4789.2规定。每克（或毫升）食品中所含有的乳酸菌数以CFU/g（mL）表示。
结果的表述
7.4.1 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每g（mL）中菌落总数结果。 7.4.2 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式（1）计算：
7.4.3 若所有稀释度的平板上菌落数均大于300 CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 7.4.4 若所有稀释度的平板菌落数均小于30 CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。 7.4.5 若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1 乘以最低稀释倍数计算。 7.4.6 若所有稀释度的平板菌落数均不在30 CFU～300 CFU 之间，其中一部分小于30 CFU 或大于300CFU 时，则以最接近30 CFU 或300 CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。
2010版
样品制备
7.1.3 固体和半固体食品：以无菌操作称取25 g 样品，置于装有225 mL 生理盐水的无菌均质杯内，于8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，制成1:10 样品匀液；或置于225 mL 生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min 制成1:10 的样品匀液。 7.1.4 液体样品：液体样品应先将其充分摇匀后以无菌吸管吸取样品25 mL 放入装有225 mL 生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振摇，制成1:10 的样品匀液。

乳酸杆菌分级

乳酸杆菌分级摘要：1.乳酸杆菌的概述2.乳酸杆菌的分级标准3.乳酸杆菌的分级对食品工业的影响4.我国乳酸杆菌分级的研究现状和未来发展正文：1.乳酸杆菌的概述乳酸杆菌（Lactic Acid Bacteria，简称LAB）是一类能将糖发酵产生乳酸的细菌，广泛存在于自然界和人体肠道中。

乳酸杆菌具有多种生理功能，如产生乳酸、抑制有害菌生长、增强机体免疫力等，因此在食品、保健品和药品等领域具有广泛应用。

2.乳酸杆菌的分级标准乳酸杆菌的分级主要依据其生理特性、代谢产物、生长条件等因素进行分类。

常见的分级标准包括：（1）按照乳酸杆菌的代谢类型分为乳酸发酵型和酒精发酵型；（2）按照生长温度分为低温型、中温型和高温型；（3）按照对氧气的需求分为需氧型、微需氧型和厌氧型；（4）按照产生的乳酸类型分为L 型和D 型。

3.乳酸杆菌的分级对食品工业的影响乳酸杆菌的分级对于食品工业具有重要意义，因为不同类型的乳酸杆菌具有不同的发酵特性和产物，可以应用于多种食品的生产。

例如：（1）乳酸发酵型乳酸杆菌可用于制作酸奶、豆腐乳等发酵乳制品；（2）酒精发酵型乳酸杆菌可用于制作泡菜、酸菜等发酵蔬菜；（3）不同生长温度的乳酸杆菌可用于制作不同类型的发酵食品，如低温型乳酸杆菌适用于制作冷藏食品，高温型乳酸杆菌适用于制作室温保存的发酵食品。

4.我国乳酸杆菌分级的研究现状和未来发展我国乳酸杆菌分级研究取得了显著成果，已经建立了较为完善的乳酸杆菌分类体系。

在未来发展中，我国应继续加大乳酸杆菌分级研究力度，深入挖掘乳酸杆菌的生物学功能和应用潜力，为食品工业提供更多优质、高效的乳酸杆菌菌种资源。

乳酸菌的鉴定

乳酸菌的鉴定吲哚试验1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。

糖发酵试验1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。

将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。

3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。

培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。

在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。

说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。

也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证明为阳性。

乳酸菌的筛选与鉴定流程

乳酸菌的筛选与鉴定流程1.材料首先要确定目标，即所筛选的乳酸菌来自哪里，例如想要筛选一株果蔬发酵乳酸菌，那我们就得找一个产区或者其他地方自然发酵果蔬的样品。

1.1培养基查找相关文献，菌种生化鉴定用培养基建议查看文献：工业微生物实验手册MRS培养基：牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，吐温801g/L，葡萄糖50 g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，溴甲基酚紫0.4 g/L，酵母提取物5 g/L，琼脂15～20 g/L，pH 6.3～6.7，121 ℃湿热灭菌30 min。

