《生物制药技术》实验指导-实验三、四
《生物制药技术》实验指导-实验二
《生物制药技术》实验指导-实验二
《生物制药技术》实验指导
实验二金霉素链霉菌的定向发酵（验证型）
实验目的：
1、学习和掌握无菌操作技术。
2、掌握定向发酵四环素的原理。
实验原理：
定向发酵是指通过改变培养基组分(加入某些物质)改变微生物代谢途径，使发酵按主观要求产生较多的产物。
金霉素、四环素和土霉素，它们的化学结构极为相似：
R1 R2
金霉素Cl H
土霉素H OH
四环素H H
金霉菌原是产生金霉素（Chlortetracycline）的菌种，但因金霉素比四环素只多一个氯离子，所以只要在发酵液中加入某些物质，阻止氯离子进入四环素分子，从而使菌种产生较多的四环素。另外，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强；当温度超过35℃时则只合成四环素。
本实验中，利用溴离子在生物合成过程中对氯离子有竞争性抑制剂作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即M—促进剂，分子式：C7H5NS2，通常作为橡胶硫化促进剂)抑制氯化酶的作用，从而增加四环素的产量。
材料、试剂和器材：
金霉素链霉菌：购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（菌种保藏号：CGMCC4.1043；订单号20111133 550元）。
超净工作台、摇床（250ml、500ml）
酒精灯、酒精棉球、工业酒精、打火机、接种铲、移液枪、剪刀
实验步骤：
前期准备工作：配制孢子培养基
麸皮36.0 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2HPO4 3 g，琼脂15～20 g，定容至1L，pH 7。
1、制备斜面孢子：将保藏的菌种的比例接种于液体培养基中（不加琼脂的斜面培养基），28℃下200 r/min振荡培养，将活化1d后的金霉素链霉菌种接入孢子培养基，28℃培养5～7天，待孢子长成灰色，于4℃冰箱中保藏。
《生物制药技术》实验五
《生物制药技术》实验指导
实验五、四环素生物效价测定（选作）
一、实验目的
1、了解杯碟法测定抗生素生物效价的基本原理。
2、掌握杯碟法测量抗生素效价的方法。
二、实验原理
衡量发酵液中抗生素的含量称效价(titer或titre)，效价是评价抗生素效能的标准，也是衡量抗生素活性成分含量的尺度，它代表抗生素对微生物的抗菌效力，人们以1µg金霉素或四环素标准品为1个单位，0.6µg青霉素G钠盐为1个单位。抗生素的生物测定方法有三大类：稀释法、比浊法以及扩散法。扩散法中杯碟法(cup and plate method)或称管碟法(tube and plate method) 一种是常用的方法。它是将已知浓度的标准抗生素溶液与未知浓度的样品溶液分别加到牛津杯(Oxford cup，一种标准的不锈钢小管)中，置于含有敏感试验菌的琼脂平板上进行扩散渗透，一定时间后抗生素在菌层培养基形成浓度由高到低的自然梯度，当抗生素浓度达到或高于MIC（最低抑制浓度）时，试验菌就被抑制而不能繁殖，从而呈现透明的抑菌圈。测量出抑菌圈的大小，以计算抗生素的浓度。在一定的浓度范围内，抗生素总量的对数值与抑菌圈直径的平方成线性关系，且在一定的试验条件下，可直接利用抑菌圈的直径近似地代替其平方，因而从样品的抑菌圈直径可在标准曲线上求得样品的生物效价。将已知效价的金霉素标准液先制成标准曲线，根据被检品溶液的抑菌圈的大小，就可从标准曲线上查出效价的对数值，从中计算出相应效价，再乘以稀释倍数，即计算出待测样品中抗生素的效价。因杯碟法是利用抑制敏感细菌的直接测定方法，所以符合临床使用的实际情况，而且灵敏度很高，不需要特殊的设备，故多被采用。但此法也有缺点，即操作步骤多，培养时间长，获得结果慢。尽管如此，由于它的独特优点，仍然被世界各国所公认，作为国际通用的方法被列入各国药典中。
生物制药技术实验中的动物试验操作指南
生物制药技术实验中的动物试验操作指南
在生物制药技术的研究和开发过程中，动物试验是不可或缺的一环。动物试验可以提供关于新药安全性、疗效和副作用的重要信息，为药物研发提供科学依据。然而，动物试验必须在合乎伦理和道德规范的前提下进行，以保证动物的福利和尊严。本文将为您提供生物制药技术实验中的动物试验操作指南，以确保您的实验能够合规进行。
