切片、免疫组化步骤
免疫组化实验的详细步骤
免疫组化实验的详细步骤1. 制备组织切片- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片- 将切片贴附到载玻片上2. 脱蜡和水化- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片3. 抗原修复- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭5. 加入封闭液- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合6. 加入一抗- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时7. 加入二抗- 洗去未结合的一抗- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)8. 加入探针- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素9. 显色- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀- 荧光免疫组化:不需要此步骤10. 染色和封片- 用苏木素对细胞核进行复染- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片11. 观察结果- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。
准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。
免疫组化步骤
免疫组化操作方法一、脱蜡1. 将组织切片至于玻片加上，65°C烘箱烘烤2-4小时，是石蜡完全熔融。
2. 将烘烤充分的切片迅速置入二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第二缸二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第三缸二甲苯中，浸泡10min。
3. 从二甲苯中取出切片，尽量沥干二甲苯，置入无水乙醇中，浸泡3min；取出，置入第二缸无水乙醇中，浸泡3min；取出切片，再依次置入90%、80%、70%酒精中梯度水化，各浸泡3min。
（切片脱蜡复水目前仪器自动完成）4.，PBS冲洗2-3次，每次3-5min，3% H2O2室温孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
二、抗原修复（以EDTA(PH 8.0/9.0)为例，常用的还有枸橼酸)1. 用流水冲洗切片1-2min，洗净切片表面的酒精；取出切片，用蒸馏水润洗切片表面2-3次，每次3-5min。
2. 将切片置入已经在电饭煲（沸水浴）中预热充分的EDTA中，持续水浴煮沸20min，再将电饭煲切换至保温档保温10min。
（实际操作：微波炉高火8min*2）3. 取出修复盒，使其自然冷却至室温。
三、封闭1. 取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的EDTA 3次，每次3min。
2. 用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。
3. 将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液（注意擦拭方式，以防抹掉玻片上的组织）。
4. 将切片置于湿盒上，滴加5%的BSA，37°C培养箱孵育30-40min（或4°C冰箱孵育过夜）。
四、一抗孵育1. 取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的BSA 3次，每次3min。
2. 用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。
（大多数时候步骤1. 2 不做，可直接擦拭干净BSA 滴加稀释好的一抗）3. 按照一定的稀释比例，用抗体稀释液稀释抗体。
免疫组化试验步骤
免疫组化试验步骤第一步：标本处理1.收集样本：选择适当的组织或细胞样本，如活体组织、固定组织切片或悬液细胞。
2.固定样本：使用适当的固定剂，如乙醛或甲醛，对活体组织进行固定，使其保持形态和抗原性。
对于细胞悬液，可以将其离心收集，并用固定剂固定在载玻片上。
第二步：抗原暴露1.脱蜡和再水化：对于固定的组织切片，将其从石蜡脱蜡，并通过一系列浓度逐渐降低的乙醇溶液进行再水化。
这将使得抗体能够更好地与组织中的抗原结合。
2.抗原恢复：有时，抗原可能由于固定和脱蜡过程中的处理而发生损失。
此时，可以使用草酸、酶或高温等方法进行抗原恢复，以暴露隐藏的抗原。
第三步：阻断非特异性结合活性1.非特异性结合抑制：为了防止抗体结合到非特异性组织或细胞上，需要对样本进行预处理。
可以使用一种含有蛋白质（如牛血清蛋白）的缓冲液，在样本中进行非特异性结合的阻断。
第四步：抗体结合1.抗体选择：选择能够与目标抗原特异性结合的抗体。
根据需要选择一抗或二抗，并确保它们具有卓越的特异性和亲和力。
2.抗体检测：将选定的抗体加入样本中，将其与样本中的目标抗原结合。
可以通过直接标记或间接标记的方式将抗体与反应物进行结合。
第五步：染色和可视化1.染色方法：对于直接标记的抗体，可以使用染色物质（如荧光染料或酶底物）直接对抗体进行染色。
对于间接标记的抗体，可以使用特异性的二抗结合剂与一抗结合，并使用染色物质进行可视化。
