乳酸菌的分类鉴定

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乳酸菌的分类鉴定综述

（二）基于rRNA序列的分子标记技术
原核生物rRNA有3种类型：23srRNA、 16srRNA 、5srRNA，对应约含有2900、 1540、120个碱基。rRNA 结构既具保守性又具高变性。保守性反映生物物种的亲缘关系, 高变性则揭示生物物种的特征核酸序列, 是属种鉴定的分子基础。
1.16srDNA
标准菌株: 各种生化特性已研究清楚的标准菌株，可用于检测试验的准确性和可靠性。
乳酸菌的分属
分离菌株（G+杆菌） ↙ ↘ 过氧化氢酶（-）过氧化氢酶（+） ↙ ↘ ↓ 芽孢（+）芽孢（-）非乳酸菌 ↓ ↙ ↘ Sporolactobacillus 同型发酵异型发酵 ↓ ↓
Lactobacillus Lactobacillus Lactobacillus Carnobacterium

通过用特定引物进行PCR扩增，测序后获得16srDNA的部分或全部序列，再与数据库中序列数据进行比对，分析其在发育树中的位置； 400~600碱基的序列足以对环境中微生物的多样性和种群分类进行初步的估计, 但这样短的序列通常不能用于新物种鉴定和探针设计。
鉴定：属种水平，不能鉴定种内；Βιβλιοθήκη Baidu

一、生化鉴定：两歧法
鉴定对象株 ↓共通项目：共16项实验结果记录 ↓ 属间鉴定项目（定属） ↓ 种间鉴定项目 ↙ ↘ 判定种不能判定种

乳酸菌的分离、纯化与鉴定

第一部分：乳酸菌的分离、纯化

一、实验器材：

1. 实验药品新鲜乳酸饮料（市售）、脱脂奶粉、蔗糖、1.6%溴甲酚绿乙醇溶液（溴甲酚绿、无水乙醇）、酵母膏、琼脂、革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、 95%L 醇、沙黄）、15/乙醇、香柏油、1mol/L NaOH、1mol/L HCI、碳酸钙；0.4gNaOH固体、4.2ml浓HCL（分析纯）、20gCaCO3固体、酵母膏20g、琼脂30g 香柏油、脱脂奶粉100g、蔗糖10g ；

2. 仪器与设备高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、培养箱、 pH试纸、酸乳瓶、培养皿（©9或© 12）、试管、300ml三角瓶（带玻珠）、移液管、天平、500ml 锥形瓶、250ml 锥形瓶、250ml烧杯。

二、实验步骤：

1. 培养基配制（BCG牛乳培养基）：

（A）溶液：取脱脂乳粉100g,水500ml,加入1.6%溴甲酚氯乙醇溶液1ml, 混合均匀后分装入三角瓶于高压蒸汽灭菌锅 80C灭菌20 min ; （1.6%溴甲苯酚绿（BCG 乙醇溶液用1.6g溴甲酚绿加入20ml无水乙醇中，再加水至100ml制成）（B）溶液：酵母膏10g，水500ml, CaCO3 10g琼脂20g,加热溶解，用精密pH 试纸调节pH到6.8，分装入三角瓶后在103kPa 121 T高压蒸汽灭菌 20Mi n。

以无菌操作趁热将（A）（B）溶液均匀混合。

2. 药品配制

2.1结晶紫：结晶紫乙醇饱和液（结晶紫 2g溶于20ml 95%^醇中）20ml, 1%莊酸氨水溶液80ml。将两液混匀，放置24小时后过滤即可。

食品中乳酸菌的筛选与活性鉴定

乳酸菌是一类对人体健康具有益处的细菌，在许多食物中都可以找到它们的踪迹。从酸奶到发酵食品，乳酸菌都发挥着重要的作用。然而，如何筛选出具有较高活性的乳酸菌，并对其进行鉴定，这是一个令人感兴趣的话题。