一、实验前准备
在进行动物试验之前，首先需要制定详细的试验方案和实验操作程序，并获得相关的伦理审批。确保试验有明确的目的和预期结果，并制定相应的实验步骤和数据收集方法。
同时，为了确保试验的准确性和可靠性，需要选择合适的动物种类和数量，并提供适当的饲养和养护环境。动物饲养的环境应具备以下条件：温度适宜、湿度控制、通风良好、噪音和干扰最小化。
二、试验操作步骤
1. 动物采集和准备
在试验开始前，需要选择合适的动物品系和年龄，并确保动物的健康状况良好。动物的采集和准备应遵循以下步骤：
- 从可靠的供应商获得动物，确保他们遵循动物保护法规；
- 调查动物的饲养历史和健康状况；
- 对动物进行身体检查，确保它们没有任何潜在疾病或异常。
2. 注射和给药
注射和给药是动物试验中常见的操作。在进行注射和给药前，需要遵循以下步骤：
- 确定注射或给药的途径和剂量；
- 使用无菌器械和药品，以减少感染的风险；
- 确保注射或给药操作准确，避免对动物造成过度伤害。
3. 采集样本和观察指标
动物试验的目的是收集关于药物效果和安全性的数据。为了确保数据的准确性和可比性，需要注意以下操作：
- 采集样本时，应按照规定的时间点和方法进行，并记录好样本信息；
《生物制药工程》实验指导书
实验一甲壳质、壳聚糖的制备
【实验目的】
了解制备甲壳质、壳聚糖的工艺流程；
掌握甲壳质的提取、制备原理及壳聚糖的检测方法。
【实验原理】
甲壳质存在于甲壳类动物(如虾、蟹)的外壳，昆虫表皮，软体动物(如贝类、乌贼)的器官、菌类(如菇类、霉菌)的细胞壁。自然界每年合成量高达100亿吨，仅次于植物纤维素。甲壳质是1823年法国科学家Odier首次从蟹壳中提取出来的，由于甲壳质的性质非常稳定，溶解性很差，限制了它的应用。经一个多世纪世界各地科学家对它在结构上进行改良、修饰，并开发应用研究，它的衍生物壳聚糖在工业、农业、畜产、渔业、食品、化妆品及医药行业上得到广泛应用，尤其是近十多年来，壳聚糖的动物试验及临床观察得到科学家们的肯定，誉为人类第六生活要素(蛋白质、脂肪、维生素、矿物质和壳聚糖)。是一种功能性食品。
从虾壳提取甲壳质，工艺主要是将虾壳的成份分离，虾壳中含有无机盐(主要为碳酸钙)蛋白质和甲壳质。利用碳酸钙能溶于盐酸的机理，将其离析。蛋白质在碱性条件下能被水解生成短肽及氨基酸，它们能溶于水，与甲壳质分离。本实验首先采用盐酸浸泡虾壳除去钙质，接着利用氢氧化钠煮沸除去蛋白，之后水洗；用高锰酸钾与硝酸氧化脱色干燥得白色制品为甲壳质。
甲壳质在碱性条件下脱去乙酰基，生成聚胺糖。工业上很难100％脱去乙酰基，所以工业制得的实际上是甲壳质和聚葡胺糖两个结构单元的结合，称为壳聚糖。壳聚糖结构中有胺基(－NH2)，具碱性，因此，它能溶于很多酸，如硫酸、盐酸、胃酸等，可以用游离氨基含量的来检测乙酰基的脱去程度。
《生物制药技术》实验
《生物制药技术》实验指导
实验一金霉素链霉菌培养基的制备（验证型）
实验目的：
1、学会培养基的配制
2、掌握灭菌方法。
实验原理：
金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦称“金色链霉菌”，放线菌门(Actinobacteria)，放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链霉菌属(Streptomyces)。在固体培养基上产生金色色素，故名。其菌落为草帽型, 菌落直径一般为3～5毫米, 表面较平坦, 中间有隆起。菌落开始为白色，长孢子后变青色。在显微镜下可以看到短杆状的菌丝。抗菌素工业上用以生产金霉素。
放线菌是一类介于细菌与真菌之间的单细胞微生物。放线菌在土壤中分布最多，大多数生活在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。多数情况下，泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。放线菌大都好氧，属于化能异养，菌丝纤细，分枝，常从一个中心向周围辐射生长。因其生长具辐射状，故名放线菌。放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子，有些种类甚至形成孢子囊，因而曾被误认是真菌。但其菌落较小而致密，不易挑取。