2.显微镜观察：将样本放置在显微镜下观察，并通过荧光显微镜或酶标仪等设备进行图像捕获和分析。
第六步：结果分析1.图像分析：对于荧光染色的样本，可以使用图像处理软件对图像进行分析，包括定量测量染色的强度和分布。
2.定量分析：根据样本中染色物质的强度和分布，可以计算抗原的相对表达量，并与其他样本进行比较和统计分析。
以上就是免疫组化试验的主要步骤。
根据实验的具体要求和抗体的选择，步骤中的一些细节可能会有所不同。
不过总体来说，这些步骤提供了一种标准的操作方法，用于研究蛋白质在细胞和组织中的分布和表达情况，并在生物医学研究、诊断和治疗中发挥重要作用。
冰冻切片免疫组化染色步骤
冰冻切片免疫组化染色步骤一、前言冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
本文将详细介绍这些步骤。
二、样品处理1. 采集样品首先需要采集需要检测的样品。
比较常见的样品包括动物或人类组织、细胞培养物等。
2. 固定样品采集好的组织或细胞需要进行固定处理，保证其形态和结构不受损伤。
固定处理一般使用4%多聚甲醛或4%乙醛进行。
3. 脱水处理为了使样品更易于切割，需要对其进行脱水处理。
脱水处理可以通过将固定好的组织或细胞分别浸泡在70%、80%和95%乙醇中进行。
4. 包埋处理最后，将脱水后的样品进行包埋处理，即将其置于石蜡中，并逐渐加热至60℃以上，直到石蜡完全浸透到样品中。
三、切片1. 制备切片将包埋好的样品切成5-10微米厚的切片。
这一步需要使用专业的冰冻切片机进行，确保切片质量。
2. 将切片悬浮在载玻片上将制备好的切片悬浮在载玻片上，并进行干燥处理。
这一步需要注意，避免样品受到外界污染。
四、抗体染色1. 抗原修复为了提高抗体的结合效率，需要对样品进行抗原修复处理。
这一步可以通过加热或酶解等方式实现。
2. 阻断非特异性结合为了避免非特异性结合，需要在抗体染色前对样品进行阻断处理。
常用的阻断剂包括牛血清白蛋白和小鼠IgG等。
3. 抗体染色将已经稀释好的一抗和二抗依次加入到载玻片上，并进行孵育处理。
这一步需要注意控制反应时间和温度等因素。
4. 显色与荧光显微镜观察最后，通过加入显色剂或荧光染料实现蛋白质的可视化。
观察过程需要使用荧光显微镜进行。
五、总结冰冻切片免疫组化染色是一种常用的技术，可以用于检测蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
该技术需要经过多个步骤，包括样品处理、切片、抗体染色等。
在实验过程中，需要注意控制反应时间和温度等因素，以确保实验结果的准确性。
免疫组化流程
免疫组化流程免疫组化是一种利用抗体与特定抗原结合的技术，用于检测细胞或组织中特定分子的存在和分布。
其流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
本文将以免疫组化的流程为主线，介绍各个步骤的具体操作方法和注意事项。
第一步是标本制备。
要制备免疫组化的标本，可以使用细胞悬液、细胞刮片、冰冻切片或石蜡切片等。
标本制备的关键是保持细胞和组织的完整性和形态。
对于固定的细胞和组织，需要将其处理成适合免疫组化的形式，例如通过冰冻切片或石蜡切片的方法。
第二步是脱脂。
脱脂是将细胞或组织中的脂肪和非脂肪物质去除的过程，以便更好地显示目标分子的分布。
通常可以使用乙醇、醚或甲醇等有机溶剂进行脱脂处理。
需要注意的是，脱脂时间不宜过长，否则可能导致抗原失活。
第三步是抗原修复。
抗原修复是为了使被固定的细胞或组织中的抗原恢复或暴露出来，以便与相应的抗体结合。
常用的抗原修复方法包括煮沸法、酶解法和酸碱解法等。
不同的抗原修复方法适用于不同的标本类型和抗原性质。
第四步是抗体处理。
在免疫组化中，需要使用一种与目标分子特异性结合的抗体。
通常可以使用一抗和二抗的结合用于检测。
一抗是与目标分子特异性结合的主抗体，而二抗则与一抗结合，用于产生荧光或酶标信号。
在抗体处理过程中，需要进行固定、洗涤和孵育等步骤。
第五步是染色。
染色是将经过抗体处理的样本显色或标记的过程，以便更好地观察目标分子的分布。
染色的方法可以根据需要选择，常用的有免疫荧光染色、酶标染色和银染等。
在染色过程中，需要根据实验要求和标本特点进行适当的控制，以获得准确的染色结果。
最后一步是显微镜观察。
经过以上的操作，样本已经准备好进行显微镜观察和分析。
观察时需要注意光线的调节和对焦的正确，以获得清晰和准确的图像。
同时，还需要根据实验要求和预定的结果指标进行分析和解读。
总结起来，免疫组化的流程包括标本制备、脱脂、抗原修复、抗体处理、染色和显微镜观察等步骤。
每个步骤都需要精确控制和注意细节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。
下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。
1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。
2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。
对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。
3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。
对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。
4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。
