切片、免疫组化步骤

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免疫组化步骤

免疫组化

操作方法

一、脱蜡

1. 将组织切片至于玻片加上，65°C烘箱烘烤2-4小时，是石蜡完全熔

融。

2. 将烘烤充分的切片迅速置入二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，

置入第二缸二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第三缸二甲苯中，浸泡10min。

3. 从二甲苯中取出切片，尽量沥干二甲苯，置入无水乙醇中，浸泡

3min；取出，置入第二缸无水乙醇中，浸泡3min；取出切片，再依次置入90%、80%、70%酒精中梯度水化，各浸泡3min。

（切片脱蜡复水目前仪器自动完成）

4.，PBS冲洗2-3次，每次3-5min，3% H2O2室温孵育20分钟，以消

除内源性过氧化物酶的活性。

二、抗原修复（以EDTA(PH 8.0/9.0)为例，常用的还有枸橼酸)

1. 用流水冲洗切片1-2min，洗净切片表面的酒精；取出切片，用蒸馏

水润洗切片表面2-3次，每次3-5min。

2. 将切片置入已经在电饭煲（沸水浴）中预热充分的EDTA中，持续

水浴煮沸20min，再将电饭煲切换至保温档保温10min。

（实际操作：微波炉高火8min*2）

3. 取出修复盒，使其自然冷却至室温。

三、封闭

1. 取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的EDTA 3次，每次3min。

2. 用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。

3. 将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液（注意擦拭方式，以防抹掉玻片上的组织）。

4. 将切片置于湿盒上，滴加5%的BSA，37°C培养箱孵育30-40min（或4°C冰箱孵育过夜）。

石蜡切片--免疫组化详细步骤

免疫组化染色

1.石蜡切片60℃烤片2h

2.二甲苯脱蜡15min X 2次

3.梯度乙醇水化：100%乙醇X 2次，95%乙醇X 1次，85%乙醇X 1次，75%乙醇X 1次，

纯水X 2次，各5min。

4.抗原修复:

方法一（微波修复）：将玻片浸没在EDTA或枸橼酸钠抗原修复液中，微波炉高火5min，解冻2min，中低火20min，自然冷却到室温。

方法二（高压修复）：将玻片浸没在枸橼酸钠抗原修复液中，121℃，高压5min，自然冷却到室温。

1L抗原修复液：3g柠檬酸钠+0.4g柠檬酸。

5.灭火内源性过氧化物酶：将玻片浸入3% H2O2，室温15min，避光。

6.双蒸水浸泡3min，去除H2O2。

7.PBS洗3次，每次5min

8.甩干，将玻片摆放在湿盒上，免疫组化笔花圈，加入0.3% TritonX-100穿透细胞15min。

如果检测细胞质蛋白，此步骤科省略。

9.甩干，加入10% BSA 封闭1h。

10.加入2% BSA稀释好的一抗，4℃孵育过夜。

11.第二天，把湿盒从4℃拿出恢复至室温，PBS洗3次，每次5min

12.甩干，加入对应的二抗，室温孵育1h

13.PBS洗3次，每次5min

14.甩干，加入新鲜配置的DAB，显色时间需要摸索，最长不超过10min

15.清水终止显色，自来水冲洗20min以上。

16.苏木素染色30s，自来水冲洗返蓝

17.梯度乙醇脱水：75%乙醇X 1次30s，85%乙醇X 1次30s，95%乙醇X 1次30s，100%

乙醇X 1次30s，二甲苯6min

18.中性树胶封片。

免疫组化操作流程

免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或组织中是否存在其

中一种抗原或蛋白质，并进一步定位其在细胞或组织中的分布情况。下面

是免疫组化的一般操作流程：

1.样本制备：

a.细胞培养：对于体外培养的细胞，将其定植在培养皿中，使其附着

在载玻片上。

b.组织切片：将组织固定、石蜡包埋后，用切片机将其切割成小片。

2.抗原修复：

a.细胞：用4%的甲醛或冰醋酸将细胞固定，然后用PBS（磷酸缓冲盐

溶液）进行洗涤。

b. 组织：将石蜡包埋的组织切片用xylene去除石蜡，并通过一系列

浓度递减的酒精进行洗涤。

3.抗体选择和制备：

a.选择合适的一抗体与待检测的目标蛋白或抗原有特异性结合。

b.对于小分子抗原，可以直接用抗体进行染色。对于较大的蛋白质抗原，需要通过特殊方法将抗体标记。

4.抗体染色：

a.细胞：将细胞孵育在含有一抗体的PBS中，并进行特定时间的孵育，然后通过洗涤去除未结合的抗体。

b.组织：将抗体加到待检的组织切片上，经过适当的孵育时间，然后

通过洗涤去除未结合的抗体。

5.反应显色：

a.一抗染色：根据抗体的结合情况，选择适合的检测方法，如发光、

颜色显现等。

b.二抗染色：对于无法直接检测的一抗染色结果，需要加入二抗，二

抗可以与一抗特定的Fc部分结合，形成复合物。二抗通常被标记为酶，

可以与底物反应产生颜色或发光。

6.显微镜观察：

a.细胞：将染好的细胞载玻片通常先底片固定，然后在显微镜下观察

并拍照。

b.组织：将染好的组织切片在载玻片上，然后将其加入显微镜下观察，并通过摄影或记录图像。

7.数据分析和结果解读：

免疫组化法实验操作步骤

以下是免疫组化法的标准实验操作步骤：

1.样本准备：

a.获取待检样本，例如组织切片或细胞悬液。

b.将样本固定，常用的固定剂包括福尔马林、乙醇和乙酸等。

c.进行脱水和石蜡包埋，以便于后续切片。

2.制备切片：

a.用切片机将固定的样本切成薄片，通常为4-6微米。

b.将切片平均分配在载玻片上。

3.制备蜡块：

a.将切片放入烘箱中进行去蜡，以去除切片上的石蜡。

b.用乙醇对切片进行脱水然后重新水化。

c.将切片放入热稳定耐热塑料材料中，通常为硝酸纤维素薄膜等。

4.抗原恢复：

a.使用高温高压（如压力锅或蒸汽炉）进行抗原恢复，以改善抗体与抗原的结合效率。

b.根据实验需要选择适当的抗原恢复缓冲液，如磷酸盐缓冲液（PBS）、EDTA缓冲液或三氯醋酸缓冲液等。

c.将切片放入抗原恢复缓冲液中进行恢复处理。

5.抗体处理：

a. 选择适当的一抗（primary antibody），根据目标蛋白质的性质选择单克隆或多克隆抗体。

b.将一抗稀释至适当浓度，根据抗原的强度调整抗体浓度。

c.将一抗加入样本上共孵育，使抗体与目标蛋白质发生特异性结合。

d.对于一些抗体，可以使用辅助试剂如牛血清蛋白、牛血清、胶原蛋白等增强结合效果。

6.清洗：

a.用PBS或其他合适的缓冲液冲洗切片，以去除未结合的一抗。

b.重复冲洗步骤多次，以充分去除未结合的抗体。

7.检测标记：

a.选择适当的检测标记，如酶（如辣根过氧化物酶，HRP）、荧光染料或金标记等。

b.将标记物加入到一抗与抗原结合的位置上，以形成可视的标记。

8.染色：

a.若使用酶标记物，则使用特定底物进行染色，产生颜色反应。

免疫组化相关步骤

免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测、定位和定量特定蛋白质在组织或细胞中的表达。以下是免疫组化的一般步骤：

1.取材和预处理：

首先，选择需要研究的物种的组织样本，可以是固定和包埋的组织切片，也可以是细胞培养物。对于固定组织，常用的固定剂包括福尔马林、乙醛等。然后进行脱水、透明化、包埋等预处理步骤。

2.标本切片：

将处理好的组织或细胞样本切成较薄的切片，常见的切片厚度为4-6微米。切片后，可以将其固定在载玻片上。

3.抗原恢复：

对于一些已经固定的样本，抗体可能无法充分与蛋白质结合。因此，进行抗原恢复是必要的。常见的抗原恢复方法包括加热诱导抗原恢复（如高温加热或压力加热）和酶或蛋白酶诱导的抗原恢复。这些方法有助于揭示抗原并提高抗体的结合。