不少菌种在医药、农业和工业上广泛应用，可产生抗菌素，现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4 000多种，其中，有50多种抗生素已经广泛地得到应用，如链霉素、红霉素、土霉素、四环素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于临床治疗人的多种疾病；有些可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶；有的用于农业生产，如灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等。
生物制药技术试验
上离子交换柱
中ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ滤液
吸附
1 mol/L H2SO4
饱和树脂
解吸
解吸液
加 NaOH 及 KMnO4 中和、氧化、过滤
中和氧化滤液
加氨水沉淀 离心甩干，洗去氨
多粘菌素游离碱
加 6 mol/L H2SO4,调 pH 6.0~6.5, 溶解
喷雾干燥
多粘菌素 E 硫酸盐
白色粉末（成品）
衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。 生物效价测定有稀释法、比浊法、扩散法三大类。管碟法是扩散法的一种。本实验采用管碟法测定抗 生素的效价。
生物制药技术实验
图 5－2 效价测定示意图 A 800 u/mL；B．1000 u/mL；C.1200u/mL；D. 样品稀释液 按 2～3 个双碟中 1000 u/mL 抑菌圈直径的平均值校正抑菌圈直径。例如：标准状态下 l 000 u／ mL 多粘菌素 E 抑菌圈直径为 18.00 mm，若我们所测 B 管(1 000 u/mL)抑菌圈直径总平均值为 17.8mm， 校正值为 18.00 mm-17.80 mm＝+0.20mm。则双碟中所有钢管浓度的抑菌圈直径也应加上 0.20 mm，即 得校正后的数值。若我们所测 B 管(1 000 u/mL)抑菌直径总平均值为 18.20 mm，校正值为 18.00 mm-18.20 mm＝-0.20 mm，此组某浓度的抑菌圈直径也应加上-0.20 mm，即得校正后的数值。 (6) 标准曲线的绘制 以各浓度的抑菌圈直径的校正值平方为横坐标，以标准品浓度(u/mL)的对数 值为纵坐标，纸上绘制标准曲线。 (7) 发酵样品效价汁算 以样品稀释液抑菌圈直径的校正值查标准曲线，得出相应的效价单位，再 乘以稀释倍数，即得发酵液的效价单位。
生物制药技术-第三章-动物细胞工程制药(1,2,3,4,5)
• 核酸是细胞中另一类生物大分子，它在细胞 遗传和代谢方面起着重要的作用，也是生命 的主要物质基础之一。核酸主要由糖(五碳 糖——核糖)、磷酸和含氮碱基(嘌呤或嘧啶) 所组成。核酸分脱氧核糖核酸(DNA)和核糖 核酸（RNA)两类，区别在于所含的五碳糖不 同，前者是D-2 -脱氧核糖，后者是D-核糖。 一般来说核酸中的碱基有4种:腺嘌呤，鸟嘌 呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶(存在于DNA内)或尿 嘧啶(存在RNA内)。
第二节 动物细胞的形态和生理特性
• 一、动物细胞的形态 • 动物细胞的结构较原核细胞复杂得多(图3一1)，而且已不 是靠一个细胞包办一切生理活 动，各种细胞都有明确的 分工。为了适应其功能的需要，细胞的形态也有了相应的 变化，我们称这种变化为分化(或称特化)。如肌肉细胞成 纺锤形，可起到收缩伸展的作用；神经细胞具有很长的分 支，很多的纤维，以便接受和传递刺激；红细胞呈圆盘状， 使与外界的接触面相对地增大，有利于和周围环境交换气 体和在血管内流动；而上皮细胞由于要覆盖于表面，常常 相互挤压成不规 则的立方形、锤形。然而当细胞离体培 养时这些分化的形态经常会发生变化。我们通常将离体培 养的细胞分为两类：贴壁依赖型和贴壁非依赖型，前者可 简称为贴壁细胞，后者可简称为悬浮细胞。
2.细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象