5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。
6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。
7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。
8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。
9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。
10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。
11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。
12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。
需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。
免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。
免疫组化步骤
免疫组化步骤
1，拷片：在烘干器拷片25-30分钟，温度设置为50摄氏度。
2，脱蜡：二甲苯Ⅰ液10min，二甲苯Ⅱ液10min。
3，复水：100％乙醇Ⅰ液5min，100％乙醇Ⅱ液10min，90％乙醇5min，80％乙醇5min，70％乙醇5min
4，PBS清洗3次，每次5min。
5，抗原修复：将枸橼酸放入沸腾的高压锅里预热2min，枸橼酸液沸腾后将切片浸入，盖锅盖，在高压锅内加热至沸腾（98℃-100℃），5分钟，取出冷却至室温；6，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；
7，在湿盒内滴加3％内源H2O2酶，室温10min；
8，PBS洗涤3次，每次5min
9，封闭，湿盒内滴加5％BSA，室温下15-20min，甩去多余液体；
10，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；（如在4摄氏度内过夜需要提前在37摄氏度水浴箱内复温30min。
）
11，PBS洗涤3次，每次5min；
12，滴加二抗，湿盒放于37℃水浴锅内，1h；
13，PBS洗涤3次，每次5min；
14，滴加DAB显色，37℃，10min；
15，PBS洗涤3次，每次5min；
16，苏木素复染2min，自来水冲洗；（如苏木素颜色过深，进行分化）
17，脱水：70％乙醇5min，80％乙醇5min，90％乙醇5min，100％乙醇Ⅰ5min，100％乙醇Ⅱ。
18，透明二甲苯Ⅰ10min；二甲苯Ⅱ10min。
19，树胶封片，镜检。
免疫组化切片步骤
免疫组化切片步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用抗体与组织中特定抗原结合的方法，通过染色反应来观察和定位抗原在组织中的表达情况。
它在病理学诊断、生物医学研究和药物研发中起着重要的作用。
下面将介绍免疫组化切片的步骤。
1. 标本固定免疫组化切片的第一步是对组织标本进行固定。
通常使用10%的缓冲福尔马林（formalin）溶液进行固定，固定时间一般为24-48小时。
固定的目的是保持组织形态和结构，同时保护抗原的完整性。
2. 组织处理固定后的组织标本需要进行脱水和石蜡包埋处理。
首先，将组织标本从福尔马林中取出，用流动水冲洗去除福尔马林。
然后，将组织置于逐渐升级的酒精溶液中进行脱水，通常是从低浓度（例如70%）的酒精开始，逐渐升级到高浓度（例如100%）的酒精。
脱水的目的是去除水分，使组织与石蜡相容。
3. 石蜡浸渍和包埋脱水后，组织标本需要进行石蜡浸渍和包埋处理。
将组织放入石蜡中，使用真空泵进行抽真空，以便石蜡渗透到组织内部。
然后，将组织置于石蜡中，用石蜡包裹组织标本，使其固定在切片时保持完整。
石蜡的目的是提供支撑和保护组织结构。
4. 切片制备经过石蜡包埋的组织标本需要切片制备。
使用旋转式切片机将石蜡包埋的组织标本切成薄片，通常为4-5微米厚。
切片的目的是将组织标本切割成可以在显微镜下观察的薄片。
5. 切片烘干和质控切片制备后，将切片放在烘箱中进行烘干，以去除切片中的水分。
然后，对切片进行质控，确保切片的质量和完整性。
质控包括切片染色前的切片检查和评估。
6. 抗原修复切片染色前，需要进行抗原修复。
抗原修复的目的是恢复组织中抗原的空间结构和形状，以便抗体能够有效地与其结合。
常用的抗原修复方法包括热诱导抗原修复（heat-induced antigen retrieval）和酶诱导抗原修复（enzyme-induced antigen retrieval）。
7. 抗体染色抗原修复后，进行抗体染色。
免疫组化步骤范文
免疫组化步骤范文免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种应用于组织学研究中的技术方法，用于检测和定位特定的抗原或蛋白质在组织或细胞中的表达。
免疫组化可以提供细胞和组织的一些重要信息，如蛋白质分布、定位和表达的数量。
以下是免疫组化的一般步骤：1.材料准备：-组织切片：将组织固定、包埋和切片。
-切片预处理：将切片置于载玻片上，并进行脱脂、水洗和固定处理。
2.抗原修复：-如果组织经过了形态改变或抗原损失，需要对切片进行抗原修复。
常见的方法有热处理（如煮沸、加热蒸汽、加热压力等）和酶处理（如胰蛋白酶、丝氨酸蛋白酶等）。