首先，我们需要选择适当的食品样本进行筛选。常见的食品包括酸奶、奶酪、

纳豆等发酵产品。这些食品中含有大量的乳酸菌，因此是我们进行筛选的理想选择。此外，还可以考虑其他一些食物，如蔬菜和肉类，它们也可能含有乳酸菌。

接下来，我们需要从样本中分离出乳酸菌。这可以通过培养基选用和分离培养

来实现。培养基的选用非常重要，它应提供乳酸菌所需要的营养物质。我们可以选择常用的乳酸菌培养基，如MRS培养基。通过将样品接种于MRS培养基中，我

们可以让乳酸菌生长并形成可见的菌落。然后，通过将这些菌落转移至其他培养基中，可以进行单菌落分离，确保我们获得的是纯种的乳酸菌菌株。

鉴定乳酸菌的活性也是我们的重点之一。活性乳酸菌可以产生乳酸、酶和抗菌

物质，这些物质对人体健康有益。因此，我们想要筛选出活性较高的乳酸菌菌株。常见的活性鉴定方法包括测定乳酸产量、酶活性和抗菌活性。

乳酸产量是乳酸菌活性的重要指标之一。我们可以通过高效液相色谱法（HPLC）来测定乳酸的含量。通过将培养基或发酵物转移到HPLC系统中，我们

可以分析出乳酸的浓度。通过与不同菌株之间的比较，我们可以确定哪些菌株产乳酸的能力更强。

酶活性是另一个衡量乳酸菌活性的重要指标。乳酸菌常常能够产生多种酶，如

蛋白酶和纤维素酶。我们可以使用相应的酶活性试剂盒来检测其酶活性。高酶活性的乳酸菌意味着它们能够更好地消化蛋白质和纤维素，从而提高食物的可消化性和营养吸收能力。

乳酸菌的分类鉴定

3.扩增片段长度多态技术（AFLP）优缺点：重复性好，分辨率高，在亚种和菌株水平上对菌株进行鉴定；对操作和设备要求高； 4.基因组简单重复序列PCR标记（Re-PCR）优缺点：重复性好，可在亚种和菌株水平上对菌株进行快速而准确的分类和鉴定；
5.变性梯度凝胶电泳/温度梯度电泳（DGGE/TGGE）优缺点：DNA用量小，重复性好，但通常只能检测微生物群落中数量大于一定值得优势种群。

（三）种间特异性PCR
鉴定：快速准确地在种和亚种甚至菌株水平鉴定乳酸菌；优缺点：引物设计较为复杂，只有在对鉴定菌株完全了解的情况下才实用；

引物：
通用引物（肠道细菌及其相关细菌） F:ccgaattcgtcgacaac R:agagtttgatcatggctcac 全长引物（扩增产物约为1500bp） F：agagtttgatcctggctcag R：aaggaggtgatccagcc
2.16~23srDNA
不同菌株16~23srDNA基因间隔区有相当好的保守性，同时比16srDNA具有更强变异性；鉴定：可用于种以下水平的分类鉴定，弥补了16srRNA不能鉴别同源性高菌株的缺陷；
（二）基于rRNA序列的分子标记技术
原核生物rRNA有3种类型：23srRNA、 16srRNA 、5srRNA，对应约含有2900、 1540、120个碱基。rRNA 结构既具保守性又具高变性。保守性反映生物物种的亲缘关系, 高变性则揭示生物物种的特征核酸序列, 是属种鉴定的分子基础。

乳酸菌定义分类、分离筛选及应用

采样
选择适合目的菌生长的培养基及培养条件 37℃培养48h，厌氧培养
富集培养
采样用具：灭菌采样地点：根据乳酸菌生理习性选取乳汁、消化道、发酵食品
分离纯化
梯度稀释（ 10-5 / 10-6 / 10-7 ）平板涂布法/平板划线分离法挑取单菌，镜检（形态，G+，H2O2-）试管穿刺4℃保存
希腊史诗“独眼巨人” 以器皿盛满乳清、架上堆满干酪贾思勰的《齐民要术》记载酸奶的制法、成吉思汗令士兵携带酸奶，保证健康
1919年，克拉索创建酸奶生产工厂给商品命名为“达能”
1930年，代田博士分离到乳酸杆菌，命名为代田株——养乐多
2、定义
乳酸菌是一类无芽孢、革兰氏染色阳性细
菌的总称。凡是能发酵葡萄糖或乳糖产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。这是一群相当庞杂的细菌，目前至少可分为18个属，共有200多种。
乳酸菌概述
高洁
发酵
霉菌
酵母菌
醋酸菌
乳酸菌
乳酸菌概述
发展史
定义
分类学地位
分离鉴定
应用领域
1、发展史
圣经《创世纪篇》亚伯拉罕以甜奶及酸奶款待三位天使
1857年，巴斯德用显微镜观察到了乳酸菌 1878年，李ห้องสมุดไป่ตู้特从酸败的牛奶中分离出乳酸乳球菌 1905年，戈里戈罗夫从酸奶中分离到“保加利亚乳杆菌”