• 除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需 在一定的基质(如玻漓，塑料等)上贴附，伸展后才能生长增殖。 细胞贴附的机制目前还不十分清楚，除电荷的作用、钙镁离 子的 作用外，还与许多贴附因子有关，如胶原、纤维结合蛋 白等。但在无血清培养基内即使加入这些因子，有些细胞仍 不能贴附生长。这也是当前为什么很少有适用于贴壁细胞使 用的无血清培养基问世的原因。 • 当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即每个细胞与 其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖。此时若能保持 充足的营养，细胞仍可存活相当一段时间，但细胞密度不再 增加，所以该现象又被称为接触抑制或密度依赖抑制现象。 一旦细胞转化为异倍体后，该现象消失，细胞可多层生长， 细胞密度也可大大增加。
《生物制药技术》实验指导-实验三、四
《生物制药技术》实验指导
实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型）
实验目的：
掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。
实验原理：
层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。
分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快（阻力小）。
生物技术制药综合实验报告
生物技术制药实验报告
人表皮生长因子（hEGF）在大肠杆菌中的
表达与纯化
生物与制药工程学院
罗飞
2016年7月2日
目录
第一节引言 (4)
1.1表皮生长因子(EGF)概述 (4)
1.2 表皮生长因子(EGF)的结构与性质 (4)
1.3 EGF的生物学效应及应用 (5)
1.4 本实验课程设计的目的与内容 (6)
第二节EGF基因的合成与转化表达 (7)
2.1.实验原理 (7)
2.2实验材料与方法 (8)
2.2.1 试剂材料及试剂 (8)
2.2.2 仪器设备 (8)
2.3 实验方法 (9)
2.3.1 试剂及培养基配制方法 (9)
第三节、实验前的准备 (9)
3.1目的基因hEGF的设计与合成 (9)
3.2载体选择 (11)
3.2.1载体选择主要考虑下述3点： (11)
3.3酶切位点设计 (12)
3.3.1载体的结构 (12)
3.2.2酶切位点设计注意以下 (13)
3.2.3 酶切位点的确定 (13)
3.3 引物设计 (14)
3.3.1 PCR引物设计的基本原则 (14)
3.3.2 引物设计 (15)
第四节、实验篇 (16)
4.1整体实验过程 (16)
4.1.1实验整体流程： (16)
4.1.2 简化后的并行流程 (16)
4.2、小组结果展示 (17)
4.2.1大肠杆菌转化实验结果 (17)
4.2.2 XL10质粒电泳结果显示 (18)
4.2.3 单酶切实验结果显示 (18)
4.2.4 PCR结果显示 (19)
4.2.5 SDS-page 电泳结果展示 (20)
4.3、个人负责实验模块 (20)
4.3.1 提取重组质粒 (20)
生物技术制药实验的指导
生物技术制药实验指导
王金华
主编
苏华伟
西南林学院资源学院
生物技术教研室
二OO三年十二月
目录
序言．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．ii
一、生物药物原料的选择、处理与保存．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．1
二、包埋法制备固定化细胞．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3
三、吸附层析提取鸟巢菌素．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5
四、液相层析分离、纯化蛋白质类药物．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7
五、半成品药物质量检测———蛋白质含量测定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10