（PS：若自己嫌麻烦，可买现成的MRS培养基）初筛培养基：在MRS分离培养基的基础上，添加0.5%碳酸钙，乳酸调至PH2.0.（加碳酸钙是为了能更好的挑出优势菌，乳酸调至PH2.0也是同样道理）如图：若是乳酸菌菌落旁会有清晰可见的透明圈，这是由于乳酸与碳酸钙反应了。

高盐复筛培养基∶在MRS分离培养基的基础上，添加10%氯化钠和0.5%碳酸钙。

高糖复筛培养基∶在MRS分离培养基的基础上将葡萄糖质量分数提高到30%，添加0.5%碳酸钙。

明胶培养基∶蛋白胨25 g/L，牛肉膏7.5 g/L，氯化钠5g/L，明胶100 g/L，pH7.0～7.2，121∶湿热灭菌15 min。

果蔬发酵培养基∶将苹果、胡萝卜、西瓜、西红柿等水果、蔬菜清洗去皮切分后分别榨汁除渣制得发酵果酱，然后按1∶1∶1∶1比例混合经巴氏灭菌后4 ∶冷藏。

按照混合果蔬汁33.3%、葡萄糖5%、蔗糖5%、氯化钙0.5%、磷酸氢二钠0.05%、磷酸二氢钠0.05%、硫酸镁0.03%、柠檬酸0.1%的配比配制，除果蔬和柠檬酸外其余成分于115 ∶湿热灭菌15 min。

2.方法2.1乳酸菌的分离筛选取产区自然发酵苹果原浆，用0.9%灭菌生理盐水进行10 倍梯度稀释后，吸取适宜稀释度溶液涂布至MRS分离培养基中，37 ∶恒温厌氧培养24h，挑取菌落黄色范围大并具有乳酸菌典型特征的单菌落，进行革兰氏染色观察菌体形态。

《抗真菌特性乳酸菌的筛选鉴定及在酸奶防腐中的应用》范文

《抗真菌特性乳酸菌的筛选鉴定及在酸奶防腐中的应用》篇一一、引言近年来，随着人们对食品安全的关注度不断提高，寻找具有天然防腐特性的食品添加剂已成为食品工业研究的热点。