乳酸菌检测报告

引言

乳酸菌是一类广泛存在于自然界和人体内的细菌，以革兰氏阳性菌为主，能够发酵碳水化合物并产生乳酸。乳酸菌具有许多益生作用，如改善肠道菌群平衡、增强免疫力、促进食物消化等。因此，对乳酸菌进行检测具有非常重要的意义。本报告旨在介绍乳酸菌检测的方法和结果。

检测方法

样品收集

乳酸菌检测的样品可以包括食品、饮料和生物样本等。收集样品时，首先需要保持卫生条件，避免外界环境的污染。然后，选择合适的容器收集样品，并尽快送至实验室进行分析。

菌落计数

菌落计数是一种常用的乳酸菌检测方法。该方法通过将合适稀释的样品涂布在琼脂平板上，经培养后根据菌落的数量进行计数。具体步骤如下：

1.将样品进行系列稀释，以获得合适的菌落计数范围。

2.取适量的稀释液，均匀涂布在琼脂平板上。

3.将平板倒置放置在恒温培养箱中，通常在30-37摄氏度下培养24-48

小时。

4.检查平板上的菌落数量，并根据菌落的形态和颜色等特征进行初步鉴

别。

5.计算菌落计数值，并根据所在单位面积的菌落数量转换为CFU/mL。

PCR检测

PCR（聚合酶链式反应）是一种基因检测技术，可以通过扩增目标基因区域来间接检测乳酸菌。该方法适用于检测数量较少的乳酸菌，并可以对乳酸菌的种类进行鉴定。具体步骤如下：

1.收集样品，并进行细菌的提取。可以使用商用的细菌提取试剂盒，或

者自行制备细菌提取缓冲液。

2.通过PCR扩增目标基因区域。根据乳酸菌的保守序列设计引物，将

待检样品的DNA与引物进行反应，产生特定大小的DNA片段。

3.将PCR产物进行电泳分析。将PCR产物与DNA标记物一起加载到

乳酸菌检验方法

乳酸菌是指一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶

阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。这类细菌在自然界分布广泛，可栖居在人和各种动

物的口腔、肠道等器官内，在土壤、食品、饲料、水及一些临床标本中都有乳酸菌的存在。

乳酸菌在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的领域应用价值很高，相当多的乳酸菌对人、畜的健康起着有益的作用，但个别菌种能对人畜致病，乳酸菌主要包括23个属的细菌。

二样本采集

检样主要为含乳酸菌活菌的饮料和微生态制剂，样本应放入冰箱保存，心快检验。

三检验方法（中华人民共和国国家标准乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验GB／T 16347-1996）

乳酸菌菌总数的测定：乳酸菌菌落总数是指标样在一定条件下培养后，所得1ml检样中所含

乳酸菌菌落的总数。

（一）检验程序

乳酸菌菌落总数检验程序如下：

（二）培养基和试剂

改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）；改良MC培养基（modified Chalmers培养基）；

0.1％亚甲蓝牛乳培养基；6.5％氯化钠肉汤参照；pH9.6葡萄糖肉汤；40％胆汁肉汤；淀粉水

解培养基；精氨酸水解培养基；乳酸杆菌糖发酵管；七叶苷培养基；革兰氏染色液；3％过

氧化氢溶液；蛋白胨水、靛基质试剂；明胶培养基；硝酸盐培养基、硝酸盐试剂；生理盐水：定量分装于三角瓶和试管内灭菌。

（三）操作步骤

1．以无菌操作将经过充分摇匀的检样25ml（或25g）放入含有225ml灭菌生理盐水的来菌

广口瓶内做成1：10的均匀稀释液。

2．用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1m，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。