六、蛋白质药物相对分子量测定——SDS-PAGE．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13
七、蛋白质药物纯度检测——SDS-PAGE．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18
八、抗体诊断——玻片直接凝集法检测血型．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．20
九、单克隆抗体的制备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．22
十、植物药物制备技术实验．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．25 十一、大蒜细胞SOD的提取与分离．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．30 十二、动物药物制备实验————卵磷脂制备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．34 十三、设计实验分——泌抗生素的微生物菌种的选育……………………附录．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．37
生物制药实验操作作业指导书
生物制药实验操作作业指导书
一、实验目的
生物制药实验操作作业旨在使学生掌握生物制药相关实验操作技能，了解生物制药的基本原理和实践应用。
二、实验材料和仪器
1. 材料：
- 细菌培养基
- 酵母
- 细胞培养基
- 抗生素
- 溶液和缓冲液
- 蛋白质纯化试剂盒
- 电泳试剂
- 试剂盒等
2. 仪器设备：
- 培养皿和培养皿架
- 培养箱
- 离心机
- 超声波处理仪
- 十分摄氏计
- 离子交换层析仪
- 高效液相色谱仪（HPLC）
- 电泳仪等
三、实验操作步骤
1. 细菌培养实验
a. 准备培养基：按照实验要求配制细菌培养基。
b. 接种细菌：使用无菌技术将待测的细菌接种到培养基中。
c. 培养细菌：将接种好的培养皿放入培养箱中，设置适当的温度和培养时间。
d. 观察细菌生长：根据培养后的结果进行观察和记录。
2. 酵母发酵实验
a. 准备培养基：按照实验要求配制酵母培养基。
b. 接种酵母：使用无菌技术将待测的酵母接种到培养基中。
c. 培养酵母：将接种好的培养皿放入培养箱中，设置适当的温度和培养时间。
d. 观察酵母发酵：根据培养后的结果进行观察和记录。
3. 细胞培养实验
a. 准备培养基：按照实验要求配制细胞培养基。
b. 接种细胞：使用无菌技术将待测的细胞接种到培养基中。
c. 培养细胞：将接种好的培养皿放入培养箱中，设置适当的温度、湿度和培养时间。
d. 观察细胞生长：根据培养后的结果进行观察和记录。
4. 抗生素敏感性实验
a. 准备培养基：按照实验要求配制含有不同浓度抗生素的培养基。
b. 接种细菌：使用无菌技术将待测的细菌接种到培养基中。
生物制药学实验指导
实验一细胞色素C的制备及测定
一、实验目的
1．学习细胞色素C的理化性质及其生物学功能。
2．掌握制备细胞色素C的原理。
3．掌握制备细胞色素C的操作技术。
二、实验原理
细胞色素C是呼吸链的一个重要组成成份。是一种含铁卟啉基团的蛋白质，在线粒体呼吸链上位于细胞色素b和细胞色素aa3之间，细胞色素C的作用是在生物氧化过程中传递电子。
细胞色素C分子中含赖氨酸较高，所以等电点偏碱，为pH 10.8，分子量为12000～13000道尔顿。它易溶于水及酸性溶液，且较稳定，不易变性，组织破碎后，用酸性水溶液即能从细胞中浸提出来。细胞色素C分为氧化型和还原型两种，因为还原型较稳定并易于保存，一般都将细胞色素C制成还原型的，氧化型细胞色素C在408nm、530nm有最大吸收峰，还原型细胞色素C的最大吸收峰为415nm、520nm和550nm，这一特性可用于细胞色素C 的含量测定。
由于细胞色素C在心肌组织和酵母中含量丰富，常以此为材料进行分离制备。本实验以猪心为材料，经过酸溶液提取，人造沸石吸附，硫酸铵溶液洗脱，三氯醋酸沉淀等步骤制备细胞色素C，并测定其含量。
三、实验材料
1. 实验器材
