GC脂肪酸分析MIDI试剂的准备和抽提步骤..
脂肪酸提取试剂
脂肪酸提取试剂：试剂1-皂化试剂：NaOH 45.0 g，甲醇（色谱纯）150 mL，去离子水150 mL；试剂2-甲基化试剂：6.0 N 盐酸325 mL，甲醇（色谱纯）275 mL；试剂3-萃取溶剂：己烷（色谱纯）200 mL，甲基叔丁醚（色谱纯）200 mL；试剂4-碱洗涤剂：NaOH 10.8 g，去离子蒸馏水900 mL；试剂5-饱和NaCl：NaCl 40.0 g，去离子蒸馏水100 mL。
（1）获取菌体将培养出的微生物（细菌用TSBA培养基），取四区划线法之第三区，约40mg 左右的量，涂抹在teflon螺盖试管底部，同时做好标记。
（2）皂化1）吸取1.0mL(±0.1) 的试剂1，注入试管内，将含Teflon内垫的螺旋盖旋紧，涡旋振荡5-10 s，2）将试管放入95-100 ℃的水浴槽中5min，3）取出试管，稍冷却，不要旋松盖子，涡旋振荡5-10 s，4）放回95-100℃的水浴槽中25 min，注意盖子是否旋紧，5）取出试管，以自来水冷却。
（3）甲基化1）打开螺旋盖，加入2.0mL的试剂2，2）旋紧螺盖，涡旋振荡5-10 s，3）放入80 ℃的水浴槽中10 min，4）取出试管，以自来水冷却。
（4）萃取1）打开螺旋盖，加入1.25mL的试剂3，2）旋紧螺盖，缓慢将试管上下混匀10 min，3）打开螺盖，用玻璃滴管取出下层液体，保留上层液体。
（5）洗涤1）加入3.0mL的试剂4，2）旋紧螺盖，缓慢将试管上下混合5 min，3）静置分层，若分层不够清晰，加入4-5滴的饱和NaCl溶液，4）用玻璃滴管取出2/3的上层液体，移到GC小管中，注意不要取到下层。
气相色谱法测定脂肪酸的原理
气相色谱法测定脂肪酸的原理
气相色谱法（GC）是一种常用的分离和分析化学物质的技术。
它的原理是将待分析的混合物注入到一个高压的气相色谱柱中，通过柱内填充物的分离作用和不同组分在柱中的扩散速度差异，将混合物分离成不同的组分，并通过检测器进行检测和定量。
气相色谱法测定脂肪酸的原理是将待分析的样品（如脂肪酸混合物）注入到气相色谱柱中，通过柱内填充物的分离作用和不同脂肪酸在柱中的扩散速度差异，将不同的脂肪酸分离出来。
常用的柱内填充物包括硅胶、氧化铝、碳分子筛等，它们具有不同的分离效果和分离速度。
在分离过程中，样品组分会在柱中逐渐分离出来，并在检测器处被检测和定量。
常用的检测器包括火焰离子化检测器（FID）、热导检测器（TCD）、电子捕获检测器（ECD）等。
其中，FID是最常用的检测器，它可以将分离出来的脂肪酸离子化，产生带有正电荷的分子离子，然后在电场的作用下，将离子转化为电流信号，并进行放大和处理，最终得到脂肪酸的峰面积或峰高，从而计算出样品中脂肪酸的含量。
气相色谱法测定脂肪酸具有分离效果好、灵敏度高、分析速度快等优点，因此广泛应用于食品、饲料、医药、化妆
品等领域的脂肪酸分析。
脂肪酸、碘、磷检测的标准操作规范
2.加入无 什么？ 2分 4.甘油三酯标样 和甲酯标样的区 别？2分
2 3
结果 其它
每个问题0.5分
分数
评价人：
满分：45分 日期：
得分：
3 样品准备：样品是否混匀。
关闭天平门后是否调零点。 在天平显示为0.0000g时放入烧杯，归零去皮。 将称量容器取出后，关闭天平门进行取样（在天 平外进行）。 称量液体样品时是否盖盖。
4
称样：
不关闭天平门粗略读数，看质量是否达到要求。 若未达到要求，取出称量容器再次加（减）样品 。 若达至要求，关闭天平门，待天平稳定后读数。 称样量应在要求克数。 是否做平行实验。 称量结束，天平归零，关闭天平门。
二：脂肪酸的检测
盐酸甲醇溶液的配置（浓度及安全）是否正确。 盐酸甲醇溶液的用量是否正确。 甲苯的用量是否准确。（移液管） 溶解后的样品是否充分混匀。 保温的温度及时间是否正确。
1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 1 1 5
脂肪酸的 间隔20分钟是否振摇。 检测过程 无水碳酸钠的浓度及用量是否正确。 离心机的设置是否正确。 样品装入进样瓶的过程是否正确。 是否跟标样并根据标样的保留时间找到正确的峰 。 计算是否正确。（计算及换算系数的选用） 结果的保留位数是否正确。 读数是否准确。 准确性比对结果是否在误差范围内。（包括留样 复测、人员比对、回收率实验、基准样比对等） 其它操作方面不符合情况描述
脂肪酸检测的标准操作规范
评价对象 日期
步骤 一: 称样
1
过程注意要点
分数
1 1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
提问
操作不符合情况
准备： 是否戴白手套。 检查天平的校准日期，确认天平在检定有效期内 。 检查天平室温度、湿度。
脂肪酸抽提方法