乳酸菌的筛选与鉴定流程

1.材料

首先要确定目标，即所筛选的乳酸菌来自哪里，例如想要筛选一株果蔬发酵乳酸菌，那我们就得找一个产区或者其他地方自然发酵果蔬的样品。

1.1培养基

查找相关文献，菌种生化鉴定用培养基建议查看文献：工业微生物实验手册MRS培养基：牛肉膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，吐温801g/L，葡萄糖50 g/L，乙酸钠5g/L，硫酸镁0.2 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，溴甲基酚紫0.4 g/L，酵母提取物5 g/L，琼脂15～20 g/L，pH 6.3～6.7，121 ℃湿热灭菌30 min。（PS：若自己嫌麻烦，可买现成的MRS培养基）

初筛培养基：在MRS分离培养基的基础上，添加0.5%碳酸钙，乳酸调至PH2.0.（加碳酸钙是为了能更好的挑出优势菌，乳酸调至PH2.0也是同样道理）如图：

若是乳酸菌菌落旁会有清晰可见的透明圈，这是由于乳酸与碳酸钙反应了。

高盐复筛培养基∶在MRS分离培养基的基础上，添加10%氯化钠和0.5%碳酸钙。

高糖复筛培养基∶在MRS分离培养基的基础上将葡萄糖质量分数提高到30%，添加0.5%碳酸钙。

明胶培养基∶蛋白胨25 g/L，牛肉膏7.5 g/L，氯化钠5g/L，明胶100 g/L，pH7.0～7.2，121∶湿热灭菌15 min。

果蔬发酵培养基∶将苹果、胡萝卜、西瓜、西红柿等水果、蔬菜清洗去皮切分后分别榨汁除渣制得发酵果酱，然后按1∶1∶1∶1比例混合经巴氏灭菌后4 ∶冷藏。按照混合果蔬汁33.3%、葡萄糖5%、蔗糖5%、氯化钙0.5%、磷酸氢二钠

乳酸菌的鉴定

吲哚试验

1）.试管标记：取装有蛋白胨水培养基的试管2支，分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔到标记乳酸菌的试管中，标记有空白对照的不接种，置37摄氏度恒温箱中培养24~48小时。

3）.观察记录：在培养基中加入乙醚1~2 ml ,经充分振荡，使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入5~10滴吲哚试剂，如有吲哚存在，乙醚层呈玫瑰色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性反应。

糖发酵试验

1）.试管标记：取分别装有葡萄糖，蔗糖发酵培养液试管各2支，每种糖发酵试管中分别标记乳酸菌和空白对照。

2）.接种培养：以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置试管中，置37摄氏度恒温培养箱中培养24小时，观察结果。

3）.观察记录：与对照管比较，若接种培养液保持原由颜色，其反映结果为阴性；如果培养液呈黄色，反映结果为阳性。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，杜氏小管内没有气泡为阴性反应。

1.2.3 乳酸的检测

选用已经分离的菌种做小型发酵实验，取发酵液的上清液约10 ml于试管中，加入10%硫酸1 ml ,再加2%高锰酸钾 1 ml ,此时乳酸转化为乙醛，把事先在含氨的硝酸银溶液中侵泡的滤纸条搭在试管口中，微火加热试管至沸，观察滤纸变化。

1.结果和分析

2.1 乳酸菌的分离提纯

在平板上出现了圆形稍扁平的黄色菌落，周围培养基变为黄色，初步定为乳酸菌⑴，取出少量在显微镜下

观察到了链球状和杆状两种形状（如图一

乳酸菌菌落特征与鉴定

’. 乳酸菌菌落特征与鉴定

纯培养

挑取3个或以上的可疑菌落，嗜热链球菌接种于MC琼脂平板，乳杆菌属和双歧杆菌属接种于MR S琼脂平板，双歧杆菌需绝对厌氧，置36 ℃±1 ℃恒温箱内培养48 h±2 h，不含双歧杆菌需兼性厌氧，置36 ℃±1℃恒温箱内培养48 h±2 h。