3.阻断非特异性结合：-切片上的非特异性结合位点可能与前体抗体非特异性结合，导致假阳性结果。
因此，需要将非特异性结合位点进行阻断，通常使用牛血清蛋白（如BSA或NGS）或非特异性抗体进行阻断。
4.一抗处理：5.洗涤：-用缓冲液对切片进行洗涤，以去除未结合的一抗和非特异结合的物质。
6.二抗处理：-加入二抗，即针对一抗的抗体。
二抗通常是与标记物连接的抗体，可以是荧光染料、酶或金纳米等。
7.洗涤：-用缓冲液对切片进行洗涤，以去除未结合的二抗和非特异性的结合。
8.标记物检测：-标记物可以是荧光染料、酶或金纳米等，它们与二抗结合形成复合物，并可通过荧光显微镜或酶反应显色方法来观察。
9.洗涤和封片：-用缓冲液对切片进行彻底的洗涤，以去除未结合的标记物或荧光染料。
然后，将切片用有机溶剂除去水分，然后使用封片剂覆盖并封装切片。
10.观察和分析：-将切片放入显微镜下观察和分析，如荧光显微镜观察、酶反应显色方法观察等。
可以通过比较反应强度、分布和定位等特征来分析抗原或蛋白质在组织或细胞中的表达情况。
以上是一般的免疫组化步骤，具体操作可能会根据实验设计和研究目的的不同而有所差异。
在进行免疫组化实验时，需要严格控制实验条件和相应的质量控制，以确保结果的可靠性和准确性。
此外，还需要根据具体的实验需求选择合适的抗体、标记物和检测方法，以及根据组织类型和抗原性质选择适当的抗原修复和阻断非特异性结合的方法。
免疫组化怎么做
免疫组化怎么做
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种在组织切片中使用抗体标记的方法，用于检测和定位特定蛋白质在组织中的表达和分布情况。
下面是免疫组化的一般步骤：
1. 固定组织：采集组织样本后，使用适当的组织固定剂将组织固定，以保持其形态和结构。
2. 切片制备：将固定的组织样本进行蜡块包埋或冷冻切片，并进行切片制备，以获得薄片。
3. 抗原恢复：在切片上进行抗原修复，以恢复抗原的免疫活性。
这通常通过热处理（如在高压锅或微波炉中加热样本）或酶消化来实现。
4. 阻断非特异性结合：使用一定的阻断剂，如动物血清或蛋白质阻断剂，来阻断非特异性结合。
5. 一抗反应：将待检测的一抗加入切片中，使其与靶蛋白结合。
一抗通常是通过小鼠或兔子产生的单克隆或多克隆抗体。
6. 二抗反应：加入与一抗同种动物种属产生的二抗，如小鼠或兔子抗小鼠或兔子的二抗。
这些二抗可以与一抗结合，从而形成复合物。
7. 可视化：使用适当的检测系统（如酶标法、荧光法或金标法）来对二抗进行可视化，以显示靶蛋白的定位和表达情况。
8. 盖玻片：将切片洗涤并用透明包玻片覆盖。
9. 观察和分析：使用显微镜观察组织切片，检查靶蛋白的表达和分布情况。
根据需要，可以使用计算机图像分析系统对切片进行定量分析。
以上是免疫组化的一般步骤，实际操作中可能会根据具体实验目的和试剂的不同进行一些微调和优化。
免疫组化超详细步骤
免疫组化超详细步骤免疫组化是用抗体识别特定蛋白质来检测组织和细胞中的蛋白质表达。
其可广泛应用于病理学、生理学和生物学等领域中。
下面将详细介绍免疫组化的步骤。
1. 组织处理首先，需要采集样本组织，常见的样本来源包括活体组织、固定组织和石蜡包埋切片。
不同的组织来源需要采用不同的处理方法。
对于新鲜的活体组织，可以通过切片、离心、冷冻等手段进行处理。
而对于已固定的组织，需要进行脱水、清洗、去蜡等前处理步骤。
同时，还需要注意保护蛋白质的完整性，以免影响后续细胞学的表达情况。
2. 抗原修复样本经过前处理后，可能会发生抗原损失或失活现象。
为了提高蛋白质的表达和稳定性，需要进行抗原修复处理。
一般采用的方法包括微波处理、煮沸处理、酶切处理等。
3. 样本烘干对于已经进行过前处理和抗原修复的样本，需要进行烘干处理，以免影响后续染色结果。
常见的方法包括空气干燥、乙醇除水、真空蒸发等。
4. 抗体选择根据实验需求，选择合适的一抗和二抗。
一抗是特异性识别目标抗原的抗体，一般是单克隆或多克隆的小鼠、兔、鸡等动物来源。
二抗是与一抗特异亚型相对应的抗体，主要用于增强信号。
二抗一般来自于不同阳性动物中。
5. 抗体稀释选定好的一抗和二抗，需要进行适当的稀释。
稀释倍数应根据抗体的浓度来控制，以获得最佳的信号与噪声比。
6. 组织切片将已处理好的组织切片成合适的大小，并摆放到载玻片上。
可以选用切片机、剪刀、切片钳等工具进行处理。
7. 抗体染色将稀释好的一抗液滴加到组织切片上，尽量润滑整个切片表面。
然后将切片在湿润的环境中孵育2-6小时，让一抗充分和目标蛋白质结合。
之后，将二抗液滴加到组织切片上，孵育30-60分钟。
通过荧光、酶标记、颜色标记等方式进行检测。
8. 洗涤处理组织切片在染色过程中会出现背景颜色可能会较强，影响实验结果的情况。
为了去除这些杂质，需要对切片进行洗涤处理。
一般采用的方法为不同性质的缓冲液进行多次反复的洗涤处理。
9. 封片组织切片染色完毕后，需要经过封片过程。
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理一、前言免疫组化是一种常用的实验技术，它可以用来检测组织或细胞中的蛋白质表达及其分布情况。
本文将详细介绍免疫组化的步骤及原理。
二、免疫组化的步骤1. 取材首先需要取得需要检测的样本，可以是活体组织或固定后的切片。
对于固定后的切片，需要进行脱水、透明化和包埋等处理。
2. 制备切片将取得的样本制备成厚度为4-6μm的切片，并将其放置在载玻片上。
然后进行脱蜡和再水化处理，以便后续步骤的顺利进行。
3. 抗原修复抗原修复是为了恢复经过固定和包埋处理后被破坏或掩盖了的抗原性位点，使其能够被抗体识别。
