105第五章 基因工程载体

The black bars are size bars representing 100 nm.
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λ噬菌体 （lambda phage)
λ噬菌体是可以感染细菌的病毒，是大肠 杆菌的温和型噬菌体。由外壳蛋白与一个 48.6kb的双链线状DNA分子组成。经过改造形 成的λ噬菌体载体有较高的转化效率。
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融合表达载体的优点
表达效率高 融合蛋白易纯化： 抗GST的蛋白质作为特 异性抗体， 用亲和层析法从细胞裂解液中 纯化出融合蛋白； 可从融合蛋白中分离出单一的外源蛋白质 GST与外源蛋白之间克隆上蛋白酶的切割 位点，可用适当的酶切割。
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例如加装一段编码 Ile-Glu-Gly-Arg寡肽序 列的人工接头片断，该片断可被具有蛋白 酶活性的凝血因子Ⅹa切割，从Arg后切开。 目的蛋白中出现此种序列的可能性极小， 因此该方法用途广泛。
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根癌农杆菌含有一种内源质粒，当农杆菌 与植物接触时，这种质粒会引发植物产生 肿瘤，故名Ti质粒（tumor inducing plasmid）。 ）。 Ti质粒为双链环状DNA分子，200～250Kb 之间。 Ti质粒进入植物细胞的只是一小部分，约 25kb，称为T-DNA（transfer DNA）。
1.选择性标志
当使用大肠杆菌做为宿主细胞时，多使用 抗生素抗性作为筛选标志。由于酵母菌对许 多抗生素不敏感，故需要其他的筛选标志。 野生型基因：URA3（尿嘧啶）、LEU2、HIS3、 TRP1 （色氨酸） 这些基因可补偿酵母菌细胞中某一种特定的 代谢缺陷（营养缺陷）
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2 .启动子
含有可被RNA聚合酶II识别的酵母启动子 GAL、GAL10（半乳糖激酶） PHO5（碱性磷酸酶） ADH （醇脱氢酶） TP1 （丙糖磷酸异构酶） PGK （磷酸甘油酸激酶） GAP （磷酸甘油醛脱氢酶） SUC （蔗糖酶）
第五章. 基因工程载体
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基因工程所用的载体都经过人工重新构建 细菌质粒载体 λ噬菌体衍生载体 Cosmid载体（粘粒） 噬菌体M13衍生载体 Phagemid载体 酵母质粒载体 真核病毒载体
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载体类型
克隆载体与表达载体 克隆载体：携带外源DNA进入受体细胞并 使外源DNA大量扩增。 ：表达外源基因编码的蛋白质， 表达载体：表达外源基因编码的蛋白质， 载体克隆位点的上游应含有启动子，下游 含有转录终止序列。
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噬菌体（bacteriophage, phage）
噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋 体等微生物的病毒。 病毒的特性：
– 个体微小，可以通过细菌滤器 – 没有完整的细胞结构，由蛋白质和核酸组成 – 专性细胞内寄生的微生物
分布极广
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噬菌体的生物学性状
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噬菌体的生物学性状
形态
– 个体小，需用电子显微 镜观察 – 蝌蚪形、微球形和丝形
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农杆菌Ti质粒
T-DNA两端各有一个25bp的正向重复序列， 在不同的Ti质粒中是高度保守的，该序列对 于T-DNA的转移和整合是不可缺少的。 利用大肠杆菌质粒与T-DNA的部分序列重 组，构建Ti质粒克隆载体，可用于植物细胞 的基因转移。
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第三节 酵母细胞基因工程载体 酵母是最简单的单细胞真核生物。 酵母可对表达的多肽链进行加工和 修饰，如二硫键的正确形成、糖基化、 除去N－端的甲硫氨酸等。
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1 .质粒类型: 严紧型质粒(stringent plasmid)
1-5个拷贝/细胞
松弛型质粒(relaxed plasmid): 数十个/细胞 质粒在细胞中的拷贝数有时与 寄主的种类有关。
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2. 质粒载体必须具备的条件
具有复制起始位点（ori） 具有抗菌素抗性基因以便于检测含有重组质粒的 受体细胞 具有若干限制酶单一识别位点，即多克隆接头 （MCS） 具有较小的分子量（一般小于5Kb)和较高的拷贝 数
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酵母菌的克隆载体
YIP 酵母整合型质粒
YRP 酵母复制型质粒 YEP CIP 酵母附加子型载体 酵母菌着丝粒型质粒
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上述质粒均可在大肠杆菌和酵母菌中稳定 存在，即所谓的穿梭质粒 穿梭质粒。这些质粒含有 穿梭质粒 两种可供筛选的选择性标记。
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YIp载体
URA3
乳清苷酸脱羧酶
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酵母菌表达载体
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质粒 (plasmid)
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野生型质粒的特性
1. 自主复制性 质粒具有独立的复制子结构。 不受宿主细胞复制调控系统的控制。 2. 可扩增性 一个细胞内可有几个至几十个 拷贝。 3. 可转移性 在天然条件下，质粒可从一个 宿主细胞转移到另一个宿主细胞，甚至另 一种亲缘关系较近的细菌中。
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4. 不相容性（不亲和性） 具有相同或相似 复制子结构及特征的两种不同质粒，不能 稳定的存在于同一受体细胞内，这种现象 称作质粒的不相容性。 具有不同复制子结构的相容性质粒，尽管 在细胞中的拷贝数可能不同，但在细胞分 裂时，每种质粒在两个子细胞中可保持等 同的拷贝数。
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科斯质粒载体 （cosmid）
又称粘粒载体，简称粘粒。 环形双链DNA分子，一般为4～6Kb。 人工构建的含有λDNA的cos序列和pBR322 质粒序列的载体。该载体转化效率高。可容纳高 达45kb的外源DNA。以感染方式进入宿主细胞,在 宿主体内象质粒那样复制.