鉴定

涂片镜检：乳杆菌属细胞形态多样，从长的杆状和细长杆状到弯曲杆状及短杆状，一般形成链。通常不运动。无芽胞，革兰氏染色阳性。嗜热链球菌形态为球形或球杆状，直径为0.5 μm～2.0 μm，细胞成对或成链排列，无芽胞，革兰氏染色阳性。双歧杆菌属细胞呈多样形态，有较规则短杆状或纤细杆状具有尖细末段的细胞，也有呈球形者，可形成各种分支或分叉形。无芽胞，革兰氏染色阳性。

乳酸菌的分离与初步鉴定

学院：漓江学院年级专业：09生物技术

组员：吴汉川200913007005

杨隆荷200913007006

李翠200913007007

王志远200913007008

乳酸菌的分离及初步鉴定

一、实验目的

1了解和掌握放线菌的菌种特性和分离方法

2初步掌握军中筛选方法设计

3掌握平菌种的选育

二、实验原理

乳酸菌是指以糖为原料，属于真细菌纲真细菌目中的乳酸细菌科。乳酸细菌科根据细胞呈球状或呈杆状，又分成乳酸杆菌族和链球菌族。

在BCG 牛乳培养基琼脂平板上，乳酸菌菌落大约1-3 mm，圆形隆起，表面光

的溶滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色；在产酸菌落周围还能产生CaCO

解圈。乳酸菌革兰氏染色呈阳性，涂片镜检细胞杆状或链球状。

乳酸杆菌呈杆状，成单杆、双杆或长丝状；乳酸杆菌，呈球状，成对或短链或长链状。乳酸菌革兰氏染色后呈蓝紫色。

平板涂布法平板涂布法是将样品经稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单个细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个但菌落代表原样品中的一个单细胞。

生理盐水：称取9g氯化钠，溶解在少量蒸馏水中，稀释到1000毫升。

四、实验器材与试剂

含乳酸菌的酸奶、结晶紫、卢哥氏碘液、95%乙醇、蕃红溶液、灭菌CaCO3粉末、NaCl；

BCG牛乳培养基：(A)溶液：脱脂乳粉100g，水500mL，加入1.6%溴甲酚绿(B.C.G)乙醇溶液1mL，80℃灭菌20min。(B)溶液：酵母膏10g，水500mL，琼脂20g, pH6.8, 121℃湿热灭菌20min。以无菌操作趁热将(A)、(B)溶液混合均匀后倒平板。