4.阻断非特异性结合：

在进行免疫组化反应之前，需要阻断非特异性结合位点，以减少假阳性结果。常用的非特异性结合位点阻断方法包括使用血清蛋白、牛血清白蛋白、胶原蛋白等。

5.一抗反应：

将特异性抗体（一抗）加入切片或细胞上，并进行孵育。一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体。一般情况下，常用的抗体稀释倍数为1:100到1:1000。此步骤的时间和温度也需要根据具体的抗体选择进行调整。

6.洗涤：

完成一抗反应后，需要进行多次洗涤来去除未结合的抗体。洗涤可以使用生理盐水、PBS等缓冲液，重复2-3次洗涤，每次洗涤时间持续5-10分钟。

7.二抗反应：

8.洗涤：

与一抗反应类似，完成二抗反应后需要进行多次洗涤来去除未结合的二抗。洗涤可以使用生理盐水、PBS等缓冲液，重复2-3次洗涤，每次洗涤时间持续5-10分钟。

冰冻切片免疫组化染色步骤

一、前言

冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细

胞或组织中的表达情况。该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、

切片、抗体染色等。本文将详细介绍这些步骤。

二、样品处理

1. 采集样品

首先需要采集需要检测的样品。比较常见的样品包括动物或人类组织、细胞培养物等。

2. 固定样品

采集好的组织或细胞需要进行固定处理，保证其形态和结构不受损伤。固定处理一般使用4%多聚甲醛或4%乙醛进行。

3. 脱水处理

为了使样品更易于切割，需要对其进行脱水处理。脱水处理可以通过

将固定好的组织或细胞分别浸泡在70%、80%和95%乙醇中进行。

4. 包埋处理

最后，将脱水后的样品进行包埋处理，即将其置于石蜡中，并逐渐加

热至60℃以上，直到石蜡完全浸透到样品中。

三、切片

1. 制备切片

将包埋好的样品切成5-10微米厚的切片。这一步需要使用专业的冰冻切片机进行，确保切片质量。

2. 将切片悬浮在载玻片上

将制备好的切片悬浮在载玻片上，并进行干燥处理。这一步需要注意，避免样品受到外界污染。

四、抗体染色

1. 抗原修复

为了提高抗体的结合效率，需要对样品进行抗原修复处理。这一步可以通过加热或酶解等方式实现。

2. 阻断非特异性结合

为了避免非特异性结合，需要在抗体染色前对样品进行阻断处理。常用的阻断剂包括牛血清白蛋白和小鼠IgG等。

3. 抗体染色

将已经稀释好的一抗和二抗依次加入到载玻片上，并进行孵育处理。这一步需要注意控制反应时间和温度等因素。

4. 显色与荧光显微镜观察

最后，通过加入显色剂或荧光染料实现蛋白质的可视化。观察过程需要使用荧光显微镜进行。

免疫组化相关步骤

免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种基于抗原抗体反应

的方法，用于检测组织或细胞中其中一种特定蛋白质的表达。下面将详细

介绍免疫组化的相关步骤。

免疫组化的步骤包括样品制备、抗原修复、阻断、一抗反应、二抗反

应和染色，具体如下：

1.样品制备：

首先，需要获取组织标本。通过活体组织切片、细胞涂片或冷冻切片

等方法制备标本。制备好的标本需要保持完整和有代表性，通常要求切片

不超过5μm厚。

2.抗原修复：

组织切片在固定过程中会损害抗原的完整性，因此需要进行抗原修复，以恢复抗原的表达。常用的抗原修复方法包括热解修复（如加热、压力煮等）和酶解修复（如胰蛋白酶消化等）。