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粘粒载体可像质粒一样在细菌中繁殖，有 的（pWE15/16）可以在哺乳动物中繁殖。 又能像λDNA一样体外包装，并高效导入受 体细胞。 属松弛型质粒，拷贝数较多。
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3. 质粒载体的选择性标记
抗菌素抗性 新陈代谢特性
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抗菌素名称
抗菌素作用方式
宿主菌抗性机理
氨苄青霉素（ 氨苄青霉素（Amp） 干扰细菌细胞壁合成 ） Amp 氯霉素（ 氯霉素（Cml） ） 卡那霉素（ 卡那霉素（Kan） ） 链霉素（ ） 链霉素（Sm） 四环素（ ） 四环素（Tet） 抑菌剂,与 结合,干扰 抑菌剂 与50S结合 干扰 结合 蛋白质合成
CCCGCCGCTGGA 3’
在黏性末端的12个碱基中，有10个是 GC。通过碱基配对线性分子环化起来， 由此形成的双链区，叫做cos位点。
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M13噬菌体
单链DNA,基因组含6407个碱基.经过基因改 造后，形成M13mp系列。 可容纳远大于自身基因组的外源DNA,(7倍). M13噬菌体感染细胞后,不裂解宿主细胞,但 妨碍宿主细胞的生长,因此可见培养平板上 的混浊噬菌斑.
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噬斑
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单链的M13噬菌体（＋）进入受体菌后，以 自身为模板，复制出互补链（－），成为 双链的结构，称为复制型DNA。复制型 DNA在细胞内可达200个拷贝。此时， （＋）链被特异的蛋白质阻断，不再生成 新的（－）链。只能生成新的（＋）链。 （＋）链DNA被壳蛋白包装组成病毒颗粒， 挤出宿主细胞，
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氨苄青霉素 抗性基因
复制起点
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常用的质粒载体
1.pBR322 2.pUC系列:如pUC118、pUC119，两者之 间的差别在于多克隆位点不同。 3.融合表达载体：如GST融合表达系统。载 融合表达载体：如 融合表达系统。载 体中含有细菌的谷胱苷肽巯基转移酶 （GST）基因，外源基因克隆在GST基因 的下游。当基因表达时，表达产物为GST 与目的蛋白的融合体。
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非受纳细胞：SV40感染仓鼠细胞后，不产
生感染颗粒，病毒基因组整合到宿主细胞 染色体上，细胞被转化（癌变），这种啮 齿类动物细胞为SV40病毒的非受纳细胞。
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பைடு நூலகம்
逆转录病毒载体
逆转录病毒是一类单链RNA病毒。 宿主范围广，感染动物或人的细胞。 感染效率高，理论上可达100％。 具有强启动子。 不引起宿主细胞的死亡，可以维持许多代 存在问题：1.容量小，低于10kb。 2.可能引起细胞癌变。
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QIAexpress 6×His表达系统
重组蛋白质的末端带有6个组氨酸残基，对 带有Ni离子的层析介质有高度的亲和力，易 于纯化。 6个组氨酸残基质量小，不影响蛋白质的结 构和功能，无需切除。 6个组氨酸残基免疫原性差，重组蛋白可以 直接用做抗原。
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第二节 噬菌体类
噬菌体是一类细菌病毒的总称， 噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文 名为Bacteriophage,简称 简称phage。噬菌体可 名为 简称 。 以在脱离寄主细胞的状态下保持自己的生 命，但必须依赖寄主细胞才能复制生长。 但必须依赖寄主细胞才能复制生长。
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改造后的病毒优缺点
优点： 优点： 1.不需病毒颗粒的包装过程，故可插入较大长 度的DNA片段。 2.不引起宿主细胞的裂解，可建立稳定传代的 细胞株。 3.整合到宿主细胞的染色体中，重组基因不会 丢失。 缺点：转染效率低于万分之一。
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受纳细胞：SV40感染CV-1或AGMK猿猴