抗原修复方法有多种，如高温加压法、微波辅助法等。
4. 阻断非特异性结合位点在进行免疫反应之前，需要阻断非特异性结合位点以减少假阳性结果。
常用的方法是使用牛血清白蛋白、小鼠IgG等。
5. 抗体孵育将特异性的一抗加入载玻片上，在恰当的条件下孵育一段时间，使其与靶分子结合。
然后用洗涤缓冲液洗去未结合的抗体。
6. 二抗孵育加入与第一抗体来源物种不同的二抗，使其结合到第一抗体上。
通常二抗会标记有荧光素、辣根过氧化物酶等标记物，以便于检测。
7. 洗涤在每个孵育步骤之后都需要进行洗涤，以去除未结合的分子和杂质。
洗涤缓冲液可以是PBS、TBST等。
8. 显色对于标记有辣根过氧化物酶等标记物的二抗，需要使用底物进行显色。
底物包括DAB、VIP等，在加入底物之前需要在载玻片上加入过氧化氢等催化剂。
9. 盖片封装最后将载玻片盖上盖片，并使用透明胶水进行封装。
这样可以保持样本的湿度和防止样本污染。
三、免疫组化的原理免疫组化的原理基于抗原与抗体的特异性结合。
抗原是指能够被免疫系统识别并引起免疫反应的分子，如蛋白质、多肽等。
抗体是由B细胞分泌的一种具有特异性结合能力的分子，可以识别和结合到相应的抗原上。
在进行免疫组化实验时，首先需要选择一种特异性较高的一抗，使其与靶分子结合。
然后加入来源于不同物种的二抗，使其与第一抗体结合。
免疫组化步骤
1.石蜡切片, 60摄氏度烤片1小时.2.脱蜡: 依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精, 二甲苯浸泡10分钟, 酒精浸泡5分钟.3.抗原修复: 在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再蒸煮一次，冷却至室温. 或用高压锅煮沸3分钟后冷却至室温。
4.灭火内源性过氧化氢酶：在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2浸泡10min。
5.血清封闭：将载玻片置于PBS中5min，洗2次，马上加上山羊血清封闭液。
6.加一抗：如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。
加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜。
MG7 使用浓度为2ug/ml左右; MG5使用浓度为3ug/ml左右(推荐1:100)；7.加二抗：PBS中洗3次，每次5min，加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。
8.加显色剂：PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。
镜下观察组织染色情况，适可而止。
9.复染：将显色后的片子用清水冲洗15分钟后，浸泡于苏木精中染色，一般为1-3分钟。
10.脱水：将复染后的片子置于水中冲洗5分钟后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。
每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。
11.封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。
抗体保存：分装后10-20ul/支存于-80摄氏度。
使用后剩余抗体存于4摄氏度不超过一周。
避免反复冻融。
冰冻切片免疫组化
冰冻切片免疫组化 The document was prepared on January 2, 2021
1 冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟（另：丙酮先在-20C 预冷,然后在4C固定片子15分钟,固定后在室温下干燥后再做免疫组化），PBS洗，5分钟×3。
2 用3％（另 %）过氧化氢孵育5~10分钟（另：最好是用3%H2O2/甲醇溶液，室温20分钟。
此配方不易产生脱片。
配制方法是在9ml甲醇中加30%H2O2 1ml，混匀后使用，每次新鲜配制），消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2。
3 5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，
4 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5 回收一抗，PBS冲洗，5分钟×3次。
6 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
7 PBS冲洗，5分钟×3次。
8 显色剂显色（DAB或AEC）。
10 自来水充分冲洗，复染，封片。
如果你的组织曾放在多聚甲醛中固定的话，建议还是抗原修复效果比较好，如果没在甲醛中浸泡，无需抗原修复。
如果你的片子切完后在冰箱中保存的话，做之前，从冰箱取出后先室温半小时，然后入37℃烤箱一小时，再进行免疫组化实验，掉片现象会少一点。
我们以前片子从-20℃取出后，接着就做免疫组化，片子掉得很多。
免疫组化步骤及原理
免疫组化步骤及原理免疫组化是一种用于检测和定位特定细胞组织中特定分子的技术。
它可以帮助我们研究细胞的结构和功能，并在疾病诊断和治疗中发挥重要作用。
以下是免疫组化的步骤及其原理。
步骤一：标本固定免疫组化的第一步是将待检测组织样本固定在载玻片或其他固定载物上。
常用的固定剂包括福尔马林（formalin）和牛血清白蛋白（BSA）。
固定的目的是保持组织的形态结构并防止其腐解。