脂肪酸抽提方法抽提步骤：（1）刮菌：将菌在216L平板上活化划出单菌后，挑单个菌落转接到Marine Agar 培养基（BD；Difco；Ref：212185），28℃避光培养48 h 左右（有一定浓度，且较为新鲜），用灭菌的长牙签将菌落刮取到脂肪酸测定管的底部，菌的湿重不得少0.4 g；（也可将鲜菌冻干后，直接称取0.02g到测定管内）（2）皂化：加入1mL 试剂1 于测定管内，充入氮气5-10s后将管盖拧紧，涡旋振荡20 s；将测定管放入超声破碎仪内超声处理10 min，再充分振荡后放入100 ℃水浴锅内加热处理25 min；每隔5min取出振荡5-10s；处理结束后放入凉水中快速冷却；（3）甲基化：在测定管内加入2 mL 试剂2，迅速将管盖拧紧（反应将生成挥发性物质），涡旋振荡20s；80 ℃水浴10 min ；处理结束后放入凉水中快速冷却；（4）萃取：在测定管内加入1.25 ml的试剂3，将管盖拧紧，涡旋振荡10 min，使萃取更充分；静置3-5 min 待溶液分层后，用干燥洁净的玻璃吸管将下层溶液吸取掉，保留上层液相；（5）洗涤：在上述溶液中加入3mL 试剂4，将管盖拧紧，涡旋振荡3-5 min，静置10-15 min使溶液分层，（对于久置后仍不能分层的样品，则加入500μL的饱和NaCl溶液，振荡后再静止使其分层）用玻璃吸管取约2/3的上清加入GC 瓶内；盖紧瓶盖，脂肪酸样品制备完成。
附录：试剂1：NaOH 45g (certified ACS)甲醇150mL (色谱纯)ddW 150mL试剂2：HCl 325mL ( 6 mol/L )甲醇275mL （色谱纯）试剂3：正己烷200mL （色谱纯）甲基叔丁基醚200mL （色谱纯）试剂4：NaOH 10.8 g (certified ACS)ddW 900mL饱和NaCl溶液：NaCl40g (certified ACS)ddW 100mL。
脂肪酸测定步骤
细胞脂肪酸组成分析Sherlock Microbial Identification System(MIS)就是一套由美国MIDI公司开发成功的微生物鉴定自动化系统，该系统操作安全、简单、快速，实验成本也相对较低。
它主要根据不同种类微生物细胞膜中磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid，PLFA)的类型和含量具有种的特异性、指示性和遗传稳定性等特殊性能对微生物进行全自动鉴定和分析，该系统备有图谱识别软件和迄今为止微生物鉴定系统中最大的数据库资源，包括嗜氧菌1 100余种，厌氧菌800余种，酵母菌和放线菌约300种，共计超过2 200种。
一、仪器设备安捷伦6 890N气相色谱、Sherlock MIS系统、旋转式混合振荡仪、水浴锅、XW．80A旋涡混合器、10 IIll带聚四氟乙烯塞的玻璃瓶等。
所有的玻璃器皿均需在马福炉中400~C烘烤1 h。
二、培养基MIDI推荐培养基--TSBA培养基：加热混合溶解30 g胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptiease soy broth，TSB)、15 g琼脂(Granulated ar)和1 L去离子水制成。
三、配置试剂（所有有机试剂均为HPLC级，无机试剂均为优级纯）溶液I（皂化试剂）：混合150 ml水和150 ml甲醇，加入45 g NaOH，同时搅拌至完全溶解。
溶液II（甲基化试剂）：325 ml 6 mol L 的盐酸加入到275 ml甲醇中，混合均匀。
溶液III（萃取试剂）：加200 ml甲基叔丁基醚到200 ml正己烷中，混合均匀。
溶液IV（碱洗液）：在900 ml去离子水中加入10.8 gNaOH，搅拌至完全溶解。
溶液V（饱和NaC1溶液）：在100 ml去离子水中加入40 g NaC1。
四、实验方法试验方法主要参照MIDI操作手册，即在培养基上28℃恒温培养细菌24 h后取菌，通过提取和分离细菌细胞膜中的磷脂脂肪酸(PLFA)，甲基化后进行气相色谱鉴定分析。
脂肪酸值的测定
脂肪酸值的测定
脂肪酸值的测定方法如下：
1、试样制备：从平均样品中分取样品约80g，粉碎，95%粉碎试样通过0.45mm孔径筛。
2、浸出：取试样10g±0.01g于150ml具塞锥形瓶中，加入50ml无水乙醇，加塞，振荡几秒后，打开塞子放气，再盖紧瓶塞置电动振荡器振荡10min，将锥形瓶倾斜静置数分钟，让试样粉粒沉降在一角。
3、过滤：小心地倾析尽可能多的上清液于铺在玻璃漏斗上的多折滤纸中，用表面皿盖在漏斗上，以减少蒸发，弃去最初几滴滤液后，用25ml比色管准确收集滤液25ml。
4、滴定：将25ml滤液移入锥形瓶中，用50ml无二氧化碳蒸镏水分三次洗涤比色管，将洗涤液一并倒入锥形瓶中，加几滴酚酞批示剂，立即用0.01mol/LKOH-乙醇溶液滴定至呈现微红色，0.5min内不消失为止，记下所耗氢氧化钾乙醇溶液毫升数(VO)。
2020版《中国药典》脂肪酸组成检验操作规程
一、目的：制订详尽的工作程序，规范检验操作，保证检验数据的准确性。
二、范围：本操作规程适用于供药用或药用辅料的脂肪酸组成的测定。
三、职责：1、检验员：严格按操作规程操作，认真、及时、准确地填写检验记录；2、化验室负责人：监督检查检验员执行本操作规程。
四、内容：1、供试品溶液的配制：除另有规定外，取供试品0.1g，置50ml回流瓶中，加0.5mol/L 氢氧化钠甲醇溶液4ml，在水浴中加热回流直至油滴消失，（通常约10分钟），放冷，加14%三氟化硼甲醇溶液5ml，再在水浴中加热回流2分钟，放冷，加正庚烷4ml，继续在水浴中加热回流1分钟后，放冷，加饱和氯化钠溶液l0ml，摇匀，静置使分层，取上层液，经无水硫酸钠干燥，作为供试品溶液。
2、系统适用性溶液的配制：分别取硬脂酸甲酯、棕榈酸甲酯和油酸甲酯10mg，置100ml 容量瓶中，用正庚烷溶解并稀释至刻度，制成每lml中各约含O.lmg 的溶液，作为系统适用性溶液。