细胞后，产生感染性病毒颗粒，并使宿主 细胞裂解，这种感染称为裂解感染，而猿 猴细胞则称为受纳细胞
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注释：细胞内某些蛋白质丰度较高，如 PGK （磷酸甘油酸激酶）、GAP （磷酸 甘油醛脱氢酶），各占细胞总蛋白的5%， 属于高含量的蛋白质，它们的启动子为强 启动子。
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酵母分泌型表达载体
这类载体可以使目的蛋白分泌到细胞外。 载体内除含有一般表达质粒的必要成分外， 还需有一个控制蛋白质分泌的信号序列。 其编码的多肽链叫做信号肽。信号肽内多 含疏水性氨基酸。
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第一 节. 质粒
Plasmid 质粒是存在于细菌细胞染色体外、 能自主复制的小分子环状双链DNA分子。 又称为cccDNA（Covalently Closed Circular DNA）。
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野生型质粒的大小一般在2-200Kb 基因工程常用者在2-4Kb之间 质粒并不是细菌生长所必须的，但可为宿 主执行一定的遗传功能，如抗生素的抗性、 重金属离子的抗性、细菌毒素的分泌等。
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在λ噬菌体DNA分子双链的5’端，各有 一段由12个核苷酸组成的互补的单链凸出序 列，即通常所说的黏性末端。在寄主细胞内， 会通过黏性末端的互补作用，形成环型双链 DNA分子。这种由黏性末端结合形成的双链 区段称为cos位点。（cos : cohensive end site)
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3‘ GGGCGGCGACCT
编码β 内酰胺酶 内酰胺酶,切割 编码β-内酰胺酶 切割 β-内酰胺环 内酰胺环 编码乙酰转移酶,使 编码乙酰转移酶 使氯霉素 乙酰化失活
杀菌剂,与 结合,mRNA 编码氨基糖苷磷酸转移酶 编码氨基糖苷磷酸转移酶, 杀菌剂 与70S结合 结合 修饰Kan失活 失活 发生错读 修饰 杀菌剂,与 结合,mRNA 编码特异修饰酶 杀菌剂 与30S结合 结合 发生错读 抑菌剂,与 结合， 抑菌剂 与30S结合，阻止 结合 蛋白合成 编码特异蛋白,修饰细菌膜 编码特异蛋白 修饰细菌膜 结构,阻止 阻止Tet通过细胞膜 结构 阻止 通过细胞膜
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第四节 哺乳动物细胞表达载体
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病毒侵入动物细胞后，有两种生长状态 ① 溶细胞感染 病毒在宿主细胞内合成自 身的核酸和结构蛋白，装配成完整的子代 病毒颗粒，释放到细胞外，扩大感染，宿 主细胞因为代谢障碍而死亡。 ② 整合性感染 病毒核酸整合到宿主细胞 的染色体中，随细胞DNA的复制而扩增。
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病毒载体： （1）含有能够被真核细胞识别的有效启 动子 （2）在感染周期中能够持续复制，达到很 高的拷贝数。 （3）控制自己复制的元件 （4）有些载体可高效稳定地整合到寄主基 因组上 （5）外壳蛋白识别细胞受体，可将外源基 因高效导入受体细胞。
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1.SV40病毒载体 病毒载体 病毒
SV40：猿猴空泡病毒（Simian vacuolating virus 40) 环型双链DNA分子，含5243bp。 优点： 感染率高； 拷贝数高； 转录产物 优点：1.感染率高；2.拷贝数高；3.转录产物 高； 缺点：1.宿主范围窄；2.最终导致感染细胞死 亡； 3.制备耗时，成本较高。
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SV40病毒载体的改建 病毒的部分序列＋质粒的部分序列 如PSV2 包括 病毒的复制起始区、早期启动子、 增强子序列、部分t抗原基因 pBR322的复制起始区、氨苄青霉素 抗性基因
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病毒-质粒载体
病毒的早期区段和复制起点+大肠杆菌的质 粒分子重组而成。 例如：pαC10＝早期区段和复制起点（多瘤 病毒）＋质粒pBR322的部分区段 这种载体既可在大肠杆菌中复制，也可在 哺乳动物细胞中复制，称之为穿梭载体。