步骤二：脱水和去蜡接下来，固定的组织样本通常需要通过一系列酒精浓度逐渐脱水，然后使用组织蜡进行浸泡固化。
蜡浸泡的目的是保护组织细胞结构，并便于切片及后续的免疫标记。
步骤三：抗原暴露在进行免疫组化之前，需要通过抗原暴露步骤使组织样本中的目标分子或抗原暴露出来，便于其和抗体的结合。
这可以通过热处理（如加热松弛），酶解（如胰蛋白酶消化）或抗原修复剂（如热带缓冲液或消化酶）进行。
步骤四：非特异性结合位点的阻断为了阻断非特异性结合位点，需要在进行免疫反应之前进行非特异性抗体预处理。
这可以通过与蛋白质或动物血清结合的非免疫球蛋白（如Bovine Serum Albumin，BSA）或鱼胶（Fish Gelatin）来实现。
这样，可以降低背景信号并提高特异性。
步骤五：抗体结合在免疫组化过程中，使用特异性抗体与待检测的目标分子结合形成免疫复合物。
这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。
单克隆抗体是由同一B细胞产生的一类抗体，具有高度特异性，并且可以与特定的抗原结合。
多克隆抗体则由多个B细胞产生，可以结合目标分子的多个表位。
步骤六：荧光或酶标记的二抗结合为了检测抗体和目标分子的结合，可以使用荧光染料或酶标记的二抗。
荧光染料（如FITC，Cy3，Cy5等）可以在荧光显微镜下观察到相应的光信号。
酶标记的二抗通常使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）来标记，这些酶可以催化或参与染色反应，并在光镜下呈现颜色。
步骤七：显色和观察显色的方法根据使用的标记物不同而有所不同。
免疫组化流程
免疫组化流程免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种通过检测组织中特定抗原蛋白的存在和定位的技术。
它在病理诊断、研究和药物开发中起着重要作用。
免疫组化流程主要包括标本处理、抗原修复、抗体染色和结果分析等步骤。
首先，标本处理是免疫组化流程中的第一步。
组织标本通常是从病理切片或细胞培养物中获取的。
标本需要经过固定、脱水、透明化等处理，以保持组织的形态结构和抗原的完整性。
固定可以使用福尔马林或其他化学试剂，脱水则是将组织中的水分逐渐置换为透明剂，如醇和二甲苯。
透明化后，标本被包埋在蜡块中，使其能够被切片。
接下来是抗原修复步骤。
在标本处理过程中，抗原可能会因为固定和包埋的影响而发生变性或者掩盖。
因此，需要通过加热或酶处理等方法来修复抗原。
常用的抗原修复方法包括热诱导抗原修复（heat-induced epitope retrieval, HIER）和酶诱导抗原修复（enzyme-induced epitope retrieval, EIER）。
这些方法可以使抗原重新暴露，提高抗体的结合效率。
随后是抗体染色步骤。
选择合适的一抗和二抗是关键。
一抗是指直接与目标抗原结合的抗体，而二抗则是与一抗结合的抗体。
在染色过程中，一抗首先与标本中的抗原结合，然后通过二抗与标记物（如酶、荧光物质）结合，形成可见的染色产物。
常用的标记物有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）等。
染色后，标本需要经过反染、脱水、透明化等步骤，最终被封片封存。
最后是结果分析步骤。
通过显微镜观察染色后的标本，评估抗原的表达情况和定位。
根据染色的强度、范围和细胞定位等信息，对标本进行定性和定量分析。
结果分析还需要结合临床和病理信息，最终得出诊断或研究结论。
总的来说，免疫组化流程是一个复杂而精细的过程，需要严格控制各个步骤，确保结果的准确性和可靠性。
只有在规范的操作下，免疫组化技术才能发挥其在疾病诊断和研究中的重要作用。
免疫组化步骤：
免疫组化步骤：1. 烤片，60℃，60分钟。
2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 10min --二甲苯II 10 min--100%酒精2min --95% 2min--90%乙醇中浸泡2 min --80% 乙醇5min-- 70% 乙醇2min-- 50%乙醇2 min--双蒸水中浸泡2 min。
3. 阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；4. 抗原修复:置0.01M柠檬酸缓冲液（pH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。
5. 10% 正常羊血清工作液（PBS稀释）封闭，37℃10 min，倾去勿洗。
6. 滴加一抗（PBS稀释）4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3×5min；7. 滴加二抗（PBS稀释，II抗中可加入0.05%的tween-20），37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;8. DAPI染色10 min，PBS冲洗，5分钟×3次。
干燥，封片。
试剂配制：0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）1000ml：柠檬酸三钠3g ,柠檬酸0.4g。
1x PBS buffer（0.01M PBS）：1000mL8 g NaCl0.2 g KCl1.44 g Na2HPO40.24 g KH2PO4加800mL双蒸水中，用Hcl调pH至7.4，再加水定容至1000mL。