3、色谱条件及操作方法：照气相色谱法(见EKSOP-QC7039气相色谱检验操作规程)试验，采用以聚乙二醇（或极性相近）为固定液的毛细管色谱柱（30m×0.53mm，1.0μm)，起始温度为70℃，维持2分钟，以每分钟5℃的速率升温至240℃，维持24分钟；进样口温度为 220℃；检测器温度为260℃。
取系统适用性溶液1ul注入气相色谱仪，记录色谱图，棕榈酸甲酯峰和硬脂酸甲酯峰相对于油酸甲酯峰的保留时间分别约为0.87和0.99，理论板数按油酸甲酯峰计算不低于10000,各色谱峰的分离度应符合要求。
取供试品溶液1μl，注入气相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化法计算各脂肪酸甲酯的含量。
五、参考文献：药品生产质量管理规范（2010年修订）《中国药典》2020年版通则0713六、相关文件：七、相关记录：N/A八、变更记录及原因：。
GC脂肪酸分析MIDI试剂的准备和抽提步骤分解
TSBA培养基是针对嗜氧菌(TSBA Media for Aerobes: TSBA6数据库)Trypticase Soy Broth Agar(TSBA)培养基是嗜氧菌标准的培养基。
利用以下的配方作为TSBA培养基。
供货商被建议在附加数据(Appendix A)中。
●混合在2升的锥形瓶●加热并搅拌至完全混合和琼脂(Agar)完全溶解●在温度121度及15psi下高压灭菌15分钟注意事项：不可过度加热培养基，使用高压灭菌器须有温度及时间的设定装置。
●在水浴中冷却至60度●加20-25 ml在溶解的琼脂(Agar)分装至无菌100 x 15mm直径的培养皿中，琼脂须有2.5-3.2mm深。
●允许琼脂在室温下凝固，但如果培养基想储存一段时间，必须在24小时内包装在无菌装置中。
它们可以保存在冷藏中直到使用。
注意事项——关于商业化已备好的TSBA培养基：TSBA可以从BBL购买，但需要指定货号，见附加数据(Appendix A)。
使用其它供应商提供的TSBA培养基可能会导致结果不一致，用户需要用ATCC菌株验证培养基是否效果相当。
试剂的准备 (Reagent Preparation)四种试剂要求是皂化细胞，脂化，萃取和基本洗涤脂肪酸的萃取物。
试剂应准备在干净，棕色及可标示一公升的瓶子。
放置一个Teflon-coated搅动台在每个瓶子上去添加在混合时。
只有Teflon和玻璃可以接触到试剂。
瓶子可以重新使用不须要重新浸润。
自动分注的增加备置速度但是必须准备和确定适当的操作在每批样品使用前。
确认分注试剂使用分注试剂在有刻度的量筒以达到校正效果。
以下的配方准备试剂约够300个样品或许可以在先前调整以够配合实验室的样品量，试剂准备用VPI Anaerobe Method 和数据库在Appendix B 中。
注意事项: 试剂1和4是腐蚀性和试剂2是酸性的全程配戴安全眼镜及手套，hexane 及methyl-tert-butyl ether (MTBE)在试剂3是可燃性的。
脂肪酸分析色谱柱安全操作规定
脂肪酸分析色谱柱安全操作规定脂肪酸分析是一种常用的分析技术，常用于食品、生物样品等领域的研究。
色谱柱是分析过程中必不可少的工具，其正确使用及安全操作至关重要。
本文档旨在规范脂肪酸分析色谱柱的安全操作，以确保实验室人员的人身安全和设备的正常运行。
一、领取及准备色谱柱1.实验室成员在领取色谱柱前应先了解该色谱柱的基本信息，包括：名称、型号、长度、内径、精度等。
在领取时应核对信息，确保领取正确。
2.色谱柱的存放应避免阳光直射、高温、潮湿等影响色谱柱性能的因素。
存储温度应低于室温，避免冻结。
3.在使用前，应检查色谱柱外观是否有破损、变形等问题。
如发现问题，应立即更换。
4.在连接装置前，应清洗色谱柱，并用新试剂使柱床充分浸润，以避免干旱变形。
具体清洗方法和浸润方式应根据不同类型的色谱柱而定。
二、安装及连接装置1.安装时应避免重压、拉张、扭曲等，以免引起色谱柱内部破碎和静电纸、毛刷等杂质的进入。
不得使用力量过大的工具拧紧。
2.在连接装置前应清洗色谱柱，并用新试剂使柱床充分浸润，以避免干旱变形。
具体清洗方法和浸润方式应根据不同类型的色谱柱而定。
3.如需更换连接装置，应先关闭色谱进样器，拆卸装置后再更换。
更换后应检查连接是否牢固。
三、样品拆装及处理1.在进样前样品应注明姓名、编号、日期、物质名称等信息，并做好保存。
在进样前应检查样品状态和浓度是否符合标准。
2.样品进柱前应先停止流体进口，确认样品的泵送流量和计量值是否符合要求。
样品进柱前，应将样品用滤器进行过滤，以免管道堵塞。
3.涉及有毒、易爆、易燃、腐蚀性等样品，应在安全柜内操作，避免接触皮肤、眼睛等。
4.不得在色谱柱内投入冲洗液体、溶媒和其他的化学材料，以免交叉污染或影响色谱柱的使用寿命。
四、柱床插入和排出1.柱床插入和排出时应缓慢进行，避免摩擦和碰撞而造成柱床损伤。
插入深度要适当，以插至柱床缝宽的1/3位置为宜。
2.不得在插入或排出过程中给予大力或剧烈的推拉和震动，以免引起色谱柱破裂或损坏。
提取和纯化动物组织中的脂肪酸
提取和纯化动物组织中的脂肪酸脂肪酸是一类重要的有机化合物，它们在动物体内起着重要的生理功能，如提供能量、构建细胞膜以及合成信号分子等。
提取和纯化动物组织中的脂肪酸对于了解其组成和功能具有重要意义。
本文将介绍一种常用的方法以及操作步骤，来提取和纯化动物组织中的脂肪酸。
材料与试剂准备- 动物组织样品（如肝脏、脂肪组织等）- 甲醇（HPLC级）- 氮气或氩气- 乙酸乙酯（HPLC级）- 热水浴- 玻璃离心管- 液体-液体萃取仪（如分液漏斗）- 无水硫酸钠- 无水氯化钠- 无水氯化镁- 熔点试管操作步骤1. 组织样品的制备a. 准备动物组织样品，如肝脏或脂肪组织，并将其切碎以增加提取效率。