乳酸菌形态特征

1. 引言

乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的细菌，它们以产酸为特征，是一

种重要的微生物资源。乳酸菌广泛应用于食品工业、医药工业以及生

态环境修复等领域。研究乳酸菌的形态特征对于深入了解其生物学特性、应用价值以及进一步开发利用具有重要意义。

2. 乳酸菌的形态特征

2.1 球状形态

乳酸菌具有球状形态是其最为常见的形态特征之一。球状乳酸菌细胞

直径通常在0.5-2微米之间，细胞表面光滑，呈现出圆形或椭圆形。

球状细胞在培养基上呈现出整齐排列或成群分布。

2.2 短杆状形态

除了球状外，部分乳酸杆菌也呈现出短杆状的外观。这类细胞长度通

常在1-3微米之间，直径约为0.5-1微米。这种细胞形态的乳酸菌在

培养基上呈现出散乱排列的特点。

2.3 长杆状形态

除了短杆状外，还有一些乳酸菌呈现出长杆状的外观。这种细胞形态

的乳酸菌细胞长度通常在3-6微米之间，直径约为0.5-1微米。长杆

状细胞在培养基上呈现出排列整齐或成串分布。

2.4 菌丝状形态

除了球状和杆状外，还有一些乳酸菌能够形成分枝菌丝结构。这种细

胞形态的乳酸菌在培养基上呈现出分枝或网格结构，细胞间相互连接。

3. 形态特征与生物学特性

3.1 形态与代谢能力

不同形态的乳酸菌可能具有不同的代谢能力。球状和长杆状乳酸菌通

常具有较高的产酸能力，可以通过发酵产生大量的乳酸。而一些具有

分枝菌丝结构的乳酸菌可能具有较高的抗氧化能力和抗菌能力。

3.2 形态与菌株特征

乳酸菌的形态特征与其菌株特征密切相关。不同的乳酸菌菌株可能具

有不同的形态特征，这种差异可能与其遗传背景、环境适应性以及代

乳酸菌生化鉴定乳糖

乳酸菌是一类广泛存在于自然界中的微生物，其在食品、医药、农业等领域中具有重要的应用价值。其中，乳酸菌在食品行业中的应用尤为广泛，例如酸奶、酸乳、酸菜等产品中都含有乳酸菌。

在乳酸菌的生化鉴定中，乳糖是一个重要的指标。乳糖是乳酸菌的一种碳源，其代谢过程可以产生乳酸等有机酸，同时也可以产生气体。因此，乳糖的利用能力是乳酸菌生化鉴定的重要指标之一。

乳酸菌生化鉴定是通过检测乳酸菌在不同条件下的生理和代谢

特征，来确定其分类和鉴定。在乳糖的生化鉴定中，通常采用的方法是培养乳酸菌在含有乳糖的培养基中，并观察其生长情况和代谢产物。

在培养基中，乳糖的浓度越高，乳酸菌的生长速度越慢，产生的酸度和气体也会相应减少。同时，不同种类的乳酸菌对乳糖的利用能力也有所不同，有些乳酸菌可以完全利用乳糖，有些则只能部分利用或者完全不能利用。

因此，在乳酸菌的生化鉴定中，通过观察乳酸菌在不同浓度的乳糖培养基中的生长情况和代谢产物，可以初步确定乳酸菌的分类和鉴定。同时，对于某些不同种类的乳酸菌，还需要结合其他指标进行综合鉴定，才能确定其确切的分类和鉴定。

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蒙牛达能乳酸菌分离,鉴定实验流程

蒙牛达能乳酸菌分离，鉴定实验流程

1 乳酸菌的分离纯化

采用BCG牛乳培养基对稀释样品中的微生物通过平板倾注法进行分离纯化。以无菌操作取奶酪稀释液10-3、10-4、10-5各0.1mL置于灭菌后的平板中,加入15mL BCG牛乳培养基,带培养基凝固后放入恒温培养箱中,37℃恒温培养24h。观察结果稍扁平的黄色菌落,周围培养基变为黄色,初步定为乳酸菌。

2 菌种的扩大培养

配制MRS液体培养基,分装到试管中(每管约15mL),将选出的菌种接种到试管中在37℃条件下扩大培养24h,在接种到小三角瓶中扩大培养24h。

3乳酸菌的鉴定

(1)形态学观察。

挑选出产抑菌物质的菌株,在合适的培养基上划线培养24h,待长出单菌落观察其菌落特征,在光学显微镜下观察其观察菌体形状、排列方式、有无芽孢等个体形态特征。

(2)生理实验。

①经固体培养基分离和液体培养基扩大培养的嗜热链球菌

接种于脱脂乳中,在不同温度下培养发酵,结果嗜热链球菌在40℃左右时约需3h凝乳;在45℃以上,随着温度提高,凝乳时间延长;

当培养温度大于55℃时,没有凝乳发生。当培养温度低于40℃时,随着培养温度的降低,凝乳时间延长;当温底低于25℃时,不能凝乳。

②将普通滤纸剪成约0.5cm～0.6cm宽的纸条,长度根据试管和培养基高度而定。用浓度为50～100g/L的乙酸铅将纸条浸透,然后置于烘干,放入培养皿或试管内,灭菌后备用。将新鲜试验菌培养物接种于培养液后,用无菌的镊子夹取一乙酸铅纸条悬挂于接种管内。下端接近培养基表面而不接触液面,上端用棉塞塞紧。试验中设空白对照,在未接种的试管培养上悬挂乙酸铅纸条。另外接种已知菌的阴性反应作对照。置于37℃培养培养1d～3d,进行观察比较,纸条变黑为阳性反应。