免疫组化问题及解决办法1、染色过强原因解决办法抗体的浓度过高或抗体孵育时间过长降低抗体滴度（一般指浓缩性抗体）抗体孵育时间：室温1小时或4℃过夜孵育温度过高，孵育温度超过37℃一般室温20-28℃DAB显色时间过长或DAB浓度过高显色时间不能超过5-10分钟，以显微镜下观察为准2、非特异性背景染色原因解决办法操作过程中冲洗不充分每步冲洗3×5组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2封闭，孵育时间延长组织中含内源性生物素正常非免疫动物血清再封闭血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间3、染色弱原因解决办法抗体浓度过低，孵育时间过短提高抗体浓度，孵育时间不能少于60分钟试剂超过有效使用期及时更换试剂操作中，滴加试剂时缓冲液未沥干，致使试剂稀释每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液（但防止切片干燥）室温太低，低于15℃若室温低于15度，要改放在37℃孵育箱孵育30-60分钟（或4℃冰箱过夜）蛋白封闭过度封闭时间不要超过10分钟4、染色阴性原因解决办法操作步骤错误重新试验，设立阳性对照组织中无抗原设立阳性对照片，以验证实验结果一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗与二抗种属无误。
免疫组化的步骤
免疫组化的步骤免疫组化是一种在细胞和组织中检测特定蛋白质的方法。
它是通过使用特异性抗体来标记和检测目标蛋白质的存在和定位。
免疫组化在生命科学研究和临床实验室中被广泛应用，可以用于研究细胞周期、诊断疾病以及评估药物治疗效果。
本文将详细介绍免疫组化的步骤。
第一步：取样和固定组织对于免疫组化分析，需要提取组织样本。
常见的样本来源包括组织切片、细胞培养物或动物实验的组织。
确保样本经过适当的处理和固定，以保持目标蛋白质的形态和结构的完整性。
常用的固定剂包括甲醛、乙醛等。
第二步：抗原修复抗原修复是为了恢复固定样本中的蛋白质的原始结构和形态。
常见的修复方法包括热处理、酶消化等。
热处理是将样本在高温水浴中加热，以使蛋白质重新展开。
酶消化是通过酶的作用，去除样本中的一些交联或修饰物质，以恢复抗原的可识别性。
第三步：抗体的选择和标记在免疫组化中，选择一个适当的抗体是至关重要的。
抗体可以选择单克隆或多克隆抗体。
单克隆抗体可以与目标蛋白质结合的特异性更高，但价格相对较高。
多克隆抗体则具有更广泛的适用范围。
抗体可以标记有不同的标记物，如荧光染料、酶或金标记等。
标记抗体的选择应基于实验目的和检测方法。
第四步：抗体和样本的孵育将选择好的抗体加入到固定样本中，使其与目标蛋白质结合。
这一步又称为孵育步骤。
孵育时间和温度取决于抗体的亲和性和实验要求。
通常，较长的孵育时间会提高目标蛋白质与抗体的结合效率。
第五步：洗涤洗涤步骤的目的是去除未结合的抗体和其他非特异性结合物质，以减少背景信号的干扰。
洗涤缓冲液的选择应根据实验要求和样本特点进行调整。
洗涤次数和时间应根据具体情况进行优化。
第六步：二级抗体的添加和孵育二级抗体是与一级抗体（与目标蛋白质结合）结合的抗体。
一级抗体通常是与标记物结合的特异性抗体，而二级抗体则是对一级抗体产生反应的抗体。
二级抗体可以标记有荧光染料、酶或其他可视化标记物。
添加二级抗体的目的是通过放大信号来增强目标蛋白质的检测。
免疫组化操作步骤
免疫组化操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种广泛应用于病理学和生物医学研究中，用于检测和定量分析组织或细胞中特定抗原的方法。
它通过将标记有特定抗体的染色剂与细胞或组织中的相应抗原结合，从而实现对抗原的定位和可视化。
以下是免疫组化操作的详细步骤：准备组织样本：1.选择需要研究的组织样本，可以是固定的组织块、冰冻切片或细胞涂片。
2.如果是固定的组织块，使用福尔马林等适当的固定剂进行固定，并进行脱水和包埋。
3.如果是冰冻切片，将组织冷冻在液氮中，使用微型切片机切割薄片。
4.如果是细胞涂片，将细胞均匀涂布在载玻片上。
脱脂和再脱水：1. 对于固定的组织块和细胞涂片，使用低渗透性石蜡溶液（如xylene）进行脱脂，一般需要多次处理。
2.使用梯度酒精浓度（例如100%，90%，80%和70%）进行再脱水处理，每个浓度的浸泡时间一般为5-10分钟。
抗原修复：1.固定的组织块可使用热诱导抗原修复（如加热高压反应釜中）或酶诱导抗原修复（如2%的蛋白酶）进行抗原修复。
2.冰冻切片和细胞涂片不需要抗原修复。
阻断非特异性结合位点：1.使用一种非特异性抗体，如牛血清蛋白、小鼠和兔血清、杂交小鼠兔血清混合物等，进行阻断非特异性结合位点，减少假阳性反应。
一抗和二抗处理：1.加入特异性一抗，该抗体将结合目标抗原。
一抗的浓度根据实验要求和文献建议进行选择。
2.在室温下，对样本进行适当时间的孵育，以便一抗与抗原结合。
4.加入标记有荧光素或酶素的二抗，如荧光素-同种同型抗体或酶标记的抗小鼠或抗兔免疫球蛋白。
5.孵育样本适当时间，以便二抗与一抗结合。
洗涤：1.使用缓冲液对样本进行洗涤，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。
2.洗涤的时间和次数根据实验要求和抗体的特性进行调整。
可视化和显色：1.对于荧光标记的二抗，使用荧光显微镜观察并拍摄图像。
2.对于酶标记的二抗，使用适当的显色物质，如DAB（3,3'-二氨基苯啶）或VIP（维泊酶）等，进行显色反应。
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冰冻切片的免疫组化染色步骤
速冻组织