b. 将组织样品放入玻璃离心管中，并加入适量的甲醇，使其完全覆盖组织样品。
c. 将玻璃离心管放入冰水混合物中，在低温下均匀震荡离心管至少30分钟以实现脂肪酸的萃取。
2. 脂肪酸的提取与纯化a. 准备液体-液体萃取仪，将乙酸乙酯置于漏斗中。
b. 将步骤1中的甲醇提取液转移至漏斗中并加入等体积的乙酸乙酯。
注意，使用无水乙酸乙酯可以获得更好的提取效果。
c. 轻轻摇动漏斗，使两个相互溶解的液体充分混合，形成两相体系。
d. 等待两相液分离，通常需要约15分钟。
分离后，底部的有机相富集了大部分的脂肪酸。
e. 将有机相（乙酸乙酯层）转移到一个干燥的玻璃离心管中。
f. 加入适量的无水硫酸钠，用于吸附水分，然后轻轻摇动离心管混合。
g. 将离心管置于离心机中进行离心分离。
分离后，上层的乙酸乙酯中将只包含纯化的脂肪酸。
h. 仔细将上层的乙酸乙酯转移至一个干燥的熔点试管中。
i. 加入一小撮无水氯化钠和无水氯化镁，用于吸附任何残余水分。
j. 将试管放入热水浴中，加热并用玻璃棒搅拌以去除乙酸乙酯中的残余水分。
注意，不要加热过量以避免脂肪酸的降解。
k. 待试管中的液体完全干燥后，即得到纯化的脂肪酸。
结果与讨论通过上述步骤，我们可以提取和纯化动物组织中的脂肪酸。
MIDI脂肪酸提取步骤
培养皿的建议划线法(Streaking plates)利用Sherlock MIS 鉴定微生物时，建议使用Array四区划线法(Quadrant streak pattern) (图2-2)，在该模式中，第四区有单克隆生长，以确认是否是纯培养，第三区菌落生长处于对数后期(Late Log)。
图2-2-四区画线式样(Quadrant streak pattern)从分离培养皿中选择分离良好的单克隆进行划线。
接种环采用火焰灭菌，接种环可以通过接触培养皿中无菌落的区域来冷却。
用无菌冷却的接种环挑取菌落，移至另一个新的培养皿中。
划第一区时全部的接种环都与培养基接触，所以此区域为稠密的接种培养；第二区转动接种环90°角，并且用接种环边划过第一区的角落二次，如图表的划法，连续划平行线，不再利用第一区。
接种第三区时，将接种环转动90度角并通过第二区的角落边缘二次，然后连续划平行线，不再通过第二区。
灭菌及冷却你的接种环，接种环可以通过接触培养皿中无菌落的区域来冷却。
接种第四区时，利用转动接种环90度角并通过第三区的角落边缘二次，然后连续划平行线，不再通过第三区。
这种划线方式提供了充足的材料以供分析，同时能确认所得的细菌是纯培养物。
培养条件(Incubation)大多数稳定的脂肪酸成份是从培养的对数后期（late log）中生成的。
Sherlock数据库构建时也多数选择在此培养条件下微生物。
下述的标准培养条件状况也符合多数实验室的习惯。
所使用例外的注意事项在实验室的列表在Appendix B。
选用小容积高质量的培养箱，使得生长条件可以得到良好的控制。
培养箱过大或者大量样品共用培养箱可能难以维持良好的生长条件。
不要在培养箱中残留任何消毒药剂，因为这些药剂即使在空气中只有低浓度残留，也可能影响微生物的生长。
好氧菌培养条件(Aerobic Incubation)标准的好氧菌(TSBA 50)培养性况如下:z培养温度28 ±1℃z培养时间24 ±2小时临床的好氧菌(CLIN 40)则要求的培养温度为35±1℃。
脂肪酸测定方法
脂肪酸组分分析（6）1、准确称取2 g样品，用研钵研磨至细糊状，加入5 mL提取液充分匀浆，小心转移至50 mL离心管中，残渣用15 mL提取液充分洗涤后合并至离心管中；2、密封后40 C水浴条件下超声波提取30 min （期间可振荡混匀2-3次），然后室温条件下4,000X g离心5 min;3、将上层有机相转移至50 mL离心管中，原管再加入5 mL正己烷重复提取10 min, 加入5 mL蒸馏水，充分振荡混匀，然后室温条件下4,000材离心5 min;4、将上层有机相合并至50 mL离心管中，加入适量无水硫酸钠充分振荡混匀，然后室温条件下4,000材离心5 min；5、将有机相转移至50 mL蒸发瓶中蒸干，加入500卩1二氯甲烷（含0.1% BHT ），用枪头轻轻吸打至完全溶解后转移至 2 mL离心管中，蒸发瓶用500丄二氯甲烷再洗涤一次，合并有机相并混匀，然后室温条件下4,000 >g离心5 min备用；6、取2 mL 甲酯化试剂（14% BF3-CH3OH: CH2CI2: CH3OH=25: 20: 55,v/v/v ;含0.1%BHT）于带密封内衬垫的10 mL螺帽离心管中（防止有机溶剂蒸发），准确加入200丄油脂轻轻吸打混匀，密封后100 C沸水浴甲酯化30 mi|;7、将离心管转移至4 C冰箱中冷却5 min，依次加入2 mL正己烷和2 mL蒸馏水充分振荡混匀，然后4 C条件下4,000材离心5 min；8、将上层有机相转移至2 mL离心管中，加入适量无水硫酸钠充分振荡混匀，然后4 C条件下4,000 g离心5 min，将上层有机相转移至1.5 mL GC上样瓶中备用。
提取液：正己烷：丙酮：无水乙醇=50: 25: 25, v/v/v ;含0.1% BHT。
MIDI脂肪酸提取步骤