3.阻断：

组织切片会与非特异抗体结合，影响免疫反应的特异性，因此需要进

行阻断。常用的阻断方法包括用牛血清白蛋白（BSA）或奶粉进行阻断，

以防止非特异性背景信号的产生。

4.一抗反应：

将含有特异性抗体的试剂加到组织切片上，使其与目标抗原结合。特

异性抗体可针对不同的抗原进行选择，如研究一些蛋白质的表达，可以选

择该蛋白的特异性抗体。

5.二抗反应：

一抗与抗原结合后，需要加入与该一抗来自不同物种的二抗。二抗通

常是免疫出来的，其与一抗结合后，可形成复合物，具有荧光或酶标记。6.染色：

最后，通过染色方法来显示抗原的表达。染色可以是荧光染色或酶标

染色。荧光染色利用特定颜料对特异性标记的抗体进行荧光标记，并在荧

光显微镜下观察。酶标染色则使用酶标记的二抗，再加入相应的底物进行

染色。

除了以上的基本步骤

1.控制组：

为了验证实验是否准确，通常需要设置阴性和阳性对照组。阴性对照

免疫组化实验步骤完整版

步骤1：标本采集和固定

首先，需要从待检测样本中采集组织或细胞。可以使用手术切片、活体组织、培养的细胞等作为标本。然后，将采集的样本固定在载玻片或切片上，以保持其结构和形态的完整性。

步骤2：抗原暴露和体细胞抗原消除

接下来，需要处理标本以使抗原裸露出来，并消除非特异性的抗体结合和细胞膜结合的抗原。这一步骤常常涉及对组织或细胞的预处理，例如用石蜡脱脂、酶解抗体和孵化等。

步骤3：抗体特异性结合

选择特异性的抗体用于检测待测蛋白质。这些抗体可以是直接标记的一抗，或间接标记的二抗。一抗是专门与目标抗原结合的抗体，而二抗则可以与一抗结合，以提高信号的灵敏度和特异性。这一步骤中还需要选择适当的阴性对照，即未携带待检测抗原的样本。

步骤4：探针检测

根据需要，可以使用不同的探针来检测目标分子。常用的探针有标记的一抗、荧光探针、放射性标记物等。标记的一抗可以直接结合抗原，然后使用染色剂进行可视化；荧光探针则通过荧光显微镜进行检测；放射性标记物可以通过放射自显影等方法进行检测。

步骤5：显色和对比计数

将荧光、酶标记或放射性标记的物质显色，以便于检测和计数。在染色的过程中，需要防止非特异性的染色，例如使用阻断剂、胶原等。

步骤6：结果分析

根据观察到的染色强度、分布模式等结果，分析待测蛋白质在样本中的表达情况。这可能需要与阴性对照和阳性对照进行比较，以确定实验结果的可靠性。

步骤7：图像捕获和分析

使用显微镜或其他成像设备，将荧光、染色或放射性标记的图像捕获下来。可以使用图像分析软件来计算和比较样本中的染色强度、面积等参数。

细胞免疫组化实验步骤

细胞免疫组化实验步骤：

1）脱蜡与水化：将石蜡切片放置于60°烤箱烤片30-60min，这一步是为了使蜡片水分蒸发和石蜡融化，好让组织切片牢固地贴在玻片上。而后依次将其放入二甲苯I、II、III各10min，乙醇梯度（高至低：100%、95%、80%、70%）各2min，水洗5min（不要直接对着切片冲洗）。PBS洗3次，3 min/次。

2）细胞通透与封闭：用预热的封闭通透液（40ml PBS+120ul TritonX-100+400ul 30%H2O2）浸润切片30min（RT 避光），降低内源性过氧化物酶的活性。PBS洗3次，3 min/次。

3）抗原修复：由于制作石蜡切片时，甲醛固定使得蛋白之间交联及醛基的封闭作用从而失去抗原性，这一步就是让胞内的抗原决定簇重新“满血复活”。

这里常用微波修复，pH 6.0的0.01M柠檬酸钠缓冲液浸泡切片，在微波炉里高火4min至沸腾后，取出自然冷却至室温，重复2次，每次补足液体以免干片。（当然有的朋友用酶修复法也是可以的）。PBS洗3次，3 min/次。

4）血清封闭：用与二抗同一来源的血清封闭一些非特异性结合位点。此时可用“祖传”的油性笔围绕组织画圈，并对圈内的组织滴加稀释好的血清，37℃温箱中30min,用滤纸吸去多余的血清。