将组织块平放于软塑料盖或特制小盒内（直径2cm），如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮内，大约
10-20秒组织即迅速冰冻成块。
取出组织冰块立即置入-80℃冰箱储存备用，或置于恒冷切片机冰冻切片。
冰冻切片4~8mm，冰冻切片后如不染色，必须吹干，储存低温冰箱内，或进行短暂预固定后储存冰箱内保存。
室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟。
也可根据需要选择其它的固定方式。
PBS洗，5分钟×3。
用3%过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×3。
下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤（滴加一抗开始）。
石蜡切片免疫组化染色步骤
三步法（以SP试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS 冲洗，2分钟×3次。
4. 5~10%正常山羊血清封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
7. PBS冲洗，2分钟×3次。
8. 滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~20分钟。
9. PBS冲洗，2分钟×3次。
10. 显色剂显色（DAB或AEC）。
11. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
二步法（以PV-9000通用型二步法检测试剂盒为例）
1. 石蜡切片脱蜡至水。
2. 蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，如需采用抗原修复，可在此步后进行。
3. 3% H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS
冲洗，2分钟×3次。
4. 滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5. PBS冲洗，2分钟×3次。
6. 滴加试剂1（Polymer Helper），室温或37℃孵育20分钟，PBS或
TBS冲洗，2分钟×3次。
7. 滴加试剂2（poly peroxidase-anti-mouse/rabbit IgG），室温或37℃孵
育20~30分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。
8. PBS冲洗，2分钟×3次。
9. 显色剂显色（DAB或AEC）。
10. 自来水充分冲洗，复染，脱水透明（如需要）、封片。
荧光抗体染色方法
免疫荧光染色方法注意是检查、鉴定、定位和示踪各种抗原或抗体成分。
所以对标本的基本要求是抗原的形态变化尽可能的小，不溶解或不变性，原有
位置不扩散或不移位。
因此，对标本的处理一般速度要快，温度要低。
恒冷切
片和涂片较为理想。
因此，抗体溶液的pH值和反应温度越低，孵育的时间越长。
一般37℃时需要25~60分钟。
若要作细致观察或者当天不能进行染色标
本的观察，可在5℃中过夜，但染色标本最好是当天观察。
1、直接染色法
直接染色法是以荧光标记抗体直接与标本内的抗原反应，是免疫荧光技术
中最基本、最简单的染色方法。
（1）固定：切片或涂片标本用95℃乙醇或丙酮固定。
（2）冲洗：以PBS（pH7.4）充分冲洗。
（3）染色：滴加相应的荧光抗体液，将标本放入带有湿纱布的搪瓷盒中，
在37℃作用30分钟。
（4）冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。
（5）观察：标本晾干或者加介质（缓冲甘油液）和盖片观察。
直接法首次试验时需作以下对照：
标本加正常未免疫的同种动物的标记球蛋白溶液进行染色，呈阴性反应。
标本先加同类未标记抗体作用30分钟后，PBS冲洗，再加荧光标记抗体染色。
因标记内抗原已未标记的特异性抗体反应，不再与荧光抗体结合，所以应呈现
阴性反应。
2、间接染色法
间接染色法分双层法和夹层法
（1）双层法：双层法主要定位抗原和鉴定未知抗体。
①固定：标记用丙酮或95%乙醇固定。
②冲洗：以PBS（pH7.4）充分冲洗。
③第一次作用：被检标本滴加未标记的第一抗体液，并将其放入带有湿纱
布的搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。
④冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。
⑤第二次作用：标本滴加荧光抗体（抗体Ⅱ）液，再放入湿搪瓷盒中，在37℃作用30分钟。
⑥冲洗：倾去作用液，以PBS充分冲洗。
⑦观察：标本晾干或者加介质和盖片观察。
首次试验时需作以下对照：
①标本直接滴加抗免疫球蛋白荧光抗体，呈阴性反应。
②标本加同种动物的未免疫血清，以PBS冲洗后，再加抗免疫球蛋白荧
光抗体溶液染色。
因未免疫动物的血清中无特异性抗体，应呈阴性反应。
（2）夹层法：夹层法主要示踪细胞内的免疫球蛋白
①固定：标本用丙酮或95%乙醇固定。
②冲洗：PBS冲洗。
③第一次作用：标本首先滴加与标本内抗体相应的抗原，放湿搪瓷盒中，
在37℃作用30分钟。
④冲洗：倾去作用液用PBS充分冲洗。
⑤第二次作用：标本加标记的荧光抗体溶液，放入湿搪瓷盒中，在37℃
作用30分钟。
⑥冲洗：倾去作用液，以PBS充分冲洗。
⑦观察：标本晾干或者加介质和盖片观察。