培养皿的建议划线法(Streaking plates)利用Sherlock MIS 鉴定微生物时，建议使用Array四区划线法(Quadrant streak pattern) (图2-2)，在该模式中，第四区有单克隆生长，以确认是否是纯培养，第三区菌落生长处于对数后期(Late Log)。
图2-2-四区画线式样(Quadrant streak pattern)从分离培养皿中选择分离良好的单克隆进行划线。
接种环采用火焰灭菌，接种环可以通过接触培养皿中无菌落的区域来冷却。
用无菌冷却的接种环挑取菌落，移至另一个新的培养皿中。
划第一区时全部的接种环都与培养基接触，所以此区域为稠密的接种培养；第二区转动接种环90°角，并且用接种环边划过第一区的角落二次，如图表的划法，连续划平行线，不再利用第一区。
接种第三区时，将接种环转动90度角并通过第二区的角落边缘二次，然后连续划平行线，不再通过第二区。
灭菌及冷却你的接种环，接种环可以通过接触培养皿中无菌落的区域来冷却。
接种第四区时，利用转动接种环90度角并通过第三区的角落边缘二次，然后连续划平行线，不再通过第三区。
这种划线方式提供了充足的材料以供分析，同时能确认所得的细菌是纯培养物。
培养条件(Incubation)大多数稳定的脂肪酸成份是从培养的对数后期（late log）中生成的。
Sherlock数据库构建时也多数选择在此培养条件下微生物。
下述的标准培养条件状况也符合多数实验室的习惯。
所使用例外的注意事项在实验室的列表在Appendix B。
选用小容积高质量的培养箱，使得生长条件可以得到良好的控制。
培养箱过大或者大量样品共用培养箱可能难以维持良好的生长条件。
不要在培养箱中残留任何消毒药剂，因为这些药剂即使在空气中只有低浓度残留，也可能影响微生物的生长。
好氧菌培养条件(Aerobic Incubation)标准的好氧菌(TSBA 50)培养性况如下:z培养温度28 ±1℃z培养时间24 ±2小时临床的好氧菌(CLIN 40)则要求的培养温度为35±1℃。
很专业的磷脂脂肪酸提取步骤
方法一：1) 取5 g（精确至0.01 g）大曲样品于50 mL 离心管中加25 mL Bligh-Dyer 提取液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。
2) 向离心管中加7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液，摇匀后，4℃静置过夜。
3) 4000 r/min 室温离心10 min，用无菌一次性吸管小心吸掉上清液，下层用滤纸过滤至锡纸包裹的小三角瓶中，高纯氮气吹干。
4) 用氯仿冲洗小柱，将活化后的硅胶（事先在105℃烘干1h，冷却至室温）加一定量的氯仿浸泡，用胶头吸管吸入柱中，注意滴加过程要缓慢，不要产生气泡，并保持柱子液面水平，上层氯仿高出柱子液面一部分以免柱子干涸，底部连接橡皮管，并用夹子旋紧静置1~2h。
5) 待柱子稳定后再用氯仿小心重洗柱子，在样品三角瓶中加300 μL 氯仿溶解样品，用吸管转移至柱中，分别用10 mL 氯仿、10 mL 丙酮洗柱，10 mL 无水甲醇对样品进行洗脱，加无水甲醇后，开始用试管接收样品，并用高纯氮气吹干。
6) 往试管中加1 mL 甲醇甲苯混合液（1:1，V/V）和1 mL 0.2 mol/L 氢氧化钾甲醇溶液，37℃，水浴15 min。
7) 再加0.3 mL 1 mol/L 乙酸、2 mL 正己烷氯仿混合液和2 mL 灭菌去离子水，振荡分离，静置1 h 分层。
8) 将上层小心转移至另一试管中，高纯氮气吹干，9) 加入2 mL 含33 μg/mL 内标十九烷酸甲基酯（nonadecanoic acid methyl ester）的有机溶剂正己烷，用注射器经有机相滤膜过滤后注入样品瓶，上机待测。
方法二：1) 取5 g（称准至0.01 g）大曲样品于50 mL 离心管中加25 mL Bligh-Dyer 提取液，充分摇匀，离心管用锡纸包裹，4℃静置过夜，分层。
2) 将上清转移至新的用锡箔纸包裹的离心管中，加入7.5 mL 氯仿，7.5 mL 柠檬酸缓冲液，混匀，4℃静置过夜；3) 4000 r/min 离心10 min，收集下层溶液，合并两次的下层溶液；4) 剩下步骤同方法一3）~9）方法三：1) 取5 g（称准至0.01 g）大曲样品于50 mL 离心管中加25 mLBligh-Dyer 提取液，离心管用锡纸包裹，250 r/min 振荡提取2 h；2) 2000 r/min 离心10 min，上清转移至以新的用锡箔纸包裹的离心管中。
脂肪酸测定步骤
细胞脂肪酸组成分析Sherlock Microbial Identification System(MIS)就是一套由美国MIDI公司开发成功的微生物鉴定自动化系统，该系统操作安全、简单、快速，实验成本也相对较低。
它主要根据不同种类微生物细胞膜中磷脂脂肪酸(Phospholipid fatty acid，PLFA)的类型和含量具有种的特异性、指示性和遗传稳定性等特殊性能对微生物进行全自动鉴定和分析，该系统备有图谱识别软件和迄今为止微生物鉴定系统中最大的数据库资源，包括嗜氧菌1 100余种，厌氧菌800余种，酵母菌和放线菌约300种，共计超过2 200种。
一、仪器设备安捷伦6 890N气相色谱、Sherlock MIS系统、旋转式混合振荡仪、水浴锅、XW．80A旋涡混合器、10 IIll带聚四氟乙烯塞的玻璃瓶等。
所有的玻璃器皿均需在马福炉中400~C烘烤1 h。