5）孵育一抗：对圈内的组织（面积为1×1）滴加稀释好的一抗20ul，4℃过夜或者37℃1-2h。PBS洗3次，3 min/次。（一般4℃过夜后，需要将切片放置37℃复温45min，防止脱片以及可使抗原抗体结合的更稳定）

冰冻切片免疫组化染色步骤

引言

冰冻切片免疫组化染色是一种常用的实验方法，用于研究细胞和组织的分子表达。它结合了冷冻样本的切片技术和免疫组织化学染色的原理，能够可视化特定分子在组织中的位置，从而帮助我们理解生物过程和疾病机制。本文将介绍冰冻切片免疫组化染色的步骤和注意事项。

步骤一：样本制备

1.收集组织样本，根据需要进行切割和处理。

2.快速冷冻组织样本，可用液氮或乙醚等方法冷冻，并保存在低温环境中。

步骤二：切片制备

1.取出冷冻样本，将其置于切片机或切片冷冻器中。

2.进行组织切片，通常厚度为5-10微米，利用切片刀或者切片冷冻器的微调

装置。

3.将切片收集在清洁的载玻片上，可以使用专门的载玻片来增强切片与载玻片

间的附着力。

步骤三：固定和脱水

1.将载玻片上的切片放入4%的中性缓冲福尔马林缓冲液中固定细胞和蛋白质。

2.固定15-30分钟后，用PBS或其他缓冲溶液洗涤切片，将福尔马林去除。

3.将切片脱水，使用逐渐浓度的乙醇和脱水溶液，如70%乙醇、95%乙醇和100%

乙醇。

步骤四：抗原修复

1.对于有些抗原，如细胞核抗原，需要进行抗原修复。这可以通过热、酸或酶

消化等方法进行。

2.一种常用的抗原修复方法是将切片置于高温或高压下进行热诱导抗原修复。

步骤五：阻断和孵育

1.使用蛋白质阻断剂，如牛血清蛋白、BSA等，在切片上进行孵育，以防止非

特异性结合。

2.孵育时间通常为30分钟至1小时。

步骤六：一抗孵育

1.加入一抗，即特异性抗体，与切片上的靶分子结合。

2.一抗浓度和孵育时间根据实验需要和抗体质量进行优化。

步骤七：洗涤

免疫组化超详细步骤

免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或者组织中特定的分子，如蛋白质、核酸和糖等。下面是免疫组化的详细步骤：

1.样本准备：

a.细胞或组织准备：首先需要获取细胞或组织样本，可以通过培养细胞或直接取得组织切片。

b.保存和处理：细胞或组织样本需要保存在合适的液体中，如福尔马林或液氮，以保证样本的完整性和保存时间。

c.切片：对于组织样本，需要将其切割成薄片，常用的方法是冰冻切片或石蜡包埋切片。

2.抗原的暴露：

a.反应原位：对于固定的细胞或组织样本，可以直接进行免疫组化实验。

b.透化处理：对于未固定的细胞或组织样本，需要进行透化处理，以使抗体能够穿透细胞膜或组织间隙。

3.抗原检测步骤：

a.抗原恢复：有时，抗原可能会受到固定或透化处理的损伤，需要进行抗原恢复步骤。常见的方法有热处理、酶消化和抗体消除等。

b.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要对样本进行阻断处理，可以使用一些蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼胶。

4.抗体标记检测：

a.一抗：选择特异对应抗原的一抗（原抗体），将其加入到样本中，

与样本中的特定抗原结合。

b.二抗：将含有特异对一抗的二抗（辅助抗体）标记的溶液加入到样

本中，与一抗结合。二抗通常会与荧光染料、酶或金颗粒等标记结合。

5.洗涤：

a.用缓冲液洗涤样本，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。

6.反应可视化：

a.荧光标记：对于荧光染料标记的样本，可以通过荧光显微镜观察到

标记物的信号。

b.酶标记：对于酶标记的样本，需要使用合适的基质使酶产生染色反应，并通过显微镜观察到染色的结果。

免疫组化切片步骤

免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体与组织中特定抗原结合的方法，通过染色反应来观察和定位抗原在组织中的表达情况。它在病理学诊断、生物医学研究和药物研发中起着重要的作用。下面将介绍免疫组化切片的步骤。