乳酸菌作为一种常见的益生菌，除了具有调节肠道菌群平衡、促进消化等作用外，还具有显著的抗真菌特性。

本文旨在筛选具有抗真菌特性的乳酸菌，对其进行鉴定，并探讨其在酸奶防腐中的应用。

二、材料与方法1. 材料（1）样品来源：从不同发酵食品中采集乳酸菌样品。

（2）培养基：MRS培养基、抗真菌培养基等。

（3）实验仪器：恒温摇床、显微镜、PCR仪等。

2. 方法（1）乳酸菌的分离与纯化：采用梯度稀释法分离乳酸菌，并利用划线法进行纯化。

（2）抗真菌特性筛选：将筛选出的乳酸菌与常见真菌进行共培养，观察其抗真菌效果。

（3）乳酸菌鉴定：利用分子生物学技术，如16S rRNA基因序列分析等，对筛选出的乳酸菌进行鉴定。

（4）酸奶制备及防腐实验：将鉴定后的乳酸菌添加到酸奶中，观察其防腐效果。

三、实验结果1. 抗真菌特性乳酸菌的筛选与鉴定通过共培养法，我们从样品中筛选出具有抗真菌特性的乳酸菌。

经过分子生物学鉴定，确定其种类及特性。

结果表明，筛选出的乳酸菌对多种常见真菌具有显著的抑制作用。

2. 酸奶制备及防腐实验将鉴定后的乳酸菌添加到酸奶中，观察其防腐效果。

实验结果表明，添加了抗真菌特性乳酸菌的酸奶在储存过程中，其菌落总数和霉菌污染率均显著低于未添加乳酸菌的对照组。

这说明抗真菌特性乳酸菌在酸奶中具有良好的防腐效果。

四、讨论1. 抗真菌特性乳酸菌的筛选与鉴定本研究通过共培养法成功筛选出具有抗真菌特性的乳酸菌，并利用分子生物学技术进行了鉴定。

这为进一步研究乳酸菌的抗真菌机制及其应用提供了基础。

此外，这些抗真菌特性乳酸菌的发现也为开发新型天然防腐剂提供了新的思路。

2. 酸奶防腐应用将抗真菌特性乳酸菌添加到酸奶中，可以有效降低酸奶在储存过程中的菌落总数和霉菌污染率，提高酸奶的品质和安全性。

探讨食品检验中乳酸菌的鉴定方法

FOOD INDUSTRY探讨食品检验中乳酸菌的鉴定方法+李曦胳佳岚王翌晨丨西安市产品质量监督检验院■《食品安全国家标准食品微生物学检验 "1/5乳酸菌检验》标准所示，乳酸菌（lactic acid bacteria，L A B)主要有乳杆菌、链球菌以及双歧杆菌三种菌属，并在食品、药品中广泛存在。

为响应国家对食品安全的监管，本文特从不同角度鉴定食品中的乳酸菌菌种水平，详细研究过程如下：资料与方法一般资料。

本次研究所有菌种均采自某市微生物菌种保藏中心，共计15株。

其中乳酸杆菌6株，双歧杆菌7株，链球菌2株。

鉴定仪器：（1 )API鉴定系统、API 50 CHL板条、API 20A板条（生产厂家：法国生物梅里埃公司）；（2 )RP耗材样品制备包（生产厂家：美国杜邦公司）；（3) 生化管（生产厂家：杭州滨和微生物）；(4 )R iboprinter^：_a微生物基因指纹鉴定系统（生产厂家：美国Dupont公司）；（5 ) Quantity O ne紫外成像仪、电泳仪（生产厂家：美国BioRad公司）；（6 )Veritii PCR扩增仪（生产厂家：美国ABI公司），体积为 50 n L[2]。

鉴定试剂：（1)细菌基因组D N A 提取试剂盒（生产厂家：北京天根生物）；（2 )DNA M ark er、PC R缓冲体系 (缓冲液5 m L,含M gC12 )以及rTaqDNA 聚合酶（生产厂家：大连宝生物工程有限公司）0.25u L;(3)正向引物27F (5’ -AGAGnTGATCCTGGCrCAG-3，）、反向引物1492R(5’-TACGGCDWXTTGTIACIT-3，)各200pmol/L。

鉴定方法。

染色镜检：根据《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》中乳酸菌的生化反应指标，筛选单菌落革兰染色镜检。

根据《食品安全国家标准食品微生物学检验双歧杆菌的鉴定》检验双歧杆菌。

乳酸菌的分离与初步鉴定

学院：漓江学院年级专业：09生物技术组员：吴汉川200913007005杨隆荷200913007006李翠200913007007王志远200913007008乳酸菌的分离及初步鉴定一、实验目的1了解和掌握放线菌的菌种特性和分离方法2初步掌握军中筛选方法设计3掌握平菌种的选育二、实验原理乳酸菌是指以糖为原料，属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科。

乳酸细菌科根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。

在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光的溶滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO3解圈。

乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。

乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。

乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。

平板涂布法平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。

生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。

四、实验器材与试剂含乳酸菌的酸奶、结晶紫、卢哥氏碘液、95%乙醇、蕃红溶液、灭菌CaCO3粉末、NaCl；BCG牛乳培养基：(A)溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.C.G)乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。

(B)溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g, pH6.8, 121℃湿热灭菌20min。

以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。

1000ml烧瓶一个, 无菌培养皿9个, 500ml容量三角瓶2个，25ml无菌移液管1只，20ml无菌试管7只，1ml无菌移液管6只，培养基分装器一个，玻棒2根, 无菌涂布器3只，酒精灯一盏，接种环一个，天平，牛角匙，漏斗，漏斗架，载玻片，盖玻片，pH试纸若干，液体石蜡，棉塞，吸管，牛皮纸，线绳、标签等。

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。

为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。

营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。

在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。

乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。

当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类时，SL培养基常用作为选择性培养基。

对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。

M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。

其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无鞭毛。

粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径~μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。