二、培养基MIDI推荐培养基--TSBA培养基：加热混合溶解30 g胰蛋白胨大豆肉汤(Tryptiease soy broth，TSB)、15 g琼脂(Granulated ar)和1 L去离子水制成。
三、配置试剂（所有有机试剂均为HPLC级，无机试剂均为优级纯）溶液I（皂化试剂）：混合150 ml水和150 ml甲醇，加入45 g NaOH，同时搅拌至完全溶解。
溶液II（甲基化试剂）：325 ml 6 mol L 的盐酸加入到275 ml甲醇中，混合均匀。
溶液III（萃取试剂）：加200 ml甲基叔丁基醚到200 ml正己烷中，混合均匀。
溶液IV（碱洗液）：在900 ml去离子水中加入10.8 gNaOH，搅拌至完全溶解。
溶液V（饱和NaC1溶液）：在100 ml去离子水中加入40 g NaC1。
四、实验方法试验方法主要参照MIDI操作手册，即在培养基上28℃恒温培养细菌24 h后取菌，通过提取和分离细菌细胞膜中的磷脂脂肪酸(PLFA)，甲基化后进行气相色谱鉴定分析。
脂肪酸值测定方法改良
脂肪酸值测定方法改良脂肪酸值测定方法改良文章标题：改良脂肪酸值测定方法步骤详解引言：脂肪酸值测定方法是分析食品和生物样品中脂肪酸含量的重要手段。
为了提高测定的准确性和效率，我们对传统的脂肪酸值测定方法进行了改良。
本文将详细介绍改良后的测定方法的步骤。
第一步：制备样品1. 选取代表性样品，如食用油、肉类或乳制品等。
2. 将样品粉碎或搅拌均匀，确保样品内脂肪酸的均匀分布。
第二步：提取脂肪酸1. 取适量的样品，将其加入提取溶剂中，如正己烷/异辛烷混合溶剂。
2. 使用超声波浴或其他适当的方法，将样品与溶剂充分混合。
3. 进行离心分离，将上清液收集到一个新的离心管中。
第三步：甲酸酯化反应1. 取适量的上清液，加入甲酸和硫酸甲酯催化剂。
2. 将混合物进行加热，通常在60-70°C反应2-3小时，使样品中的脂肪酸与甲酸形成甲酸酯。
3. 冷却混合物至室温。
第四步：提取甲酸酯1. 加入适量的无水氯化钠溶液，使甲酸酯与水相分离。
2. 轻轻摇匀混合物，并离心分离，收集上清液。
第五步：洗涤和浓缩1. 加入适量的碳酸钠溶液，用来中和残留的酸性物质。
2. 使用无水氯化钠溶液进行反复洗涤，以去除杂质和离子。
3. 使用旋转蒸发仪将洗涤后的上清液浓缩至干燥。
第六步：衍生化1. 加入适量的二氯甲烷和硫酸氢钠，进行衍生化反应。
2. 用氮气吹干样品，直到蒸发至干燥。
第七步：气相色谱分析1. 将样品溶解于适量的溶剂中，如己烷。
2. 使用气相色谱（GC）仪器进行分析，选择适当的柱和检测器，如化学电离检测器（FID）。
3. 根据脂肪酸的保留时间和峰面积，计算样品中各种脂肪酸的含量。
结论：通过对传统脂肪酸值测定方法的改良，我们成功地提高了测定的准确性和效率。
这一改良方法可以在食品安全和营养研究中得到广泛应用，为相关领域的进一步研究提供了有力的支持。
脂肪酸测定方法优化
脂肪酸测定方法优化脂肪酸测定方法优化脂肪酸测定方法是研究生物体内脂肪的组成和含量的重要手段。
本文将根据优化脂肪酸测定方法的步骤进行阐述。
第一步是选择合适的样品处理方法。
样品处理对于脂肪酸测定的准确性和灵敏度至关重要。
常用的样品处理方法包括溶解、提取和酶解等。
根据不同样品的特点和需要测定的脂肪酸类型，选择合适的样品处理方法非常重要。
第二步是脂肪酸的提取。
样品中的脂肪酸需要通过提取才能得到。
一般常用的提取方法有溶剂提取和气相微量提取等。
溶剂提取常用的溶剂有正己烷、乙醇、二甲基亚砜等。
提取方法的选择要根据不同样品和实验需要进行优化。
第三步是脂肪酸的甲酯化。
甲酯化是将脂肪酸转化为易于检测的甲酯形式的过程。
常用的甲酯化试剂有氢氧化钠甲醇溶液、硫酸甲醇溶液等。
甲酯化反应条件的优化是为了提高反应的转化率和产率，同时减少副反应和杂质。
第四步是选择适当的测定方法。
目前常用的脂肪酸测定方法包括气相色谱法、液相色谱法和质谱法等。
根据需要测定的脂肪酸类型、测定的准确性和灵敏度，选择适当的测定方法进行分析。
第五步是方法的验证和优化。
在使用新的脂肪酸测定方法之前，需要对该方法进行验证和优化。
验证包括准确性、精密度、线性范围、检测限和选择性等指标的评估。
根据验证结果，对方法进行进一步的优化，以提高方法的准确性和可靠性。
综上所述，脂肪酸测定方法的优化需要从样品处理、提取、甲酯化、测定方法选择，以及方法的验证和优化等多个方面进行考虑。
通过不断的优化和改进，可以提高脂肪酸测定方法的准确性和可靠性，为脂肪酸研究提供更可靠的数据支持。
脂肪酸值测定方法
脂肪酸值测定方法
脂肪酸值的测定方法主要包括以下步骤：
1. 样品提取：称取适量样品，加入适量的甲醇/CH2Cl2（1:3）混合溶液，
摇匀后进行超声抽提。
取出离心管进行离心，收集上清液，重复几次，直至萃取完成。
2. 皂化：在萃取液中加入适量的碱溶液（如6%KOH的甲醇溶液），进行
碱水解。
然后加入正己烷进行萃取，弃去上层正己烷萃取液，重复几次，直至皂化完成。
3. 衍生化：将上述萃取液转移到带盖玻璃管中，用氮气吹干后，加入适量的衍生化试剂（如BF3-MeOH），密闭后在一定温度下加热一段时间。
待样
品冷却后，加入适量的盐溶液，用正己烷萃取，转移至进样瓶中，氮气吹干，待分析。
4. 色谱分析：在气相色谱仪上进行色谱分析，使用合适的色谱柱、升温程序、进样口温度等条件，测定样品中脂肪酸的值。
5. 结果计算与评价：根据色谱图中的峰面积或峰高，计算脂肪酸值。
可以使用外标法或内标法进行计算。
最后对结果进行评价，与标准值或参考值进行比较，评估样品的品质和安全性。