1. 标本固定

免疫组化切片的第一步是对组织标本进行固定。通常使用10%的缓冲福尔马林（formalin）溶液进行固定，固定时间一般为24-48小时。固定的目的是保持组织形态和结构，同时保护抗原的完整性。

2. 组织处理

固定后的组织标本需要进行脱水和石蜡包埋处理。首先，将组织标本从福尔马林中取出，用流动水冲洗去除福尔马林。然后，将组织置于逐渐升级的酒精溶液中进行脱水，通常是从低浓度（例如70%）的酒精开始，逐渐升级到高浓度（例如100%）的酒精。脱水的目的是去除水分，使组织与石蜡相容。

3. 石蜡浸渍和包埋

脱水后，组织标本需要进行石蜡浸渍和包埋处理。将组织放入石蜡中，使用真空泵进行抽真空，以便石蜡渗透到组织内部。然后，将组织置于石蜡中，用石蜡包裹组织标本，使其固定在切片时保持完整。石蜡的目的是提供支撑和保护组织结构。

4. 切片制备

经过石蜡包埋的组织标本需要切片制备。使用旋转式切片机将石蜡包埋的组织标本切成薄片，通常为4-5微米厚。切片的目的是将组织标本切割成可以在显微镜下观察的薄片。

5. 切片烘干和质控

切片制备后，将切片放在烘箱中进行烘干，以去除切片中的水分。然后，对切片进行质控，确保切片的质量和完整性。质控包括切片染色前的切片检查和评估。

冰冻切片的免疫组化染色步骤

1.准备工作：

（1）准备正常组织冰冻切片，使用离心切片机将原有组织材料切成

5-10μm厚的片层，切片后立即放入凝胶剂（如冰冻液中的季铵盐）内，

紧急冷冻到-20℃；

（2）准备石蜡糊，将石蜡熔解并加入一定量的溶剂使其至流体状态；

（3）准备免疫染色的药品，比如羊抗体、抗原标记物（Biotinimidazole）、Streptavidin-HRP（HorseradishPeroxidase）等。

（1）将冰冻切片浸入石蜡糊中进行热融化处理，处理完毕后将其放

置于待用；

（2）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用70％乙醇清洗，然后放

入PBS小规模洗涤，然后用清洗液（清水）浇上，以去除表面的乙醇；

（3）将冰冻切片浸泡在去除组织胶多聚体液中，液体里溶解蛋白质

类多聚体，以防止抗体与冰冻切片上的组织胶多聚体结合；

（4）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用于抗体的定量涂布，将

抗体与切片表面的抗原结合；

（5）在抗体涂布完毕后，将冰冻切片置于含有PBS溶液的室温下供

2小时以上，使抗体能够与冰冻切片上的抗原结合；

（6）将冰冻切片从室温溶液中取出，放入冰冻液中，将表面的多余

抗体冲洗掉；

免疫组化基本步骤

免疫组化是一种研究细胞或组织中特定抗原表达的方法。它是通过将

已知抗原与未知组织或细胞的衍生物进行反应，然后通过可见光或荧光显

微镜观察这些抗原的表达情况。

免疫组化的基本步骤如下：

1.样本预处理：首先，需要对待检组织样本进行预处理。这通常包括

固定和包埋。固定可以使用甲醛、乙醇等化学物质进行，目的是保持组织

或细胞的形态结构和细胞膜完整性。接下来，样本通常会被包埋在石蜡或

冰冻剂中，以便进行切片。

2.切片制备：将处理后的样本切片。通常可以使用切片机或超薄切片

机将固定好的组织切成薄片，通常为4-10微米。切片可以更好地展示组

织结构和细胞的形态。

3.抗原恢复：根据需要，可能需要进行抗原恢复步骤。抗原恢复是通

过热或酶解的方法，来使抗原的免疫原性恢复。这是因为在组织固定的过

程中，抗原常常会被交联变性，丧失免疫反应性。

4.抗体染色：将待检样本与已知抗体进行反应。已知抗体可以是单克

隆或多克隆抗体。这些抗体具有对特定抗原的亲和力。反应通常在生物素

-链霉亲和素体系或酶-抗酶（如辣根过氧化物酶）体系中进行。通过这些

反应，待检抗原会与抗体结合，形成抗原和抗体的复合物。

5.检测标记物：接下来，需要对已形成的抗原-抗体复合物进行检测。这通常涉及到糖基化酶物质（如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或荧光标