革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。

在MRS 培养基上菌落小，呈白色。

沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。

分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。

乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。

分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。

也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。

一.筛选方法：1.溶钙圈法：利用一些产酸类细菌在含CaCO3的培养基上产生CaCO3溶解圈，从而筛选出这些产酸类细菌，可用于乳酸菌的筛选。

其中培养基中加入CaCO3的作用是：①鉴别能产生酸的细菌；②中和产生的酸，以维持培养基的PH。

筛选过程：样品预处理→梯度稀释至10-6→选择合适的稀释度涂布→37℃培养48h→挑选产生溶钙圈的菌落反复在MRS培养基上划线→挑起单菌落染色，经镜检确认为纯种→挑选革兰氏阳性单菌落→试管穿刺4℃冰箱保存。

乳酸菌的分类鉴定

（二）基于rRNA序列的分子标记技术
原核生物rRNA有3种类型：23srRNA、 16srRNA 、5srRNA，对应约含有2900、 1540、120个碱基。rRNA 结构既具保守性又具高变性。保守性反映生物物种的亲缘关系, 高变性则揭示生物物种的特征核酸序列, 是属种鉴定的分子种间特异性PCR
鉴定：快速准确地在种和亚种甚至菌株水平鉴定乳酸菌；优缺点：引物设计较为复杂，只有在对鉴定菌株完全了解的情况下才实用；
分离株（球菌） ↙ ↘
链状
↙ 同型发酵 ↘ 异型发酵
四联
↙ 过氧化氢酶 ↘ 过氧化氢酶
↓
Streptococuus Enterococcus Lactococcus Streptococcus
↓
Leuconostoc
（+）
（-）
↓
Pediococcus
↓
非乳酸菌
以明串珠菌属为例，介绍种的鉴定
异性发酵乳酸链状球菌 Leuconostoc
↘
重复种的鉴定 ↓ DNA同源性 ↓ 判定种
共通项目（16项）：
1.生长状态观察 2.革兰氏染色 3.细胞的形态观察 4.H2O2酶试验 5.硝酸盐还原试验 6.石蕊牛乳试验 7.明胶液化试验 8.运动性试验 9.葡萄糖产气试验 10.pH生长试验 11.温度生长试验 12.糖发酵试验 13.发酵蔗糖产葡聚糖 14.发酵类型 15.乳酸旋光性 16.细胞壁中肽聚糖类型 17.精氨酸产气 18.耐盐性、好盐性试验

注：方框框起来的是用一般生理生化试验区分比较困难的，需进一步做分子水平的鉴定；
二、分子水平的鉴定

基于PCR的DNA指纹图谱技术基于rRNA序列的分子标记技术

乳酸菌鉴定

都要求无菌操作菌种的分离取lmL卤汁以10倍递增稀释方法（一份酸奶，九份无菌水，再取一份第一只管中溶液，加九份无菌水，依次类推），将其稀释至1/10～10的-10次幂（我打不上去），然后从不同浓度稀释液中分别取lmL倾注在平皿中，再倒入培养基相混合，待培养基凝固后倒置于30~C 恒温下培养48h。

挑取长势良好的单个茵落划线分纯，直至纯化(茵落单个大小一致，革兰氏染色镜检，茵体一致)。

结果分离得到3株不同菌株，分别编号为菌株1、菌株2、菌株3。

再分别转移到试管斜面上进行保存。

分离用培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1 000 mL，琼脂20g，pH7．0—7．2；保存用斜面培养基：酵母膏1％，碳酸钙2％，葡萄糖1％，琼脂2％，pH 7．0。

培养条件将分离出的菌株1、菌株2、菌株3分别接种在上述4种不同的培养基上，在30℃恒温条件下培养48h后观察并测定其培养结果。

测定方法菌落总数采用逐级稀释法来计数；pH值用pHS一2C酸度计测定；乳酸定性及含量测定依据食品检验技术1I．2．1乳酸菌的分离与筛选的试验程序自然发酵酸菜汁液一稀释一培养一挑起单菌落染色、镜检一挑选革兰氏阳性球菌单菌落一Ⅲ号培养基一挑选溶钙圈大的球菌反复在Ⅲ号培养基上几次纯化筛选一单菌落优良菌株一试管穿刺低温保存。