绞肉机；电磁搅拌器；离心机；72l型分光光度计；玻璃柱(2.5×30cm)；三角瓶；试管（多支，25 mL）烧杯(1000、500mL)；量筒；移液管；玻璃漏斗和纱布；玻璃棒；透析袋。
2. 实验试剂
⑴ 2M H2SO4溶液；1M NH4OH溶液；固体硫酸铵
⑵ 25％硫酸铵溶液: 100mL蒸馏水中含25克硫酸铵，约相当于25℃时40％的饱和度
生物制药技术的实验操作步骤
生物制药技术的实验操作步骤
生物制药技术是一种利用生物材料制造药物的方法，它涵盖了从药物研究到生产的整个过程。而在这个过程中，实验操作步骤是确保药物质量和效果的关键。本文将按照任务要求，为你详细介绍生物制药技术的实验操作步骤，并指导你如何进行生物制药实验。
一、实验前的准备工作
1. 确定实验目的和研究的药物/蛋白质。
2. 准备实验所需的试剂和设备，并确保其质量符合要求。
3. 设计实验方案和实验步骤。
4. 清洗和消毒实验台和设备，确保无菌环境。
5. 做好安全防护工作，佩戴手套和口罩等个人防护装备。
二、细胞培养实验
1. 准备培养基：根据实验方案选择适当的培养基，加入所需的生长因子和其他添加物。
2. 做好细胞培养物的维持和传代工作，确保细胞的生长和健康状态。
3. 收集细胞进行实验前处理，如细胞冻存、质粒转染等。
4. 根据实验要求，进行适当的实验处理，如添加药物、诱导剂、激素等。
5. 取样进行实验分析，如细胞计数、蛋白质表达分析、细胞周期分析等。
三、蛋白质分离与纯化实验
1. 提取蛋白质：根据实验需求，选择适当的细胞裂解方法和提取缓冲液，并进行细胞裂解。
2. 蛋白质分离：使用凝胶电泳方法（如SDS-PAGE）将目标蛋白质从样品中分离出来。
3. 蛋白质定量：使用蛋白质定量方法（如BCA法、Lowry法）确定蛋白质的浓度。
4. 蛋白质纯化：根据实验需求，选择适当的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析等，将目标蛋白质从混合物中纯化出来。
5. 确定纯化的蛋白质纯度：使用相关方法进行纯度检测，如蛋白质凝胶电泳、Western blot等。
生物技术制药实验指导
目录
实验一植酸钙镁的制备 (2)
实验二溶菌酶结晶的制备及活力测定 (5)
实验三固定化细胞生产L-天冬氨酸 (8)
实验一植酸钙镁的制备
植酸钙镁又称菲汀， 是种良好的营养药，具有促进新陈代谢、增进食欲和营养、助发育等作用。适用于治疗神经系统各种疾病、血管张力减退、癔病、神经衰弱、佝偻病、贫血和结核病等。 一、化学结构和性质
化学名称为肌醇六磷酸酯钙镁盐，呈白色粉末，无臭，溶于盐酸、硝酸和硫酸，不溶于碱水。植酸钙镁在高等植物中含量很丰富，玉米浸泡的水液可作为提取的原料，是生产玉米淀粉的副产品。米糖和麦麸也可作为原料。 二、提取方法
1、以玉米浸泡液为原料的提取法 （1）技术路线
（2）工艺过程
取净化玉米投入浸泡罐内，用0.3%亚硫酸溶液在52~53℃浸泡70小时,放出浸液，搅拌下加入8Be 的石灰乳，中和至pH5.4~5.8,静置1h,除去上层清液,混浊液压滤,
滤饼在60~80℃烘干。对玉米质量计，总收率0.2~0.3%。
2、以植酸钙为原料的提取法 （1）技术路线
（2）工艺过程
按m （工业植酸钙）：V （浓盐酸）：V （氢氧化钠）：m （活性炭）：V （水）=1:1:0.625:0.04:8的配料比，投料取工业植酸钙溶于等量的浓盐酸中，加热使溶解，加入活性炭，加水稀释，过滤。滤液在搅拌下，加入120g/L(12%氢氧化钠)溶液中和至pH5.1，析出沉淀，静置，检查pH ，过滤，收集滤饼用水洗至氯离子合格为止，甩干，搓成小条状，通风干燥，得植酸钙镁。对植酸钙质量计，总收率50%以上。
3、以麸皮为原料的提取法
生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)
第二节 墓因工程药物生产的过程
基因工程技术就是将所要重组对
象的日的基因插入载体、拼接、 转入新的宿主细胞，构建成工程 菌（或细胞），实现遗传物质的 重新组合，并使目的基因在工程 菌内进行复制和表达的技术。
基因工程药物制造的主要步骤是:
目的基因的克隆，构建DNA重组 体，构建工程菌，目的基因的表 达，外源基因表达产物的分离纯 化，产品的检验等 (图2 -1)。本章 将重点介绍由基因工程菌生产的 基因工程药物。