乳酸菌菌种的分离筛选方法

乳酸菌菌种的分离筛选方法乳酸细菌是一类能利用发酵糖产生大量乳酸的细菌通称。为兼性厌氧菌，杆状或球状，革兰氏阳性菌，无芽孢，不运动。营养要求高，需要提供丰富的肽类氨基酸维生素。在琼脂表面或内层形成较小的白色或淡黄色的菌落。

通常用作为有益微生物的菌种有乳酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、乳酸片球菌、双歧杆菌、屎肠球菌、戊糖片球菌等。

乳杆菌常用MRS琼脂作半选择培养基。当乳杆菌仅是复杂区系中的部分菌类

时，SL培养基常用作为选择性培养基。对于芽孢乳杆菌常用GYP培养基，链球菌有TYC培养基、MS培养基。M17培养基被用作乳球菌的分离培养基。

嗜酸乳杆菌属于乳杆菌属的一个种。其特性为：杆菌，两端圆，不运动，无

鞭毛。粪肠球菌为革兰氏阳性，圆形或椭圆形。

乳酸片球菌细胞呈球状，直径~μm，在直角两个平面交替形成四联状，一般细胞成对生，单生者罕见，不成链状排列。革兰氏阳性，不运动，兼性厌氧。在MRS 培养基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺线的生长物呈丝状。

乳酸菌在一般琼脂培养基上形成微小菌落，不易观察，所以分离时先富集培养并选择合适的培养基。分离培养基一般添加西红柿、酵母膏、吐温-80等物质，也常常加入醋酸盐，因醋酸盐能抑制部分细菌生长，对乳酸菌无害。

培养基中添加碳酸钙，乳酸溶解培养基中的碳酸钙形成透明圈，作为分离鉴别的依据，通过对生成的乳酸量进行性能鉴定。

乳酸菌生长繁殖时需要多种氨基酸，维生素及微氧，一般菌落比较小。分离培养基一般可添加西红柿酵母膏油酸吐温等物质，均具有促进生长作用。也常常添加醋酸盐抑制有些细菌的生长，对乳酸菌无害。

乳酸菌的检测

乳酸菌是指一群能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。这类细菌在自然界分布广泛，可栖居在人和各种动物的口腔、肠道等器官内，在土壤、食品、饲料、水及一些临床标本中都有乳酸菌的存在。乳酸菌在工业、农业和医药等与人类生活密切相关的领域应用价值很高，相当多的乳酸菌对人、畜的健康起着有益的作用，但个别菌种能对人畜致病，乳酸菌主要包括23个属的细菌。

二样本采集

检样主要为含乳酸菌活菌的饮料和微生态制剂，样本应放入冰箱保存，心快检验。

三检验方法（中华人民共和国国家标准乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验GB／T 16347-1996）

乳酸菌菌总数的测定：乳酸菌菌落总数是指标样在一定条件下培养后，所得1ml检样中所含乳酸菌菌落的总数。

（一）检验程序

乳酸菌菌落总数检验程序如下：

（二）培养基和试剂

改良TJA培养基（改良番茄汁琼脂培养基）；改良MC培养基（modified Chalmers培养基）；0.1％亚甲蓝牛乳培养基；6.5％氯化钠肉汤参照；pH9.6葡萄糖肉汤；40％胆汁肉汤；淀粉水解培养基；精氨酸水解培养基；乳酸杆菌糖发酵管；七叶苷培养基；革兰氏染色液；3％过氧化氢溶液；蛋白胨水、靛基质试剂；明胶培养基；硝酸盐培养基、硝酸盐试剂；生理盐水：定量分装于三角瓶和试管内灭菌。

（三）操作步骤

1．以无菌操作将经过充分摇匀的检样25ml（或25g）放入含有225ml灭菌生理盐水的来菌广口瓶内做成1：10的均匀稀释液。

2．用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1m，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液）。

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