1．2 1．2 乳酸菌的鉴定用光学显微镜、放大镜进行乳酸菌的形态特征鉴定。

生理生化特征鉴定：产乳酸定性试验——乳酸纸层析法0- 、过氧化氢酶(接触酶)反应⋯、明胶水解反应、硫化氢反应、乳酸菌发酵营养型试验0 、耐盐、酸、温度试验。

1．2．I．3 乳酸菌的保存⋯采用定期移植低温保藏法。

培养基配方：葡萄糖1％、蛋白胨0 2％、l(}l2PQ|0．2％、琼脂20％、pH值7 0，分装试管，121。

c灭菌30min。

将使用对数生长期后期的细胞进行穿刺培养，然后密封存于冰箱玲藏室内(5qc左右)，2个月移植1次。

1．2．2 分离乳酸菌的生理特点试验1 2 2．1 最适生长温度的测定OD值以同温下不接种培养基作对照，定期取出接种培养基在721分光光度计上，用最大吸收光波长=6001RIifl测定。

乳酸菌的鉴定

乳酸菌的鉴定吲哚试验1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。

糖发酵试验1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。

将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。

3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。

培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。

在吲哚试验中，加入菌种的试管无任何变化，证明为阴性反应（如图二）。

说明该菌不具有分解色氨酸产生吲哚的能力。

也说明此菌种不是大肠杆菌，因为大肠杆菌的吲哚试验证明为阳性。

酸奶发酵过程中乳酸菌菌株的筛选与鉴定

酸奶发酵过程中乳酸菌菌株的筛选与鉴定酸奶是一种由牛奶或者其他乳制品通过乳酸菌的发酵而制成的食品。

乳酸菌是酸奶发酵的关键因素，具有良好的保健效果和口感。

在酸奶制作过程中，乳酸菌菌株的筛选与鉴定是非常重要的步骤。

本文将介绍酸奶发酵过程中乳酸菌菌株的筛选与鉴定的方法和意义。

首先，乳酸菌菌株的筛选是为了选择出适合酸奶发酵的优质菌株。

在酸奶制作中，菌株的特性包括产酸能力、耐受性、生长速度和抗菌特性等多方面。

通过筛选过程，可以找到产酸量高、生长快速、对不良菌有抑制作用的优质菌株。

这些菌株可以在酸奶制作中快速发酵，产生出优质的酸奶。

乳酸菌菌株的筛选方法有很多种，常见的包括传统筛选法、分子筛选法和生理筛选法等。

传统筛选法是指利用一系列的生理、生化和形态特性对菌株进行初步筛选。

通过这种方法，可以初步判断菌株是否具有发酵酸奶的潜力。

分子筛选法则是通过利用分子生物学技术对乳酸菌菌株进行检测，例如PCR扩增、16S rRNA测序等。

这些方法可以对菌株的遗传信息进行分析，从而确定其种属和亲缘关系。

生理筛选法则是根据菌株在不同环境条件下的生长情况，筛选出适应性强、产酸能力高的菌株。

乳酸菌菌株的鉴定是为了确保酸奶发酵过程中使用的菌株的纯度和品质。

鉴定的目的是确定菌株的种属和亚种，以及其在酸奶制作中的适用性。

鉴定的方法多样化，常用的有生化鉴定法、微生物学鉴定法和分子生物学鉴定法等。

生化鉴定法是利用菌株在特定培养基和条件下的代谢特征进行分析，通过菌株对不同物质的反应情况来确定其种属。

微生物学鉴定法则是通过观察菌株的细胞形态、培养特性等进行判断。

分子生物学鉴定法则是通过测序菌株的特定基因序列，例如16S rRNA，来确定菌株的种属和亲缘关系。

乳酸菌菌株的筛选与鉴定在酸奶发酵过程中具有重要的意义。

通过合适的筛选和鉴定方法，可以保证酸奶发酵的质量和稳定性。

优质的菌株不仅可以提高酸奶的口感和品质，还具有益生菌的功能，对消化系统和免疫系统有益。