记抗体。检测标记物的选择取决于研究者的需求以及所使用的设备和系统。

6.显色：根据使用的检测标记物不同，需要进行相应的显色步骤。对于辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶体系，可以使用底物通过化学反应产生颜色信号。对于荧光标记抗体，可以通过激光或紫外线照射来使其发出荧光光。

免疫组化详细步骤

免疫组化步骤

取组织、固定、制片(脱水、透明、浸蜡、包埋）、切片、烤片、抗原修复、滴加抗体

一、取组织

二、固定

三、制片

1、脱水透明的酒精梯度和时间

70％酒精20min 80%酒精1h

90%酒精1h 95％酒精Ⅰ2h

95％酒精Ⅱ2h 无水乙醇Ⅰ15min

无水乙醇Ⅱ15min 无水乙醇Ⅲ15min

二甲苯酒精1：1 15min 二甲苯Ⅰ25min

二甲苯Ⅱ25min 二甲苯Ⅲ15min

2、浸蜡:石蜡融化后，在石蜡Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各浸蜡1h

3、包埋

四、切片烤片

用切片机切片，取完整组织切片放于37℃温水中展片，取完整组织于载玻片上，并放入到60℃的烤箱中烤6个小时

五、脱蜡至水

六、抗原修复

配置柠檬酸抗原修复液于微波中煮沸，在高压锅内放入自来水煮沸(不盖锅盖），将装有煮沸的抗原修复液的烧杯置于高压锅内，将水化后的玻片放入煮沸的抗原修复液中，盖上锅盖，待其压力达到最大时维持三分钟

七、取出玻片，水浴逐渐降温直至完全冷却

八、将玻片放置于塑料板上，滴加3％的过氧化氢室温孵育10min，以阻断内源性过氧化氢酶，10min过后PBS冲洗2次×3分钟

九、除去PBS（甩干或者吸水纸吸干），每张切片滴加第一抗体（稀释相应倍数），4℃过夜

十、PBS冲洗3次×2分钟，除去PBS液,每张切片滴加聚合物增强剂，室温孵育10min

十一、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加酶标抗兔聚合物，室温孵育10min

十二、PBS冲洗2分钟×3次，除去PBS，每张切片滴加新配制的DAB（二氨基联苯胺)，室温孵育2～10分钟，显微镜观察

免疫组化试验步骤

免疫组化试验是一种常用的实验方法，以下是一般的免疫组化试验步骤：

1. 组织制备：将要分析的组织样本切片，通常使用冷冻切片或石蜡包埋切片。

2. 抗原解表：将切片进行脱变性处理，通常使用甲醛或乙醇溶液进行固定。

3. 抗体制备：选择合适的抗体，通常包括主抗体和辅助抗体。主抗体可以是单克隆或多克隆抗体，用于特异性识别目标抗原。辅助抗体主要是用于信号增强，如荧光标记或酶标记。

4. 抗体处理：将抗体溶液加到脱变性的切片上，使其与靶抗原结合。可以进行孵育，增加结合效率。

5. 洗涤：使用缓冲液或洗液对切片进行多次洗涤，去除未结合的抗体。

6. 信号显现：根据实验目的，可以使用荧光信号或酶信号进行检测。如果使用荧光信号，可以用荧光显微镜观察；如果使用酶信号，可以使用底物显色法，如DAB法或ABC法。

7. 洗涤：再次对切片进行洗涤，去除信号显现过程中的底物或荧光引物。

8. 盖片封装：将切片用透明胶片或硬化剂封装在玻片上，以保护样本。

9. 观察和分析：将封装好的切片放在显微镜下观察，并使用图像分析软件对结果进行定量分析。

以上是一般免疫组化试验的步骤，实际操作可能会根据实验目的与条件有所调整。