黄曲霉毒素的检测方法研究

1993 年，黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为一类致癌物，世界公 认的三大强致癌物质之一，是一种剧毒物质[4]。 2 黄曲霉毒素研究概况
迄今为止，已经发现的黄曲霉毒素至少包含黄曲霉毒素 B1 、B2、G1、G2、M1、M2 等 17 种 结构相似且特征已知的化合物，其结构特征为都含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮。黄曲 霉毒素的理化性质比较稳定，如 B1 在高温 200e、紫外线照射下，都不能使之破坏，加热到 B1 的熔点(268~269e)才开始分解;在酸性溶液中也很稳定，在 pH1~3 的强酸性溶液中则稍有 分解[5]黄曲霉毒素的毒性为氰化钾的 10 倍，砒霜的 68 倍，能引起人急性中毒死亡，与人的 肝癌有密切关系，能使家畜、家禽及多种实验动物诱发癌症，其中 B1 、B2、G1、G2 是最主要 的毒素物质，而 B1 自然发生潜力最大的一种毒素[6]。
薄层层析法对样品处理繁琐，实验过程复杂，所需时间多，易受杂质干扰，较适合于对 黄曲霉毒素的定性检测，是研究黄曲霉毒素初期所使用的主要方法。今后，虽然薄层层析法 在不断地改进，并在一般实验室均可完成操作，但由于它复杂的前处理过程致使在应用中仍 然会受到一定程度的限制。高效液相色谱法测定黄曲霉毒素，技术水平要求较高，目前采用 这种方法检测黄曲霉毒素较多，但具体一次实验所使用的化学药剂和处理途径差别很大，对 实验结果的精度造成影响，这种方法还应在实践中进一步改进。但总体上说高效液相色谱法 操作较为简便，同时可检测多个黄曲霉毒素种类，适于大批量样品的分析。将免疫亲和柱与
浓缩一次完成，大大简化了前处理过程，提高了工作效率及方法的灵敏度，但增加了成本[9]。 采用国产硅镁吸附柱层析分离纯化玉米中 AFTB1，用 HPLC 法检测，方法简便，纯化效果好， 最低检出量为 0.08 ng，回收率为 92.87%，该法制柱方便，而且降低了成本[10] 。高效液相 色谱法仪器设备昂贵，技术水平要求高，每次实验所使用的化学药剂和处理途径对试验结果 影响程度差别很大，对实验结果的精度造成影响；样品还需进行繁琐的纯化处理，不适合快 速检测。 3.3 微柱法
黄曲霉毒素对人和动物健康的危害均与黄曲霉毒素抑制蛋白质的合成有关，黄曲霉毒素 分子中的双呋喃环结构是产生毒性的重要结构，研究表明黄曲霉毒素的细胞毒作用可干扰信 息 RNA 和 DNA 的合成，进而干扰细胞蛋白质的合成，导致动物全身性损害。 3 黄曲霉毒素的检测方法
黄曲霉毒素的检测方法从最初以薄层层析法为主，发展到高效液相色谱法、微柱法、酶 联免疫吸附法等多种方法普遍应用，其进展与新的化学检测手段和新仪器的出现密不可分。 这些新方法、新手段的快速应用，为黄曲霉毒素的检测提供了更广泛的选择余地，适应了不 同的检测目的和要求。 3.1 薄层层析法(TLC)
ELISA 是利用免疫、酶和生化技术来检测 AFT。ELISA 是上世纪 70 年代出现的新 的免 疫技术[15]，最初由荷兰学者 an Weeman 和瑞典学者 Engvall 与 Perlman 几乎同时提出，主要 用于病毒的检测，70 年代中后期开始用于真菌毒素的检测。ELISA 以其简便、快速、灵敏、 成本低、检测谱广等特点在检测方面越来越受到人们的青睐，是一种定性或半定量的方法[16]。 ELISA 的基本原理是首先将抗原或抗体固化。吸附在固相载体表面的抗原或抗体，仍然保持 着其免疫学活性。其次是酶标记，被固定的抗原或抗体以共价键与酶连接形成酶结合物，而 此物仍保持着免疫学和酶学活性。三是显色反应，酶标记物与相应的抗原或抗体反应，再加 入底物显色液，来判定反应是否进行，颜色的深浅和免疫反应成比例的关系。所以通过显色 可以判断反应是否进行，而通过后面的测定，又可以进行半定量检测。ELISA 主要分为直接 法测定抗原、间接法测定抗体[17]双抗体夹心法测定抗原、竞争法测定抗原。 3.5 金标免疫层析检测技术(GICA)