请注意，在进行脂肪酸值测定时，需要注意样品的保存和实验操作的准确性，以保证结果的可靠性和准确性。
同时，具体的操作步骤和试剂使用量等参数需要根据实验要求和实际情况进行调整。
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TSBA培养基是针对嗜氧菌(TSBA Media for Aerobes: TSBA6数据库)Trypticase Soy Broth Agar(TSBA)培养基是嗜氧菌标准的培养基。
利用以下的配方作为TSBA培养基。
供货商被建议在附加数据(Appendix A)中。
●混合在2升的锥形瓶●加热并搅拌至完全混合和琼脂(Agar)完全溶解●在温度121度及15psi下高压灭菌15分钟注意事项：不可过度加热培养基，使用高压灭菌器须有温度及时间的设定装置。
●在水浴中冷却至60度●加20-25 ml在溶解的琼脂(Agar)分装至无菌100 x 15mm直径的培养皿中，琼脂须有2.5-3.2mm深。
●允许琼脂在室温下凝固，但如果培养基想储存一段时间，必须在24小时内包装在无菌装置中。
它们可以保存在冷藏中直到使用。
注意事项——关于商业化已备好的TSBA培养基：TSBA可以从BBL购买，但需要指定货号，见附加数据(Appendix A)。
使用其它供应商提供的TSBA培养基可能会导致结果不一致，用户需要用ATCC菌株验证培养基是否效果相当。
试剂的准备 (Reagent Preparation)四种试剂要求是皂化细胞，脂化，萃取和基本洗涤脂肪酸的萃取物。
试剂应准备在干净，棕色及可标示一公升的瓶子。
放置一个Teflon-coated搅动台在每个瓶子上去添加在混合时。
只有Teflon和玻璃可以接触到试剂。
瓶子可以重新使用不须要重新浸润。
自动分注的增加备置速度但是必须准备和确定适当的操作在每批样品使用前。
确认分注试剂使用分注试剂在有刻度的量筒以达到校正效果。
以下的配方准备试剂约够300个样品或许可以在先前调整以够配合实验室的样品量，试剂准备用VPI Anaerobe Method 和数据库在Appendix B 中。
注意事项: 试剂1和4是腐蚀性和试剂2是酸性的全程配戴安全眼镜及手套，hexane 及methyl-tert-butyl ether (MTBE)在试剂3是可燃性的。
熄灭所有的火焰或热源在使用前操作在一个化学性的抽气风盖之下。
试剂1-皂化试剂 (Ragent 1: Saponification Reagent)●混合水和methanol 加入NaoH小球到溶剂中同时搅拌至锭剂完全溶解试剂2-甲基化试剂 (Reagent 2: Methylation Reagent)●加酸液至methanol中搅拌注意事项: 盐酸(Hydrochloric Acid)必须有保证浓缩。
只有盐酸运送在玻璃瓶中是被允许的，和你的供给商讨论包装的信息，请参考供给的建议在Appendix A如果6.00N HCI无法取得资询你的制造商标示浓度在那批号上确认最终6.00N的溶液滴定对比一个标准基础溶液。
试剂3-萃取溶剂 (Reagent 3: Extraction Solvent)●加入MTBE 在hexane 中并搅拌均匀试剂4-碱洗涤 (Reagent 4: Base Wash)●加入NaOH在水中同时搅拌至完全溶解额外的试剂 (Additional Reagents)●Saturated NaCl:溶解40g 的ACS NaCl 在100ml的去离子水中试剂的保存及有效期限 (Reagent Storage and Shelf Life)建议每30天泡制新的试剂。
可在瓶中保存在室温下使用Teflon-lined盖子。
储存移吸管在干净的容器中。
所有试剂必须标示完全包括配制日期和过期日为一个月，纯净的试剂必须确认在准备试剂控制的空白对照组(过程不加任何组织物)在每次跑样品时。
但不使用时，移开移吸管从试剂 1 (皂化试剂)瓶和利用打气的方式润丝清洁，利用去离子水去预防抓住活塞盖上试剂瓶用一个干净的Teflon-lined 螺旋盖。
试剂3，萃取的溶剂是可燃性的和必须储在良好的化学性的抽气风盖之下或溶剂排气柜。
准备萃取: 5个基本步骤(Preparing Extracts: Five Basic steps):每个样品放在单一试管中经过萃取的过程，每批可准备50个样品以增加方便性。
萃取过程中的每个过程都摘要显示在图2-4。
1 获菌(Harvesting)四区画线方法是被设计为稀释接种所以此四区会维持良好的分离菌落去提供操作人员判别是否为纯化菌落。
菌落必须获菌从大都稀释的区域表现汇合成长 (late log期)单独的条纹轴。
获菌这些区域典型的区块有大多取稳定的脂肪酸成份来自于接种曾被只够的稀释去引起在充足的成长的菌落不需限制的营养补给。
最佳的获菌的区域在第三区。
注意事项: 最佳的获菌区域为第三区。
成长较慢的微生物也许需要增加每次利用接种环在以下的四区划线技术通过二次增加为四至六次。
也许也可利用取第二区的微生物。
如果从培养皿中正确的区域取出微生物但会引起极差的数据库吻合，从第三区取出的微生物是最佳的；然而，如果较须生长的微生物也可从第1及2区取出。
从培养皿中取出要培养的微生物，轻括培养皿的表面利用无菌4mm接种环。
当轻微的转动接种环利用前后移动取出菌落。
一个堆积4mm接种环(约 40mg)湿重的菌落充足的原料的过程。
有些培养将不会粘着良好在金属的接种环。