下游阶段是将实验室成果产业化、商品化，它主要 包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物 反应器的研制，高效分离介质及装臵的开发，分离 纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传 感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机 的优化控制等。工程菌的发酵工艺不同于传统的抗 生素和氨基酸发酵，需要对影响目的基因表达的因 素进行分析，对各种影响因素进行优化，建立适于 目的基因高效表达的发酵工艺，以便获得较高产量 的目的基因表达产物。为了获得合格的目的产物， 必须建立起一系列相应的分离纯化、质量控制、产 品保存等技术。
Richard Young和Ronald Davis设计的λgtl0和 λgtl1 是噬菌体克隆载体，用于构建cDNA文库，它们 一方面有较高的克隆效率，只需少量DNA便十 分有效地产生许多克隆，每纳克cDNA可产生 5000个克隆，另方面可容纳较大相对分子质量 的外源DNA片段。由于噬菌斑的筛选和操作较 筛选细菌菌落在技术上更方便，因此这些载体 在构建文库时优于质粒载体pBR322。在合适的 宿主中，λgtl0载体对于未携带cDNA的噬菌体的 裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA 插 入到λgtl0可使噬菌体阻遏物基因(c 1)失活。
生物技术制药_03-动物细胞工程制药-9.25
动物细胞工程制药
动物细胞生长的三个阶段
原代培养期（primary culture）
从机体取得材料（细胞、组织或器官），接种培养到第一 次传代前的阶段 这一阶段细胞比较活跃，细胞多呈二倍体核型
传代培养期（passage culture）
在原代培养后期，将原代培养的细胞分离、稀释并接种到 新培养基上继续扩大培养的阶段 原代细胞一经传代后便称为细胞系 细胞增殖旺盛，维持二倍体核型，称为二倍体细胞系
动物细胞工程制药
动物细胞培养技术
动物细胞培养基和添加剂 —— 血清
血清的成分：没有完全明确
蛋白质：白蛋白、球蛋白、转运铁蛋白等
激素：主要是细胞因子类，如生长因子等
代谢物、营养物、无机盐 抑制物
血清营养丰富，极易染菌、染毒 血清批次之间性质有差别，质量不稳定 成本高昂，且对产物分离有一定影响
动物细胞工程制药
动物细胞培养的基本方法
2、成体组织------如肝脏、脾脏、心脏、肾脏、白血球 等等，由于其细胞之间具有较强的粘合作用，培养难 度较大。
3、肿瘤组织-----细胞增殖能力强，可在体外长期培养 和繁殖，并且可以采用微生物培养方法进行悬浮培养。
动物细胞工程制药
动物细胞培养的基本过程
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
《生物制药技术》实验指导
实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型）
实验目的：
掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。
实验原理：
层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。
分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快（阻力小）。
薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层色谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析后进行显色，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。
材料、试剂和器材：
仪器和设备：
玻璃层析缸；层析板（薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售）；吹风机；紫外投射仪；离心机（1.5ml转子）
试剂：
四环素、金霉素标准品（1000U/ml）用0.1 M盐酸溶解并稀释定容，4℃冰箱保存（可使用7天）。
展开剂：正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5) 2L。
草酸、氨水