GICA 利用纳米金作为标记物，在很短的时间内就能测出待测物的含量，并可以直接读 取结果。不需要分离纯化样品，也无需对检测溶剂做任何的处理，真正做到一步检测，方便、 高效[18]。在金标免疫试纸法的应用过程中，研究信号灵敏度的影响，并为消除这些影响提供 了经验。在检测样品中对粗提取液用氯仿法萃取后，使其挥干再溶解，可将盐离子和重金属 离子对测定的影响控制在允许范围之内;用石油醚脱脂，可将油脂对测定结果的影响降到最 低[19]。用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记抗 AFB1 单克隆抗体并喷于玻璃纤维上， AFB1 偶联抗原和二抗分别结合于硝酸纤维膜上，依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维膜和吸 水纸组装切割成胶体金试纸条并装入检测卡中。测试结果表明， AFB1 快速检测试纸条的灵 敏度为 5ng/mL，检测时间为 10min，批内和批间重复性 100%，假阳性率和假阴性率均为 0[20]。 4 在问题及展望
通过微柱法测定黄曲霉毒素，样品经前处理后，即在 365nm 紫外光下观察结果，有微黄 色荧光出现，则样品不含黄曲霉毒素，若蓝紫色荧光出现，则为阳性检出，再根据其荧光强 度与事先已知含量的黄曲霉毒素标准管相比较确定其含量[11]。 3.4 免疫化学法
免疫化学法是根据免疫学抗原抗体高特异性结合，设计并发展起来的免疫学检测技术 [12]。具有重现性好、灵敏度高、选择性强、特异性强、时间短、检测限低等特点，同时又能 减少有害试剂的使用，对检测人员健康起一定保护作用，在 AFT 检测方面取得了很大的应用。 具有代表性的主要有免疫层析法(IICA)、放射免疫分析方法(RIA)和酶联免疫法(ELISA)等， 们均可以进行定量测定。 3.4.1 免疫亲和柱荧光光度法(IAC)
该检测方法所用设备简单、费用低廉、容易掌握，适用大量样品的分离、筛选，一般的 实验室均可开展，属于定性和半定量检测。
TLC 有单向展开和双向展开法，其中双向展开法能进一步除去样品中的杂质，提高灵敏 度，省略了柱层析等净操作步骤。TLC 法由于设备简单，一般实验室都能满足，利于普及， 仍是现在检测 AFT 的主要方法之一。 3.2 高效液相色譜法(HPLC)
薄层层析法是测定黄曲霉毒素的经典方法，其原理是将样品经过提取、柱层析、洗脱、 浓缩、薄层分离后，在波长 365 nm 紫外光下产生蓝紫色或黄绿色荧光，并根据其在薄层上 显示的最低检出量来确定其含量。聂孝同等[7]应用薄层层析法采用以下步骤对饲料中的黄曲 霉毒素进行了检测。首先是黄曲霉毒素的提取:把粉碎过 20 目筛的样品放入具塞三角瓶中， 加入甲醇( 55B45 )溶液，再加入石油醚盖严，静置片刻后，用慢速定量滤纸过滤于分液漏 斗中，通入三氯甲烷，再过滤并将滤液在 65e 水浴上通风挥干，冷却后加入苯-乙腈( 98B2 ) 充分混合，然后吸取上清液待用。对杂质少的样品，采取直板定性，依次点板、展开、观察; 其中预展展开剂为无水乙醚，正展展开剂为丙酮-三氯甲烷(1B9)，且展开剂要事先加入到展 开槽内;通过观察，无荧光出现为阴性，出现荧光则为阳性，需作直板确证，若继续有荧光 出现，则进一步作定量确证;样品的某一点荧光强度与标样点的荧光强度相一致，则取此点 为样本的黄曲霉毒素含量值，否则作稀释定量检测;但是对于杂质多的样品，须采取横板定 性;同样经过点板、展开、观察，有荧光者为阳性检出，进一步作横向确证，经再次检测观 察呈阳性，则需要定量确证黄曲霉毒素含量。为了提高薄层层析法的精度，建立薄层扫描法 来测定黄曲霉毒素，它是薄层层析法的仪器化，样品的处理和层析条件与薄层层析法相同， 只是在标准品的设定和结果判定上有所不同。杨焱等[8]把粉碎过筛的样品加水湿润后通入氯 仿过滤，TLC 法较适合于对黄曲霉毒素的定性检测，是研究黄曲霉毒素初期所使用的主要方 法。