塑料的接种环，Pasteur pipette融解在小的接种环，或较小直径的白线环可以用来获菌这样的培养。
确信维持相同份量的微生物相同于堆积4mm接种环提供的。
可以经由显具的总区域计数在最终的报告中或太少量的操作微生物会被判定出。
注意事项: 在下一个步骤执行前确认盖子必须完成吻合试管。
●放入接种环夹带者菌体进入一个干净，干燥13mmx100mm有螺旋盖的培养试管。
抹拭菌种脱离接种环在内底部的表面约在培养管底部约10mm的地方。
移开及无菌接种环。
●如果未做请确认培养管中有标示萃取的号码(从Extriction Log Sheet)一致性的获菌培养皿。
利用实验专用的笔直接写在玻璃上。
如果足够的先前清洁，培养管可以再使用获得微生物从每个培养皿中在每批皂化的步骤之前。
2 皂化(Saponification)强烈的甲醇基础件随着加热杀菌及溶解细菌。
脂肪酸将切割从细胞的脂质和改变到它们的钠盐。
注意事项: 利用沸腾或循环的水浴。
加热板或其它加热的方式意指不用适当的加热的转移移和温度控制在此步骤.。
图2-7-皂化步骤●注入1.0±0.1ml的试剂1，以甲醇为基础加入此次所有的样品。
●锁紧每个试管利用一个干净Telfon-lined螺旋盖子。
●震荡试管5-10秒。
●此批的所有样品试管在试管架上放入沸水或循环水石95-100℃的水浴中。
注意事项: 加热已锁紧的试管会产生压力划伤或裂缝玻璃制品能够破裂。
建议加热时利用化学安全盖或利用塑料盾。
全程穿戴安全护目镜。
●五分钟之后，从沸腾的水中移开试管并轻微的冷却它不要打开盖子，震荡每支试管5-10秒再放试管回水浴中。
●确认试管漏损,此刻是否有气泡在试管中升起为证据,再栓紧有漏的试管的盖子，如果继续发泡，样品必须在室温下回到室温的温度然后转移到新的培养试管。
●继续加热这些试管在水浴中增长到25分钟。
●皂化在水浴中总共约30分钟以后，移开和放置试管架在冷却轻拍平底去冷却。
冰水是不被建议使用的。
3 甲基化(Methylation)甲基化转换脂肪酸(as sodium salts)成甲基脂脂肪酸(fatty acid methyl esters),以增加脂肪酸的挥发性以供GC分析利用。
图2-8-甲基化步骤●开盖加入Reagent 2，2.0±0.1ml为甲基化试剂，注入每个试管。
●栓紧盖子震荡液体5-10秒。
因为过量试剂，颗粒促使加快(salt)也许含形成。
继续前进必须跟随：●水浴加热试管80℃, 10分钟。
●移开且快速冷却至室温利用一槽冷水龙头水不建议使用冰水，摇晃试管促成至冷却的过程。
注意事项:超过时间和温度在此步骤期间可以降低环丙烷抑制成份，可以变更脂肪酸的描绘和被取名的微生物。
4 萃取(Extraction)甲基脂脂肪酸移出从酸性似水部份和转移到一个有机的部份伴随着液体的萃取过程。
注意事项: Hexanel/MTBE是可燃的。
熄灭所有可燃物和当此些溶剂(solvents)为燃烧来源。
图2-9-萃取步骤●加入1.25±0.1ml 的试剂3-萃取溶剂在每个试管中。
●盖紧盖子，放此批的试管在一个实验室的旋转器及温和混合旋转10分钟。
●打开管盖，利用干净的Pasteur Pipette取出每个样品的移开及丢弃似水(下面)部位。
5. 基本洗涤(Base Wash)一种稀释基础的溶液添加到样品的前处理管中去移去自由的脂肪酸和剩余试剂从有机的萃取中。
剩余试剂将会损坏色谱分析的系统，会引起在末尾和损失氢气甲基脂脂肪酸(hydroxy fatty acid methyl esters)。
图2-10-基本洗涤步骤●加入3.0±0.21ml试剂4，基本洗涤至每个试管。
●栓紧盖子和温和地震荡试管利用旋转的方式5分钟。
●短暂约三分钟的离心在2000 rpm被建议。
当乳状液被呈现出使用两层液面的接口更清楚。
注意事项: 检试萃取试管和水温在加入试剂前。
选择地:少数滴的标准ACS等级NaCl/水溶液可添加在试管中以增加切断乳剂。
握着试管置垂直状和震荡它快速地介于在两手掌间，并且允许它停留数分钟。
萃取物移至样品小瓶(Transfer of Extract to Sample Vial)●标示样品小瓶以供萃取鉴定。
操作人员必须使用添加数目或部份的信息来自于”SampleID” 区域中来自于萃取记录单(Extraction Log Sheet)独一的协助样品瓶登入和在萃取记录单相同。
注意事项: 螺旋盖子的样品小瓶也可使用或可容易的来自于实验室供给的公司。
利用实验室专用笔去标示样品小瓶胶带标示将不可靠。
因此在样品瓶和也许操作干扰自动液体采样器瓶子夹子。
●打开每个试管的盖子，利用干净的Pasteur pipette在每个样品中，移出下层有机体约2/3从每支试管中移到干净的GC样品小瓶。
两层的液面有时会不易看见，必须小心不可取出任何似水部份(下面)部份进入自动的样品小瓶。
●定型盖子在样品小瓶上。
●确认盖子紧密在瓶上试子转动盖子当握着此小瓶。
必须闪避出粗糙扭转要求小的上方螺旋瓶子，如果太松，调整盖子加盖器具(Stop screw in the handle)和重新定型样品小瓶。
当所有的样品萃取液移至样品小瓶中，操作人员必须已经输入自动采样及开始执行样品下一章将会讨论此点。
延迟样品前置处理(Delay During Sample Preparation)理想中，样品的过程必须持续执行非中断当菌种被获菌后。
如果有必要延迟样品处理的步骤，有几个步骤是当样品可以停在那引发较少的在分析脂肪酸的影响。