其它物品：
1.5ml离心管、小烧杯、玻璃棒、毛细玻璃管或微量注射器、pH试纸（pH覆盖1.0～
2.0）（或酸度计）、饭盒（或大培养皿）、凡士林
实验步骤：
1．层析板处理
层析板105℃烘烤过夜，均匀喷上0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PH4.5)，于空气中晾干、备用。
2．点样
选取两种定向发酵液加草酸酸化至pH为1.5～2.0，取上清约l .2 ml于1.5ml离心管中，10000 rpm，5min，备用。在距层析板底边2.5~3 cm起始线上(用铅笔划线，做出点样点记号)，用毛细玻璃管在薄层层析板上点四环素标准品和金霉素标准品溶液3次，发酵液上清点8～10次，点样点不大于0.4cm，每次都要吹干后再点。（一般效价在1000u／ml以上点3次，500～1000u／ml点4次，200～500u／ml点5次）。剩余的发酵液上清于4℃冰箱保存。
3. 层析（展开）
用正丁醇：醋酸：水(4∶1∶5)的上相作展开剂。层析前需预先用展开剂预平衡层析缸，可在缸中倒入2cm高的展开剂，密闭，一般保持15－30分钟。然后将层析板置于盛有展开剂的层析缸中，在室温下展层6～8h（与温度有关）。封口不严可涂抹凡士林。
4．荧光显影
待溶剂前沿展至板的一半以上时将层析板取出，标出溶剂前沿，于通风橱中晾干，用氨水熏数秒钟后即可在紫外灯下显影，画出黄色斑点，分别算出R f值。（四环素标准品慢和金霉素标准品快）
无水四环素在波长365nm下显黄色荧光，根据与标准对照可定性测定。
注意事项：
因四环素能和钙盐形成不溶性化合物，故发酵液中的四环素浓度不高，预处理时通常用草酸将发酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四环素尽量溶解。
点样时必须注意勿损伤薄层表面。要控制好点样量，样品太少，斑点不清楚，难以观察，但样品量太多时往往出现斑点太大或拖尾现象。
若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。
作展开剂中极少量强极性溶剂(0.5％)或pH值的改变可显著改善拖尾现象。
实验四四环素的效价测定（综合型）
实验目的：
1、了解抗生素效价的表示方法
2、学习抗生素的测定方法
实验原理：
实验利用比色法测定四环素和金霉素的效价。效价(titer或titre)是评价抗生素效能的标准，它代表抗生素对微生物的抗菌效力，也是衡量发酵液中抗生素含量的尺度，人们以1µg 金霉素或四环素标准品为1个单位，0.6µg青霉素G钠盐为1个单位。
四环素和金霉素在酸性条件下，加热，可产生黄色的脱水金霉素和脱水四环素，其色度与含量成正比。
在碱性条件下，四环素较稳定，而金霉素则生成无色的异金霉素：
根据上述原理，可以在酸性条件下，利用比色法测定四环素、金霉素混合液的总效价；而四环素效价的测定可在碱性条件下，使金霉素生成无色的异金霉素，然后再在酸性条件下，使四环素生成黄色的脱水四环素，经比色测得四环素效价。总效价与四环素效价二者之差即为金霉素的效价。本实验只测定四环素的效价。
因四环素能和钙盐形成不溶性化合物，故发酵液中的四环素浓度不高，预处理时通常用草酸将发酵液酸化至pH＝1.5～2.0，使四环素尽量溶解。发酵液中，由于杂质的干扰，将影响比色的正确性，因此加入乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)作为螯合剂，掩饰金属离子的干扰，改变四环素脱水条件(降低酸度或延长加热时间)，可以减少杂质对比色反应的干扰。
材料、试剂和器材：
试剂：
EDTA lg／l00ml、NaOH 3mol／L、HCl 6mol／L、蒸馏水
盐酸四环素标准液: 精密称取盐酸四环素标准品0.0410 g 于烧杯中, 用适量蒸馏水(或0.1mol／L的盐酸溶解)溶解, 转移至200 m l容量瓶中定容配成0.2 m g /m l的溶液。
器材：
分光光度计、玻璃比色池、水浴锅、电炉、不锈钢锅、擦镜纸、50ml容量瓶（或比色管）、大烧杯、移液枪、1mL枪头、洗耳球
实验步骤：
取上述保存的处理发酵液上清l ml (效价约为1000U／m1)于50ml容量瓶中，加入lml 浓度为lg／l00ml EDTA溶液，加蒸馏水9ml，再加入lml浓度为3mol／L的NaOH，在20~25℃