SFB 是新发展起来的一种检测 AFT 的方法，其设备轻便、自动化高、操作简单、检测灵 敏、时间短，广泛应用于检测日常饲料中的 AFT 是否超标。国外 Vicam 公司开发出的 V2 系 列型荧光光度计，可以直接读取 AFT 的总量。但用 SFB 法检测中药材中 AFT 的含量时，结果 中出现很多假阳性，造成结果不准确。王晶等用 SFB 法快速检测日常食用酱油和醋样品中 AFT 含量，其检出限分别是 2.5g/kg 和 1μg/kg，添加回收率在 85%以上 [14] 。 3.4.3 酶联吸附法(ELISA)
HPLC 是近几年发展起来的检测 AFTB1 方法，主要是用荧光检测器检测，在适宜的流动 相条件下，采用反相 C18 柱，使多种黄曲霉毒素同时分离。高效液相色谱法灵敏、分辨率高， 可作定性、定量分析，同时可检测多个黄曲霉毒素种类，适于大批量样品的分析。
采用佛罗里硅土净化柱净化，三氟乙酸柱前衍生检测饲料中 AFTB1，回收率为 83%，相 关系数 r=0.9998[14]。将免疫学技术和 HPLC 法相结合，采用免疫亲和柱对样品进行净化， AFTB1 回收率达到 97.3%，相关系数 r=0.9994，最低检出限为 6.25 pg，该法将提取、净化、
微柱筛选法是将样品提取液通过由氧化铝与硅镁吸附剂组成的微柱层析管，杂质被氧化 铝吸附，黄曲霉毒素被硅镁吸附剂吸附，在 365 nm 紫外线下呈蓝紫色荧光，其荧光强度在 一定范围内与黄曲霉毒素的含量成正比，由于微柱不能分离黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2，故 检测结果为黄曲霉毒素的总量。
微柱筛选法测定黄曲霉毒素，主要是用来检验黄曲霉毒素的存在与否以及快速筛选出超 标样品。要对黄曲霉毒素种类进行区分定量检验，则需要对不同黄曲霉毒素组分进行分离， 再利用其它方法检测。因此，微柱筛选法并不能完成整个黄曲霉毒素的检测过程，仅适用于 定性检验。
关键词：黄曲霉毒素；食品安全；检测方法
1 前言 黄曲霉毒素是一种剧毒和强致癌物质，是一类化学结构类似的化合物，均为二氢呋喃香
豆素的衍生物，可分为 B1 、B2、G1、G2、M1、M2 等。B1 为黄曲霉毒素中毒性及致癌性最强的物 质， 是间接致癌物，进入人体内经氧化代谢酶活化后形成的活性中间代谢产物与 DNA 大分 子结合，导致细胞遗传特性改变，进而发挥其致癌致突变效应，又可被另一类代谢酶代谢解 毒，使终致癌物结构发生改变而不能攻击 DNA 实现机体的自身保护作用。从物种上说，黄曲 霉毒素存在于土壤、动植物、各种坚果，特别是花生和核桃中。黄曲霉毒素(aflatoxin， AFT) 主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物。在世界不同地区都发现了这 些真菌大量存在于供人类食用的食品中，黄曲霉毒素污染已导致严重的食品安全问题[1，2]。 自 20 世纪 60 年代以来，有关黄曲霉毒素的危害被大量报道，以致黄曲霉毒素已成为最受人 们关注的一种真菌毒素[3]。因此，寻求准确、快速、简便的检测方法，对黄曲霉毒素进行高 效的定性定量分析，是黄曲霉毒素研究的一个重要方面。